民豬與大白豬背最長肌能量代謝關(guān)鍵酶活性研究

李忠秋，劉春龍，吳賽輝，張冬杰，王文濤，何鑫淼，田 明，亓美玉，何海娟，劉 娣*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150086；2.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱 150081）

肌纖維是骨骼肌的基本結(jié)構(gòu)單位，肌纖維類型的不同具有不同的代謝特征，根據(jù)肌纖維中肌球蛋白重鏈（Myosin Hevay Chain，MyHC）亞型的不同，將肌纖維分為MyHC I、MyHC IIa、MyHC IIx 和MyHC IIb 4種類型，I 型屬于慢速氧化型，IIa 型屬于快速氧化型，IIb 型屬于快速酵解型，IIx 型屬于中間型，代謝特征介于IIa 型和IIb 型之間，氧化代謝能力按照I 型、IIa型、IIx 型、IIb 型依次降低型。骨骼肌能量代謝主要包括有氧代謝和無氧酵解，琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）和蘋果酸脫氫酶（Malate Dehy drogenase，MDH）可代表肌肉的氧化代謝能力，乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）的活性可反映細(xì)胞內(nèi)糖酵解的水平。研究發(fā)現(xiàn)，耐力訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)員肌肉中慢型肌含量增多，SDH 活性顯著提高；在測定大鼠膈肌中不同種肌纖維類型SDH 的活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，SDH 活性在I 型和IIa 型肌纖維中較高；在檢測人骨骼肌纖維SDH 活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)SDH 活性在I 型最高，IIa型次之，IIb 型活性最低。在檢測兔膈肌肌纖維亞型和代謝酶活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)MDH 活性增強(qiáng)與增加兔膈肌I型肌球蛋白的表達(dá)一致。在研究不同牛種肌纖維類型與酶活性差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)MDH 活性與I 型肌纖維比例呈正相關(guān)。在比較研究豚鼠的各種肌肉中LDH 的活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，比目魚?。↖ 型纖維含量較多）LDH 活性最低，白半膜肌和白股肌（IIb 型纖維含量較多）LDH 活性最高，紅股肌（IIa 型纖維含量較多）LDH 活性居中。

我國地方豬種的肌纖維類型組成與引進(jìn)商品豬種的肌纖維類型組成相比，地方豬種氧化型纖維含量較高，而酵解型纖維含量較低，如萊蕪豬與杜洛克豬相比，萊蕪豬氧化型纖維含量顯著高于杜洛克豬；成華豬、巴馬香豬、梅山豬、金華豬、二花臉豬與大白豬相比，其氧化型纖維含量均顯著高于大白豬。民豬是我國優(yōu)秀的地方品種，具有地方豬品種的優(yōu)良特性，氧化型纖維含量較高；大白豬是典型的引進(jìn)品種，酵解型纖維含量較高，而民豬與大白豬能量代謝關(guān)鍵酶活性的研究較少，本實(shí)驗(yàn)在檢測民豬和大白豬肌纖維類型組成差異的基礎(chǔ)上，采用比色法對(duì)民豬和大白豬骨骼肌能量代謝關(guān)鍵酶類活性進(jìn)行研究，從骨骼肌能量代謝水平分析民豬和大白豬肌纖維類型組成差異的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所民豬養(yǎng)殖基地，選擇民豬和大白豬各6 頭，體重95 kg 左右，公母各半，公豬已閹割。屠宰前，禁食24 h，不禁水。屠宰后迅速取1 g 左右背最長肌樣品（在第13、14 肋間），放入凍存管，投入液氮，帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆茫糜诩±w維類型和酶活性檢測。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌纖維類型組成測定

1.2.1.1 總RNA 的提取和cDNA 合成 總RNA 的提取按照TRLzol（AMBION）說明進(jìn)行，總RNA 的完整性檢測使用瓊脂糖凝膠電泳法，總RNA OD 值測定應(yīng)用分光光度計(jì)法，總RNA 濃度通過計(jì)算調(diào)整為1 μg/μL，分裝，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。

cDNA 合成按照cDNA 合成試劑盒（All-in-one First Strand cDNA Synthesis Kit,SEVEN）說明書要求進(jìn)行。合成體系為20 μL：RNA 6 μL、5×Master Mix 4 μL、DEPC-ddHO 10 μL。反應(yīng)條件為42℃15 min，短暫離心，冰上冷卻，-20℃冰箱保存。

1.2.1.2 引物的設(shè)計(jì)和合成 參照Park 等設(shè)計(jì)合成和引物用于熒光定量PCR，內(nèi)參為，引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1。

表1 引物信息

1.2.1.3 熒光定量PCR 按照熒光定量PCR 試劑盒（2×SYBR Green qPCR MasterMix,SEVEN）進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物（0.25 μmol/L）各0.5 μL，cDNA（0.2 μmol/L）0.5 μL，ddHO 8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min；95℃10 s，60℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)。以內(nèi)參基因進(jìn)行校正，目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2的方法來計(jì)算。

1.2.2 能量代謝關(guān)鍵酶類活性測定

1.2.2.1 蛋白定量測定 按照蛋白濃度測定試劑盒（南京建成蛋白定量試劑盒）說明書進(jìn)行樣品蛋白濃度測定。按照操作表2 進(jìn)行操作。計(jì)算公式：待測樣本蛋白濃度（g/L）=（測定OD 值-空白OD 值）/標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.563 g/L）。

表2 操作表格

1.2.2.2 SDH 測定 按照南京建成琥珀酸脫氫酶（SDH）測試盒說明進(jìn)行樣品中SDH 活性檢測。計(jì)算公式為：SDH 活性（U/mgprot）=（ΔA 值÷0.01/ 反應(yīng)時(shí)間（1 min））/（取樣量（0.1 mL）× 待測樣本蛋白濃度（mgprot/mL））。

1.2.2.3 MDH 測定 按照南京建成蘋果酸脫氫酶（MDH）測試盒說明進(jìn)行樣品中MDH 活性檢測。計(jì)算公式為：MDH 活性（U/mgprot）=（測定ΔA-空白ΔA）/6.2*×比色光徑（0.5 cm））×（反映液總體積（1.05 mL）/取樣量（0.05 mL））× 樣本測試前稀釋稀釋÷ 待測樣本蛋白濃度（mgprot/mL），其中，6.2*為底物的微摩爾消光系數(shù)。

1.2.2.4 LDH 測定 按照南京建成乳酸脫氫酶（LDH）測試盒說明進(jìn)行樣品中LDH 活性檢測。按照操作表3 進(jìn)行操作。計(jì)算公式為：LDH 活性（U/gprot）=（測定OD 值-對(duì)照OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 紙）× 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（2 mmol/L）÷ 勻漿蛋白濃度（gprot/mL）。

表3 操作表格

1.3 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSSV 17.0 軟件的One-Way ANOVA 或T-Test 進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 肌纖維類型組成測定結(jié)果 民豬和大白豬4 種肌球蛋白重鏈檢測情況見圖1。民豬I 型、IIa 型和IIx 型mRNA 表達(dá)量均顯著高于大白豬，分別是大白豬的1.56、1.73、1.63 倍；而IIb 型mRNA 表達(dá)量顯著低于大白豬，是大白豬的0.4 倍。結(jié)果表明，民豬氧化型和中間型纖維含量高于大白豬，而酵解型纖維含量低于大白豬。

圖1 民豬和大白豬MyHC 亞型mRNA 表達(dá)差異

2.2 民豬與大白豬能量代謝關(guān)鍵酶活性測定結(jié)果 民豬與大白豬SDH、MDH 和LDH 酶活情況見圖2，民豬SDH 和MDH 活性顯著高于大白豬，分別是大白豬的1.33 倍和1.21 倍；LDH 活性顯著低于大白豬，是大白豬的0.88 倍。結(jié)果表明，民豬有氧代謝關(guān)鍵酶活性高于大白豬，無氧代謝關(guān)鍵酶活性低于大白豬。

圖2 民豬與大白豬SDH、MDH 和LDH 活性差異

3 討 論

骨骼肌承載著收縮運(yùn)動(dòng)、能量轉(zhuǎn)化、物質(zhì)代謝、結(jié)構(gòu)支撐等核心作用。骨骼肌占哺乳類動(dòng)物機(jī)體組成的40%～50%，并調(diào)節(jié)全身的能量代謝穩(wěn)態(tài)。在同一條件下，肌肉處于何種代謝類型與肌肉的自身狀況密切相關(guān)，肌肉代謝需要各種酶的參與，代謝酶活性的高低直接影響肌肉代謝狀況，肌肉中的SDH、MDH 和LDH活性能在一定程度上反映肌肉代謝特征。SDH 和MDH 可代表肌肉的氧化代謝能力，LDH 的活性可反映細(xì)胞內(nèi)無氧糖酵解的水平。肌纖維類型組成影響骨骼肌的能量代謝，與相關(guān)代謝酶活性密切相關(guān)，I 型具有較高的氧化代謝能力，糖酵解能力較低，其代謝酶中的SDH 和MDH 活性較高。IIb 型糖酵解能力高，糖酵解酶LDH 活性很高，有氧代謝酶活性低。IIx 型代謝特征與IIb 型接近，但氧化代謝程度高于IIb 型。IIa 型代謝特征介于IIx 和I 型之間。在牛肉中，SDH 和MDH活性與肌纖維直徑負(fù)相關(guān)，MDH 活性與I 型含量呈正相關(guān)，LDH 活性與IIb 型含量呈正相關(guān)，并與牛肉的肉質(zhì)性狀息息相關(guān)，SDH、MDH 活性與屠宰后24 h肌肉pH（pH）顯著正相關(guān)，MDH 活性對(duì)肌內(nèi)脂肪沉積具有積極作用，LDH 活性與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，LDH 活性更高時(shí)其pH更低，表明LDH 活性與牛肉的酵解能力呈正相關(guān)。在豬肉中，氧化型肌纖維表達(dá)量高的豬肉其MDH 活性也高，MDH 活性與其肌內(nèi)脂肪含量具有相關(guān)性，MDH mRNA 基因表達(dá)與豬肉中肌內(nèi)脂肪含量關(guān)系密切，提高仔豬豬肉MDH 活性可提高其肌內(nèi)脂肪的沉積，在肌內(nèi)脂肪含量較高的豬肉中MDH 活性顯著高于肌內(nèi)脂肪低的豬肉，在豬背最長肌中LDH 活性越高時(shí)pH越低，SDH 活性更高時(shí)其pH也更高。民豬是典型的脂肪型豬種，肌內(nèi)脂肪含量高達(dá)5.39%，顯著高于大白豬，背最長肌pH為5.63，顯著高于長白豬。豬肉中肌內(nèi)脂肪含量主要由肌纖維類型組成決定，I 型與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)，IIb 型與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)；肌肉中IIb型含量直接影響屠宰后豬肉中pH 值下降的速度，IIb型含量越高，pH 值下降越快，pH越低，影響豬肉的品質(zhì)，甚至產(chǎn)生PSE 肉。本研究中民豬氧化型纖維I 型和IIa 型含量顯著高于大白豬，酵解型纖維IIb 型含量顯著低于大白豬，氧化代謝酶SDH 和MDH 活性顯著高于大白豬，糖酵解酶LDH 活性顯著低于大白豬。民豬背最長肌中較高的有氧代謝關(guān)鍵酶活性高可能與氧化型肌纖維含量高有關(guān)。

4 結(jié) 論

肌纖維類型組成對(duì)骨骼肌代謝酶活性有顯著影響，民豬氧化型肌纖維I 型和IIa 型含量顯著高于長白豬，酵解型纖維IIb 型含量顯著低于大白豬。這是民豬SDH和MDH 活性顯著高于大白豬、LDH 活性顯著低于大白豬的內(nèi)在因素。