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    平菇單核體與雙核體差異的RAPD分析

    2022-08-12 07:12:22張朝輝陳天航梅會(huì)元韓盼盼
    關(guān)鍵詞:單核雙核交配

    張朝輝,王 勛,陳天航,梅會(huì)元,韓盼盼,

    劉天翔1,王振河2,邱立友1 *

    (1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450002;2.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

    0 引言

    【研究意義】平菇(Pleurotus ostreatus),又稱糙皮側(cè)耳,屬于食藥用真菌[1],在我國(guó)具有較長(zhǎng)的栽培歷史,種類(lèi)繁多[2],具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高的特點(diǎn),目前已成為世界性的食用菌品種[3]。平菇屬于典型的異宗結(jié)合擔(dān)子菌,即單核菌株不能形成子實(shí)體,兩個(gè)具有親和作用的異性單核菌絲體結(jié)合后,才具備出菇能力[4],但單核體與雙核體之間的差異尚不明確。【前人研究進(jìn)展】隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,DNA分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食用菌的遺傳多樣性分析中。DNA分子標(biāo)記包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restrction Fragment Lengh Polyorhism,RFLP)標(biāo)記[5]、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)標(biāo) 記[6]、RAPD標(biāo)記[7]、簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(Inter-simple sequence repeats,ISSR)標(biāo)記[8]等,它是直接在DNA水平上反映遺傳變異的一種技術(shù)。其中RAPD標(biāo)記由于其具有檢測(cè)范圍廣[9]、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于菌種鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的建立等方面[10],并取得了顯著成效。詹才新等利用RAPD標(biāo)記對(duì)金針菇不同親本菌株及其雜交菌株進(jìn)行分析后,得出該技術(shù)可用于鑒別真?zhèn)坞s種的結(jié)論[11]。趙光輝等利用RAPD標(biāo)記對(duì)20株草菇進(jìn)行遺傳多樣性的分析,結(jié)果表明所有供試菌株間均存在遺傳差異[12]。RAPD標(biāo)記技術(shù)在食用菌遺傳多樣性分析中發(fā)揮了極大的作用[13]。【本研究切入點(diǎn)】雙核體是一種獨(dú)特的生物,它的菌絲每個(gè)隔間包含兩個(gè)單倍體核,每個(gè)單倍體核來(lái)自不同的親本[14],兩個(gè)相容的單核菌絲體交配形成新的雙核菌絲體,僅發(fā)生質(zhì)配而沒(méi)有進(jìn)行核配[15],這種有性繁殖方式與二倍體明顯不同。通過(guò)來(lái)自糙皮側(cè)耳或香菇(Lentinus edodes)的同一親本的交配親和性擔(dān)孢子自交,已選育出多個(gè)優(yōu)良菌種[16?19],但其機(jī)理還不清楚。目前對(duì)于雙核體及其親本單核體之間的差異研究較少,通過(guò)比較單核體和雙核體的菌絲生長(zhǎng)狀況、出菇產(chǎn)量和遺傳多樣性是研究?jī)烧咧g差異的有效方法?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從平菇TD300的擔(dān)孢子中分離得到MK13和MK3,二者交配得到DK300,通過(guò)對(duì)單雙核菌株及其親本進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)狀況和出菇產(chǎn)量的測(cè)定,利用RAPD法檢測(cè)單雙核菌株的遺傳差異,以期為食用菌自交育種提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌種

    TD300:平菇天達(dá)300,河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株;單核菌株MK13和MK3:TD300擔(dān)孢子分離獲得。選擇品質(zhì)優(yōu)良、大小合適、約八成熟的TD300子實(shí)體通過(guò)鉤懸法收集孢子并制成孢子液,稀釋涂布于PDA平板,25 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。挑取單菌落接種至PDA平板培養(yǎng)基中央,繼續(xù)培養(yǎng)。選擇能夠配合為優(yōu)良雙核菌絲的MK13和MK3作為試驗(yàn)的單核菌株;雙核菌株DK300:MK13和MK3交配所得。

    1.2 培養(yǎng)基的配制

    PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水 1000 mL,pH 自然,分裝后高壓滅菌;棉籽殼栽培料培養(yǎng)基:棉籽殼78%,麩皮20%,石灰1%,石膏1%,含水量65%,pH自然,裝袋后高壓滅菌。

    1.3 菌絲生長(zhǎng)狀況對(duì)比

    將MK13、MK3、DK300和TD300分別接種在含有等體積PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上進(jìn)行活化,3~5 d后,打孔接種到新的平板上培養(yǎng),在培養(yǎng)期間從菌落形態(tài)、菌絲顏色、長(zhǎng)勢(shì)、滿板天數(shù)等方面觀察并記錄4個(gè)菌株的菌絲生長(zhǎng)狀況。

    1.4 出菇情況及產(chǎn)量對(duì)比

    常規(guī)栽培試驗(yàn):使用15 cm ×32 cm聚丙烯折角袋,每袋裝0.9 kg栽培料。高壓滅菌2.5 h,每處理數(shù)量為20袋。常規(guī)管理,在此期間分別記錄菌株性狀和出菇產(chǎn)量。

    1.5 菌株 RAPD 分析

    RAPD標(biāo)記技術(shù)是以基因組DNA為模板,隨機(jī)選擇一個(gè)長(zhǎng)度通常為10個(gè)堿基對(duì)的寡聚核苷酸序列作為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),得到不連續(xù)的DNA產(chǎn)物,用于檢測(cè)DNA序列的多樣性[20]。本試驗(yàn)PCR擴(kuò)增所用的引物來(lái)自上海生工的十堿基隨機(jī)引物,如表1所示。

    表1 供試隨機(jī)引物Table 1 Random primers applied

    菌絲DNA提?。悍Q取新鮮的平板菌絲0.1~0.2 g,利用CTAB法[21]提取菌株DNA。隨機(jī)引物的PCR擴(kuò)增 :PCR體系:HSTMMix(購(gòu)自廣州東盛公司)12.5 μL,隨機(jī)引物(上海生工合成)1 μL,DNA模板 0.5 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃,5 min;94 ℃,1 min;36 ℃,1 min;72 ℃,2 min;72 ℃,10 min,進(jìn)行 30 Cycles。用 1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌絲生長(zhǎng)狀況分析

    將直徑為6 mm的TD300、DK300、MK13和MK3菌絲塊接種在PDA平板中培養(yǎng),觀察記錄4個(gè)菌株菌絲的生長(zhǎng)情況。如表2所示,從菌落形態(tài)來(lái)看,TD300與DK300為半氣生型,MK13和MK3為匍匐型。從菌絲長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看,TD300的菌絲比其他3個(gè)菌株菌絲纖細(xì)稀疏,MK13和MK3的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好,均表現(xiàn)為粗壯濃密。而從菌絲顏色來(lái)看,DK300、MK13和MK3的菌絲均為白色,TD300的菌絲為淺白色。結(jié)果表明,4個(gè)菌株菌絲形態(tài)差異明顯。

    表2 菌株的菌絲形態(tài)Table 2 Mycelium morphology of tested strains

    通過(guò)觀察記錄,對(duì)4個(gè)菌株菌絲在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如圖1所示,從菌絲滿板天數(shù)來(lái)看,TD300與DK300最快滿板,均為4 d,MK13和MK3長(zhǎng)速較慢,其中MK13最慢,長(zhǎng)滿整個(gè)平板需要近20 d。在栽培試驗(yàn)中,TD300菌絲最先滿袋,MK13最晚滿袋,TD300比MK13提前20 d滿袋,這與4個(gè)菌株菌絲在平板中的生長(zhǎng)狀況一致。結(jié)果表明,在不同培養(yǎng)料中,TD300和DK300菌絲生長(zhǎng)狀況較好,MK13和MK3菌絲生長(zhǎng)狀況較差。

    圖1 菌株在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況Fig.1 Mycelial growth of strains in different culture media

    2.2 出菇情況及產(chǎn)量分析

    如表3所示,TD300和DK300均可以出菇,MK13和MK3均不出菇。從子實(shí)體形狀來(lái)看,TD300為貝殼狀,DK300為扇葉狀。而從子實(shí)體顏色來(lái)看,TD300為深褐色,DK300為淺褐色。結(jié)果表明,TD300與DK300子實(shí)體性狀差異明顯。

    表3 菌株出菇情況及子實(shí)體性狀Table 3 Germination and fruiting body properties of mushrooms

    如表4所示,從第一茬均產(chǎn)量來(lái)看,DK300平均每袋產(chǎn)量高于TD300,每袋高出4.40%,但不具有顯著性差異;從第二茬均產(chǎn)量來(lái)看,TD300平均每袋產(chǎn)量比DK300高出21.93%,且具有顯著性差異;而從平均每袋總產(chǎn)量來(lái)看,TD300的平均每袋總產(chǎn)量比DK300高出3.26%。

    表4 菌株出菇產(chǎn)量Table 4 Yields of mushrooms

    2.3 基于 RAPD 標(biāo)記的菌株間親緣關(guān)系分析

    對(duì)提取的單、雙核菌絲DNA進(jìn)行電泳,結(jié)果如圖2所示,DNA條帶清晰且明亮,無(wú)明顯彌散熒光區(qū)出現(xiàn),適合用來(lái)做RAPD分析。本試驗(yàn)對(duì)提取的TD300、DK300、MK13和MK3的菌絲DNA進(jìn)行RAPD分析。

    圖2 DNA電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 DNA electrophoresis of 4 mushroom strains

    對(duì)13條隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)凝膠電泳發(fā)現(xiàn),12條引物能擴(kuò)增出清晰且重復(fù)性好并能用于RAPD分析的條帶。如圖3所示,共有86個(gè)條帶被擴(kuò)增,其中多態(tài)性片段69條,且特異性較高。如引物S36擴(kuò)增出多態(tài)性片段8條,4個(gè)菌株共同條帶2條,在DK300、MK13和MK3這3個(gè)菌株中也有兩條共同條帶,其中DK300擁有的條帶均能夠在MK13和MK3中找到,說(shuō)明DK300與MK13和MK3的親緣關(guān)系最近。引物S62共擴(kuò)增出6條多態(tài)性片段,4個(gè)菌株中出現(xiàn)3條共同條帶,在DK300、MK13和MK3中有兩個(gè)共同條帶出現(xiàn)。所有條帶中,出現(xiàn)共同條帶17條,說(shuō)明這四個(gè)菌株在DNA水平上具有豐富的遺傳多樣性和一定的遺傳均一性。

    圖3 隨機(jī)引物擴(kuò)增電泳圖譜Fig.3 PCR electrophoresis using random primers

    2.4 RAPD 結(jié)果聚類(lèi)分析

    為進(jìn)一步研究菌株間的親緣性關(guān)系,根據(jù)RAPD產(chǎn)生的條帶作出“0-1”矩陣圖并利用NTSYS軟件的Jaccard聚類(lèi)分析法制作聚類(lèi)圖譜(圖4)??梢钥闯?,在遺傳相似系數(shù)為0.53時(shí),4個(gè)菌株分為兩個(gè)類(lèi)群,TD300為一類(lèi),MK13、DK300、MK3為一類(lèi)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.80時(shí),4個(gè)菌株被分為3大類(lèi),其中MK13為第一類(lèi),DK300和MK3為第二類(lèi),TD300為第三類(lèi)。這表明,DK300、MK13、MK3與TD300之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),MK13和MK3與DK300的親緣關(guān)系較近,其中MK3與DK300的親緣關(guān)系最近。而從遺傳差異性來(lái)看,遺傳相似系數(shù)越大說(shuō)明二者之間的遺傳差異越小,由圖4可知,MK13、MK3和交配所得的DK300與親本TD300間具有較大的遺傳差異性,而MK13、MK3和DK300間遺傳差異性較小,尤其是MK3和DK300遺傳差異性最小。

    圖4 RAPD聚類(lèi)分析Fig.4 RAPD clustering on mushroom strains

    3 討論

    平菇屬于異宗結(jié)合食用菌,由擔(dān)孢子直接萌發(fā)形成的菌株是不孕的,只有雙核化的菌株才能形成子實(shí)體[4]。根據(jù)這一原理,本試驗(yàn)從TD300的擔(dān)孢子中分離得到MK13和MK3,二者交配得到DK300,通過(guò)比較4個(gè)菌株的菌絲生長(zhǎng)狀況和出菇產(chǎn)量發(fā)現(xiàn),TD300與其子代DK300的菌絲生長(zhǎng)狀況和產(chǎn)量沒(méi)有顯著性差異[15],這一結(jié)果也證實(shí)了由單核菌絲交配產(chǎn)生的子代雙核菌株遺傳了親本的優(yōu)良性狀,對(duì)雜交育種提供一定的借鑒。

    RAPD技術(shù)能夠準(zhǔn)確鑒定菌株的親緣關(guān)系[22]。這是由于PAPD技術(shù)利用隨機(jī)引物對(duì)不同物種或個(gè)體的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增[7],而引物與序列結(jié)合位點(diǎn)存在的差異能導(dǎo)致擴(kuò)增的多態(tài)性DNA片段在DNA水平上反映出物種或者個(gè)體間的遺傳差異[23]。本試驗(yàn)通過(guò)RAPD技術(shù)檢測(cè)4個(gè)菌株間的遺傳差異性,結(jié)果表明兩個(gè)單核菌株MK13、MK3與親本TD300和單核菌株交配所得的雙核菌株DK300間具有遺傳差異性,而單核菌株MK13和MK3與其交配所得的雙核菌株DK300間遺傳差異較小,尤其是MK3與DK300間差異更小。表明經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂形成擔(dān)孢子時(shí)可能發(fā)生有基因重組,而通過(guò)兩個(gè)單核菌株交配得到雙核菌株過(guò)程則較少發(fā)生基因重組。前期同工酶譜結(jié)果與之類(lèi)似。NADH脫氫酶同工酶譜中雙核菌株DK300和單核菌株MK3有2條NADH脫氫酶同工酶譜帶,而單核菌株MK13有3條NADH脫氫酶同工酶譜帶;NADPH脫氫酶同工酶中雙核菌株DK300、單核菌株MK3只有1條同工酶譜帶,而單核菌株MK13的NADPH脫氫酶同工酶譜帶為4條[24]。

    端粒酶發(fā)揮作用能夠維持端粒長(zhǎng)度。由于體細(xì)胞中缺乏端粒酶活性,因此端粒長(zhǎng)度會(huì)隨DNA復(fù)制逐漸縮短。在生殖細(xì)胞中則有端粒酶,能夠進(jìn)行端粒修復(fù),端粒長(zhǎng)度因端粒酶活性的存在保持不變,保護(hù)染色體遺傳物質(zhì)的完整性[25]。擔(dān)子菌食用菌保藏、制種和復(fù)壯時(shí),往往通過(guò)菌絲和組織塊的無(wú)性繁殖進(jìn)行的,因此,染色體端粒將不斷縮短,進(jìn)而導(dǎo)致菌種活力下降,產(chǎn)量降低。通過(guò)有性繁殖形成擔(dān)孢子時(shí),擔(dān)孢子中的染色體可能存在有端粒修復(fù),由擔(dān)孢子萌發(fā)形成的單核菌絲交配形成的雙核菌絲其染色體端??赡艿靡孕迯?fù),菌種活力得到真正的復(fù)壯。這種機(jī)制可能是擔(dān)子菌食用菌自交育種的另一個(gè)機(jī)理,但還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

    本研究通過(guò)RAPD分析和聚類(lèi)結(jié)果,并結(jié)合同工酶分析,可以快速檢測(cè)出4個(gè)菌株間的遺傳差異性,得出結(jié)論:MK13、MK3和交配所得的DK300與親本TD300間具有較大的遺傳差異性,而MK13、MK3和DK300間遺傳差異性較小,尤其是MK3和DK300遺傳差異性最小。這一結(jié)果是由于減數(shù)分裂過(guò)程中產(chǎn)生的遺傳變異引起的,可能是擔(dān)子菌食用菌自交育種的重要機(jī)制之一。

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