蘭州鲇性腺型芳香化酶cyp19a1a基因克隆及表達(dá)定位分析

李敏敏，俞兆曦，張利平，劉 凱，肖 偉，劉彥斌，賽清云，田永華，吳旭東,3,4 *，連總強(qiáng) *

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所，寧夏 銀川 750001；3.寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750001；4.寧夏漁業(yè)科技院士工作站，寧夏 銀川 750001）

0 引言

【研究意義】大多數(shù)脊椎動(dòng)物為雌雄異體，其子代主要通過兩種方式?jīng)Q定性別：基因型性別決定（GSD）和環(huán)境性別決定（ESD）[1,2]。GSD通過具有性別差異的遺傳因素驅(qū)動(dòng)，可以分為3個(gè)系統(tǒng)：雄性染色體異配的XY型、雌性染色體異配的ZW型和染色體性別決定的多生型[2]。ESD由溫度、缺氧、社會(huì)因素等環(huán)境因素影響觸發(fā)。性別二態(tài)性通常被稱為同一物種的雄性和雌性個(gè)體之間的差異，它與形態(tài)、解剖學(xué)、生理學(xué)、行為學(xué)和生活史等許多方面有關(guān)[3]。魚類是脊椎動(dòng)物中最豐富的類群，表現(xiàn)出多樣化和多變的性別決定機(jī)制[3]，許多魚類已被證明在生長速度和體型等經(jīng)濟(jì)性狀上表現(xiàn)出顯著的性別二態(tài)性。例如，在鯉魚（Cyprinus carpio）[4]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[5]、南比目魚（Paralichthys lethostigma）[6]和半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[7]中，雌性比雄性長得更快且體型更大，而在黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[8]、 尼 羅 羅 非 魚（Oreochromis niloticus）[9]、 烏 蘇 里 擬 鲿（Pseudobagrus ussuriensis）[10]中，雄性比雌性長得更快且體型更大。因此，基于對(duì)性別決定與分化相關(guān)基因研究，在生長速度和體型性別二態(tài)性的魚類中生產(chǎn)全雌性或全雄性種群對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要的經(jīng)濟(jì)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】芳香化酶（P450arom）是性類固醇激素代謝中的一種重要酶類，屬于細(xì)胞色素P450家族，可催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，是雌激素生物合成的關(guān)鍵酶和限速酶[11]。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，P450arom由CYP19單基因編碼，但在魚類中卻發(fā)現(xiàn)了兩種不同基因編碼的P450arom，即性腺（卵巢）芳香化酶（cyp19a1a）和腦芳香化酶（cyp19a1b）。cyp19a1a作為雌激素合成的關(guān)鍵基因，廣泛參與調(diào)控雌雄異體魚類（如花鱸Lateolabrax maculatus[12]、鯽鯉[13]、泥鰍Misgurnus anguillicaudatus[14]等）以及雌雄同體魚類（如斑馬魚[15]、黃鱔Monopterus albus[16]、斜帶石斑魚Epinephelus coioides[17]、青鳉Oryzias latipes[18]等）的性別分化和性腺發(fā)育過程。研究表明，雌雄異體和雌雄同體雌性先熟魚類在卵巢分化過程中cyp19a1a表達(dá)水平顯著升高，并在卵巢發(fā)育過程中持續(xù)高表達(dá)，而雌雄同體雌性先熟魚類在性腺逆轉(zhuǎn)為精巢過程中cyp19a1a表達(dá)水平顯著降低，并在精巢發(fā)育期間一直保持低水平。cyp19a1a基因在魚類性腺的表達(dá)水平很容易受到外源環(huán)境影響，如溫度、性類固醇激素和芳香化酶抑制劑等。Ruksana等[19]對(duì)XX牙鲆進(jìn)行芳香化酶抑制劑處理，使其卵巢逆轉(zhuǎn)為精巢，并導(dǎo)致cyp19a1a表達(dá)水平顯著降低。Vizziano等[20]研究表明通過外源雌激素（E2）處理可以將XY雄性虹鱒逆轉(zhuǎn)為XY偽雌魚，并導(dǎo)致cyp19a1a表達(dá)水平顯著升高。Zhang等[21]對(duì)cyp19a1a功能研究表明，敲除XX羅非魚cyp19a1a基因，使雌魚性逆轉(zhuǎn)為雄魚，通過持續(xù)的E2處理羅非魚cyp19a1a突變體的精巢表型成功逆轉(zhuǎn)為卵巢，而在停止E2處理后又恢復(fù)精巢，因?yàn)閏yp19a1a的敲除導(dǎo)致羅非魚不能合成內(nèi)源性雌激素。蘭州鲇（Silurus lanzhouensis）又名黃河鯰，隸屬于鲇形目（Siluriformes）鲇科（Siluridea）鲇屬（Silurus），是我國黃河中上游特有土著經(jīng)濟(jì)魚類[22]，體型大、營養(yǎng)豐富，已成為我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類，市場需求量穩(wěn)步增長[23]。與大多數(shù)鲇類相似，蘭州鲇需要3年才能性成熟，且成熟雄性個(gè)體較雌性個(gè)體大1.5倍，在生長速度和體型上具有明顯的性別二態(tài)性。有關(guān)蘭州鲇國內(nèi)已開展了種質(zhì)繁育[24,25]、良種選育[26,27]與飼料營養(yǎng)[28,29]等相關(guān)領(lǐng)域研究。【本研究切入點(diǎn)】本項(xiàng)目組在蘭州鲇性別決定系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)[30]其為雄性異配XX/XY性別決定系統(tǒng)，對(duì)偶然發(fā)現(xiàn)的XY基因型雌雄同體親本進(jìn)行自體精卵人工授精并成功獲得了YY雄性。此基礎(chǔ)上，需要進(jìn)一步開展生長性狀具有性別二態(tài)性蘭州鲇cyp19a1a基因克隆及雌雄同體表達(dá)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過同源克隆和RACE的方法獲得了蘭州鲇性腺型芳香化酶cyp19a1a基因的cDNA序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用qRT-PCR對(duì)cyp19a1a基因在蘭州鲇雌、雄魚和雌雄同體魚不同組織以及蘭州鲇雌、雄魚不同發(fā)育階段性腺表達(dá)情況進(jìn)行比較分析，同時(shí)采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)蘭州鲇不同發(fā)育階段性腺進(jìn)行定位分析，以期為雌雄同體以及生長速度和體型性別二態(tài)性魚類性別決定與分化、性腺發(fā)育與維持調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料，為培育全雄蘭州鲇良種新品種提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需蘭州鲇于2021年8月份取自寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所國家級(jí)蘭州鲇原種場建設(shè)基地。取3齡的蘭州鲇雌、雄魚和雌雄同體魚的腦、下丘腦、垂體、鰓、肌肉、胃、腸、心、肝、脾、腎、卵巢、精巢和3月齡、1齡蘭州鲇卵巢和精巢組織，雌雄各兩尾。取樣后迅速置于液氮中速凍后?80 ℃保存用于后續(xù)RNA提取。采集3月齡、1齡和3齡蘭州鲇雌、雄魚卵巢、精巢部分組織4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；2×TaqPlus Master Mix（Dye Plus）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、TB Green Premix ExTaqII、pMD18-T 克隆載體、SMARTer?RACE5′/3′Kit、DNAA-Tailing Kit試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；一抗購自Affinity，SP試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 總 RNA 提取和 cDNA 合成

參照總RNA提取試劑盒用戶手冊(cè)，提取蘭州鲇卵巢總RNA；使用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)（ALLSHFNG，中國）檢測(cè)RNA完整性和純度；參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒用戶手冊(cè)合成cDNA第一鏈，用于cyp19a1a中間序列克隆和熒光定量分析；參照 SMARTer ? RACE 5′/3′ Kit User Manual合成5′ - RACE Ready cDNA 和 3′ - RACE Ready cDNA，用于cyp19a1a5′/3′ 兩端序列克隆。

1.4 cyp19a1a 全長 cDNA 克隆

首先參考斑點(diǎn)叉尾鮰cyp19a1a基因序列（GenBank登錄號(hào)：NM_001329260.1），利用 Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物cyp19a1a-F和cyp19a1a-R，用于擴(kuò)增cyp19a1a基因中間序列。RT-PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，其 中 2×TaqPlus Master MixⅡ（Dye Plus）12.5 μL，cDNA 2 μL（經(jīng)稀釋 cDNA 的終濃度為 50 ng·μL?1），cyp19a1a-F（10 μmol·L?1）1 μL，cyp19a1a-R（10 μmol·L?1）1 μL，無菌水 8.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變 性 3 min； 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 2 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 再延伸 5 min。再根據(jù)已獲得cyp19a1a中間序列，用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)RACE引物，進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增。以合成卵巢5′/3′RACE Ready cDNA為模板，使用引物cyp19a1a-5gsp1和cyp19a1a-3gsp1 與 10×Universal Primer A Mix（UPM）分別進(jìn)行5′RACE和3′RACE第一次PCR擴(kuò)增；取5 μL 第一次 PCR 產(chǎn)物稀釋到 245 μL 的 Tricine-EDTA作為第二次PCR模板，相應(yīng)引物為cyp19a1a-5gsp2和cyp19a1a-3gsp2 與 Universal Primer Short。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物，用DNA A-Tailing Kit試劑盒對(duì)回收目的產(chǎn)物進(jìn)行末端加A處理，連接到pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，菌落PCR篩選陽性克隆并由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)5′和3′端序列所包含重疊序列進(jìn)行拼接，得到cyp19a1a基因全長cDNA序列。引物信息如表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers applied

1.5 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件進(jìn)行cyp19a1a序列拼接，NCBI中Blast工具進(jìn)行拼接序列比對(duì)，NCBI的OFR Finder工具預(yù)測(cè)開放閱讀框，Bio Edit分析核酸序列分子質(zhì)量，ExPASy-ProtParam（http://www.expasy.org/）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，PSORTⅡPrediction（http://psort.hgc.jp/form.html）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位，SignalIP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽，TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、DeepTMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepTMHMM）在線軟件預(yù) 測(cè) 蛋 白 質(zhì) 跨 膜 區(qū) ， Predict Protein（http://www.predictprotein.Org）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預(yù) 測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域。PROSITE（https://prosite.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能域。在線軟件ClustalW（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ciustalo/）將蘭州鲇cyp19a1a基因編碼的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源性比對(duì)。用MEGA11軟件利用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 組織表達(dá)分析

提取3齡蘭州鲇雌、雄魚和雌雄同體的腦、下丘腦、垂體、鰓、肌肉、胃、腸、心、肝、脾、腎、卵巢、精巢以及3月齡、1齡性未成熟蘭州鲇卵巢和精巢組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（方法同1.3）。根據(jù)蘭州鲇cyp19a1a基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（cyp19a1a-qF和cyp19a1a--qR，表1），將各組織 cDNA 稀釋為 50 ng·μL?1，以卵巢為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證引物特異性及退火溫度，反應(yīng)條件同1.3。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)蘭州鲇最適內(nèi)參基因的分析，選取β-actin作為內(nèi)參基因。采用SYBRGreenⅠ染料法，qPCR在qTOWER2.2型熒光定量擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為 20.0 μL：cDNA 模板 2 μL，TB Green Premix ExTaqII 10 μL，10 μmol·L?1正反引物各 0.8 μL，ddH2O 6.4 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 15 s，進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s 反應(yīng)條件繪制熔解曲線；每個(gè)樣品均進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，每次設(shè)定一個(gè)無模板陰性對(duì)照以排除假陽性結(jié)果。采用2?ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

組織切片制備：將組織樣品從4%多聚甲醛溶液取出，沖洗組織塊、脫水、透明、浸蠟和包埋，制成4 μm厚石蠟切片，置于烤片機(jī)上，60 ℃烘烤6 h。免疫組織化學(xué)染色：（1）切片脫蠟至水，在pH 6.0的 0.01 mol·L?1檸檬酸鹽緩沖液微波加熱修復(fù)抗原15 min，自然冷卻至室溫。（2）滴加3%過氧化氫溶液，37 ℃作用15 min。（3）滴加正常山羊血清，室溫封閉 15 min。（4）一抗孵育，4 ℃ 過夜。（5）復(fù)溫 30 min，二抗孵育，37 ℃ 作用 15 min。（6）三抗孵育，37 ℃ 作用 15 min。（7）DAB 顯色，在顯微鏡下觀察并控制顯色，自來水終止反應(yīng)。（8）蘇木精復(fù)染1.5 min，鹽酸酒精分化，自來水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以上步驟除第三步外，其余各步驟間均用PBS洗3次，每次3 min。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟不變。照片均通過BA400 Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用2?ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，以單因素方差分析ANOVA（SPSS 25.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用GraphPadPrism8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 cyp19a1a 序列的分子特征

本研究采用同源克隆和RACE方法獲得蘭州鲇cyp19a1a全長 cDNA 序列 2168 bp，包含 4 個(gè)多聚腺苷酸化信號(hào)（AATAAA），其中 5′ 非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR）53 bp， 開 放 閱 讀 框1707 bp，3′ UTR 408 bp。Cyp19a1a 編碼 568 個(gè)氨基酸，包含20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，其中亮氨酸（Leu，12.5%）最多，谷氨酸（Glu，7.7%）、纈氨酸（Val，7.7%）次之，色氨酸（Trp，1.1%）最少。使用ExPAsy在線軟件預(yù)測(cè)Cyp19a1a蛋白分子質(zhì)量為64951.89 kD，分子式為 C2 897H4 579N801O835S30，半衰期為 30 h，理論等電點(diǎn)6.60，不穩(wěn)定系數(shù)為44.33，總平均親水性為?0.192。Cyp19a1a亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的概率為33.3%，位于液泡、質(zhì)膜的概率為22.2%，位于線粒體、高爾基體的概率均為11.1%。利用Signal IP對(duì)蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有信號(hào)肽。用TMHMM 2.0 Server預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)跨 膜螺旋數(shù) 量（Number of predicted TMHs）為0；1～568位氨基酸全部為膜外蛋白，無膜內(nèi)蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)。用DeepTMHMM對(duì)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)存在1個(gè)跨膜螺旋區(qū)，第47～56位氨基酸（圖1）。利用 Predict Protein在線軟件對(duì)蘭州鲇Cyp19a1a蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)Cyp19a1a蛋白中α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)卷曲所占的比例分別為40.49%、14.61%和44.89%。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，蘭州鲇cyp19a1a基因編碼的氨基酸序列有2 個(gè)低復(fù)雜度區(qū)（Low complexity region），分別在 46～56位和513～537位。有1個(gè)P450蛋白結(jié)構(gòu)域（Pfam domain），在68～508位。用PROSITE對(duì)其功能域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在450～459位存在細(xì)胞色素P450半胱氨酸血紅素-鐵配體識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)。SWISS-MODEL在線軟件對(duì)蘭州鲇cyp19a1a基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角以及延伸鏈構(gòu)成。

圖1 蘭州鲇卵巢芳香化酶的跨膜螺旋預(yù)測(cè)Fig.1 Predicted transmembrane helices of ovarian aromatase in S.lanzhouensis

圖2 預(yù)測(cè)的蘭州鲇Cyp19a1a蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Tertiary structure of Cyp19a1a in S.lanzhouensis

2.2 Cyp19a1a 蛋白多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中收集已發(fā)表的不同物種（兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、和硬骨魚類）Cyp19a1a氨基酸序列，使用Clustal W與其他物種進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在蘭州鲇cyp19a1a基因中也存在芳香化酶的5個(gè)高度保守片段，分別為跨膜區(qū)、I-螺旋區(qū)（與類固醇物質(zhì)結(jié)合有關(guān)）、Ozol’s肽區(qū)、芳香化酶特異保守區(qū)以及血紅素結(jié)合區(qū)（圖3），經(jīng)Blastx在線軟件分析發(fā)現(xiàn)Cyp19a1a氨基酸序列與南方大口鲇（Silurus meridionalis，AAP83133.1）的同源性最高（97.94%），與虎頭鯊（Pangasianodon hypophthalmus，XP_034161197.1）、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus，NP_001316189.1）、 黃 顙 魚（Tachysurus fulvidraco，AKK31591.1）、印度囊鰓鲇（Heteropneustes fossilis，AID21725.1）、 蟾 胡 子 鲇（Clarias batrachus，AML79722.1）、塘鲺（Clarias fuscus，AFB77217.1）、尖齒胡鲇（Clarias gariepinus，ADH29765.1）等鲇形目魚類的同源性分別為90.23%、89.21%、87.62%、84.7%、83.50%、64.68%、60.23%；與大蓋巨脂鯉（Colossomamacropomum，XP_036420492.1）、紅腹白鯧（Pygocentrus nattereri，XP_017574997.2）、電鰻（Electrophorus electricus，XP_026865672.2）的同源性分別為76.70%、76.15%、74.81%；與鯉魚（Cyprinus carpio，XP_042599607.1）、 斑 馬 魚（Danio rerio，NP_571229.3） 、 稀 有 鮈 鯽（Gobiocypris rarus，ADB29065.1） 的 同 源 性為71.43%、70.66%、70.66%；與其他硬骨魚類均在60%~70%。另外，Cyp19a1a氨基酸序列與人類（Homo sapiens，NP_000094.2）、小鼠（Mus musculus，NP_001335100.1）、 兔（Oryctolagus cuniculus，NP_001164392.1）、 非 洲 爪 蟾（Xenopus laevis，BAF48355.1）的同源性均為55%左右。在Cyp19a1a氨基酸序列分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明蘭州鲇cyp19a1a基因與鲇形目魚類聚為一小支且與南方大口鲇同源性高，親緣關(guān)系最近；與兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥類和哺乳動(dòng)物同源性相對(duì)低。

圖3 不同脊椎動(dòng)物的Cyp19a1a氨基酸的同源性分析Fig.3 Homology of Cyp19a1a in different vertebrates

圖4 cyp19a1a基因系統(tǒng)進(jìn)化樹（NJ）Fig.4 Phylogenetic trees of cyp19a1a (Neighbor-joining)

2.3 蘭州鲇 cyp19a1a 基因組織表達(dá)分析

采用qRT-PCR方法檢測(cè)cyp19a1amRNA在蘭州鲇3齡雌魚和雄魚的腦、下丘腦、垂體、鰓、肌肉、胃、腸、心、肝、脾、腎、精巢、卵巢組織的表達(dá)。結(jié)果顯示：cyp19a1amRNA在3齡蘭州鲇雌、雄魚性腺中的表達(dá)水平最高，且卵巢的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于精巢（P＜ 0.05），而精巢的表達(dá)水平顯著高于其他組織（P＜ 0.05），提示蘭州鲇cyp19a1amRNA的表達(dá)具有組織特異性和性別二態(tài)性（圖5）。對(duì)3月齡、1齡、3齡蘭州鲇卵巢和精巢cyp19a1amRNA的表達(dá)分析結(jié)果表明，卵巢組織中3齡個(gè)體表達(dá)水平最高，1齡的表達(dá)水平次之，3月齡的表達(dá)水平最低，各個(gè)時(shí)期之間差異顯著（P＜ 0.05）；精巢組織中3齡蘭州鲇表達(dá)水平最高且與3月齡和1齡差異顯著（P＜ 0.05），表明cyp19a1amRNA 隨著蘭州鲇性腺發(fā)育表達(dá)逐漸增強(qiáng)（圖6）。

圖5 cyp19a1a基因在3齡雌雄蘭州鲇不同組織表達(dá)水平Fig.5 cyp19a1a expressions in different organs of 3-year-old female and male S.lanzhouensis

圖6 蘭州鲇cyp19a1a基因在不同年齡段性腺發(fā)育差異表達(dá)Fig.6 cyp19a1a expressions during gonad development of S.lanzhouensis at different ages

2.4 Cyp19a1a 蛋白在蘭州鲇性腺中的細(xì)胞定位

通過石蠟切片確定3月齡、1齡、3齡蘭州鲇性腺發(fā)育時(shí)期，3月齡卵巢處于Ⅱ期，由少量Ⅰ時(shí)相卵原細(xì)胞和Ⅱ時(shí)相初級(jí)卵母細(xì)胞組成；1齡卵巢處于Ⅱ期，由極少數(shù)卵原細(xì)胞和初級(jí)卵母細(xì)胞（小生長期）組成；3齡卵巢處于Ⅲ期，主要由Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞組成（大生長期）。3月齡精巢處于Ⅱ期，主要由Ⅱ時(shí)相初級(jí)精母細(xì)胞組成；1齡精巢處于Ⅲ期，由少量初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子組成；3齡精巢處于Ⅳ期，由少量次級(jí)精母細(xì)胞和精子組成。

利用免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行Cyp19a1a在3月齡、1齡、3齡蘭州鲇卵巢、精巢組織中的細(xì)胞定位檢測(cè)，結(jié)果顯示，3月齡、1齡卵巢中的卵原細(xì)胞呈免疫陰性反應(yīng)，而3月齡、1齡和3齡卵巢中卵母細(xì)胞都對(duì)Cyp19a1a顯免疫陽性反應(yīng)。3月齡～1齡的卵巢發(fā)育過程中初級(jí)卵母細(xì)胞免疫陽性信號(hào)逐漸增強(qiáng)，其主要分布于胞質(zhì)。隨著初級(jí)卵母細(xì)胞生長發(fā)育，在3齡蘭州鲇卵巢中次級(jí)卵母細(xì)胞免疫陽性反應(yīng)達(dá)到最強(qiáng)，其主要分布于胞質(zhì)、濾泡膜以及放射膜和鞘膜細(xì)胞。Cyp19a1a在3月齡、1齡和3齡蘭州鲇精巢中間質(zhì)細(xì)胞呈弱陽性反應(yīng)（圖7）。

圖7 Cyp19a1a在蘭州鲇卵巢和精巢的細(xì)胞定位Fig.7 Cellular localizations of Cyp19a1a in ovary and testis of S.lanzhouensis

2.5 蘭州鲇雌雄同體 cyp19a1a 基因組織表達(dá)分析

采用qRT-PCR方法檢測(cè)cyp19a1amRNA在3齡蘭州鲇雌雄同體的腦、下丘腦、垂體、鰓、肌肉、胃、腸、心、肝、脾、腎、卵巢的表達(dá)。結(jié)果顯示：cyp19a1amRNA在3齡蘭州鲇雌雄同體的性腺中表達(dá)水平最高，且卵巢的表達(dá)水平顯著高于精巢（P＜ 0.05），而精巢的表達(dá)水平顯著高于其他組織，在腦、下丘腦、垂體等組織僅檢測(cè)到微量表達(dá)，提示蘭州鲇雌雄同體cyp19a1amRNA的表達(dá)具有組織特異性（圖8）。cyp19a1amRNA在3齡蘭州鲇雌雄同體和雌雄魚性腺的表達(dá)結(jié)果顯示，雌雄同體和雌魚在卵巢中高表達(dá)，且兩者差異不顯著（P ＞0.05），而在雌雄同體和雄魚精巢的表達(dá)遠(yuǎn)低于卵巢（P＜ 0.05），且兩者精巢組織差異不顯著（P＞0.05）（圖9）。

圖8 cyp19a1a基因在3齡蘭州鲇雌雄同體不同組織表達(dá)差異Fig.8 Expression of cyp19a1a in different organs of 3-year-old hermaphroditic S.lanzhouensis

圖9 cyp19a1a基因在3齡蘭州鲇雌雄同體和雌雄異體性腺表達(dá)水平Fig.9 Expression of cyp19a1a in gonads of 3-year-old hermaphroditic and gonochoristic S.lanzhouensis

3 討論

為研究蘭州鲇性腺型芳香化酶cyp19a1a基因，從蘭州鲇卵巢組織中分離出cyp19a1acDNA全長序列。對(duì)編碼氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、跨膜螺旋、疏水性/親水性以及蛋白質(zhì)一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、保守區(qū)域進(jìn)行分析，與其他脊椎動(dòng)物cyp19a1a基因進(jìn)行序列比對(duì)、氨基酸序列同源性以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，可確定所克隆基因全長是卵巢芳香化酶基因。該基因含有典型cyp19基因保守的跨膜區(qū)、Ⅰ-螺旋區(qū)（與類固醇物質(zhì)結(jié)合有關(guān)）、Ozol's肽區(qū)、芳香化酶特異保守區(qū)以及血紅素結(jié)合區(qū)。這些區(qū)域在大多數(shù)脊椎動(dòng)物中高度保守，并負(fù)責(zé)CYP19的結(jié)合和催化活性?；谛蛄斜Ｊ匦?，推測(cè)cyp19基因與其他物種具有相似的結(jié)合和催化活性并且發(fā)揮著極其重要的生理功能。系統(tǒng)發(fā)育樹表明蘭州鲇cyp19a1a與南方大口鲇親緣關(guān)系最近，與其他鲇形目魚類處于同一進(jìn)化分支上，說明鲇形目魚類中Cyp19a1a蛋白具有高度保守性；進(jìn)化分析結(jié)果與傳統(tǒng)的分類基保持一致，符合脊椎動(dòng)物的進(jìn)化規(guī)律。

在脊椎動(dòng)物中，cyp19a1a基因的表達(dá)模式表現(xiàn)出明顯的性別二型性。本研究通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)cyp19a1amRNA在3齡蘭州鲇雌魚卵巢中高表達(dá)，在精巢的表達(dá)量也遠(yuǎn)高于除卵巢外的其他組織。這與非洲爪蟾[31]、稀有鮈鯽[32]和黃鱔[18]等的研究結(jié)果相似。這是由于較高的cyp19a1a可以加速雌激素合成，而雌激素在魚類卵巢分化與維持等方面起著至關(guān)重要的作用[33]。Kitano等[34]在對(duì)比目魚性腺分化過程中發(fā)現(xiàn)，cyp19a1a在性腺中低表達(dá)是形成精巢的必要條件。因此推測(cè)cyp19a1a在蘭州鲇精巢低表達(dá)很可能在精巢形成和維持方面發(fā)揮了促進(jìn)作用。此外，cyp19a1a在蘭州鲇腦、下丘腦、垂體、心臟、肝等組織中也有微量表達(dá)。盡管cyp19a1amRNA的主要表達(dá)部位是性腺，但其組織表達(dá)在不同魚種之間并不總是一致的。例如，cyp19a1a在斑馬魚[17]的卵巢、腦和眼中表達(dá)，在裸蓋魚（Anoplopoma fimbria）[35]的卵巢、精巢和垂體中表達(dá)，而在泥鰍[16]腦、性腺、肝臟中表達(dá)。事實(shí)上cyp19a1a表達(dá)不僅在不同的組織中、雌雄之間表現(xiàn)出不同的特異性，而且在繁殖季節(jié)與非繁殖季節(jié)、不同發(fā)育階段之間也表現(xiàn)出不同的特異性[36]。因此，本研究中cyp19a1a在蘭州鲇性腺不同發(fā)育階段的表達(dá)結(jié)果觀察到3齡蘭州鲇卵巢中cyp19a1amRNA的表達(dá)水平最高，其次是1齡，3月齡表達(dá)量最低，表明cyp19a1a可能在卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。研究表明卵巢芳香化酶的表達(dá)量決定著硬骨魚卵巢發(fā)育及其成熟[37]。而在蘭州鲇精巢中，3齡蘭州鲇精巢中cyp19a1amRNA的表達(dá)水平最高，1齡和3月齡表達(dá)量低，這一結(jié)果推測(cè)其和精巢發(fā)育過程中精子生成有關(guān)。Callard[38]在研究精子生成過程中類固醇激素的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，在精子生成末期，血清中雌激素早于雄激素先達(dá)到峰值或與雄激素同時(shí)達(dá)到峰值。

免疫組織化學(xué)定位分析發(fā)現(xiàn)，蘭州鲇Cyp19a1a在3月齡卵巢中的卵原細(xì)胞呈免疫陰性反應(yīng)，而在3月齡、1齡和3齡卵巢的卵母細(xì)胞顯免疫陽性反應(yīng)。Cyp19a1a在3月齡到1齡卵巢發(fā)育過程中，初級(jí)卵母細(xì)胞信號(hào)逐漸增強(qiáng)且主要分布在卵母細(xì)胞的胞質(zhì)；隨著初級(jí)卵母細(xì)胞的生長發(fā)育，在3齡卵巢中其信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)且主要分布在初級(jí)卵母細(xì)胞的胞質(zhì)、濾泡膜以及放射膜。相關(guān)研究表明，Cyp19a1a在鳉魚（Fundulus heteroclitus）[39]、斑馬魚[40]和大西洋黃魚[41]卵母細(xì)胞中高表達(dá)，而在卵黃發(fā)生前期和卵黃發(fā)生階段的卵泡細(xì)胞層表達(dá)較少。同時(shí)，Dong等[39]發(fā)現(xiàn)Cyp19a1a的表達(dá)主要定位于鳉魚發(fā)育過程中的初級(jí)生長階段卵母細(xì)胞的卵漿中，隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育直至卵黃生成，Cyp19a1a的信號(hào)逐漸減弱。本試驗(yàn)中Cyp19a1a在不同發(fā)育階段卵細(xì)胞的表達(dá)與上述卵黃發(fā)生前的卵母細(xì)胞中高表達(dá)的結(jié)果一致，表明在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中，芳香化酶高活性能夠加速催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，雌激素可以促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育，刺激卵母細(xì)胞中卵黃物質(zhì)的積累，從而使卵子發(fā)育順利進(jìn)行，表明芳香化酶的活性對(duì)蘭州鲇卵母細(xì)胞的生長發(fā)育有重要作用。在3月齡、1齡、3齡精巢組織中，發(fā)現(xiàn)Cyp19a1a在間質(zhì)細(xì)胞有陽性反應(yīng)，這與在斑點(diǎn)叉尾鮰[42]、虹鱒[43]和刺魟（Dasyatis akajei）[44]中的研究結(jié)果一致。間質(zhì)細(xì)胞能夠合成和分泌雄激素，同時(shí)也是雄激素作用的靶細(xì)胞，因此可以進(jìn)一步推測(cè)cyp19a1a具有促進(jìn)精巢的發(fā)育和精子發(fā)生的作用。

眾所周知，在硬骨魚類中，雌二醇和甲基睪酮是主要的雌激素和雄激素。調(diào)控這些性類固醇激素可以誘導(dǎo)許多雌雄同體發(fā)生性別轉(zhuǎn)化[33]。Devlin[33]和Kroon[45]等認(rèn)為芳香化酶（一種將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的類固醇生成酶）是調(diào)節(jié)雌雄同體、原性和雙向物種性別分化的關(guān)鍵酶。本研究通過qRT-PCR檢測(cè)cyp19a1a基因在蘭州鲇雌雄同體不同組織的表達(dá)以及雌雄同體與雌、雄魚性腺的表達(dá)對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)鲇雌雄同體蘭州鲇和正常蘭州鲇表達(dá)模式一致，兩者主要在是性腺中表達(dá)，且在卵巢中的表達(dá)遠(yuǎn)高于精巢。而cyp19a1a基因在雌雄同體和正常雌雄蘭州鲇性腺的表達(dá)差異均不顯著。以上結(jié)果表明，cyp19a1a基因?qū)μm州鲇雌雄魚和雌雄同體魚的調(diào)控作用是一致的。在硬骨魚中，已經(jīng)記錄了1500多種雌雄同體的魚類[46]。大多數(shù)雌雄同體魚類主要有3種性別轉(zhuǎn)變形式，即原雌體（雌魚到雄魚的性別變化）、原雄魚（雄魚到雌魚的性別變化）以及一系列的雙向性別變化[47]。相反，同時(shí)的兩性現(xiàn)象只存在于以下兩個(gè)魚種中：紅樹林鱂魚（Kyptolebias marmoratus）和 橫 帶 低 紋 鮨（Hypoplectrus nigricans）[46]。 而 Kuwamur 等[48]和Maxfield等[49]對(duì)雌雄同體雌雄同步成熟魚類研究發(fā)現(xiàn)，這種類型魚類同時(shí)具有功能性的卵巢和精巢組織，并且能夠在雌雄兩個(gè)性別間多次改變性別以應(yīng)對(duì)其社會(huì)地位的變化。沖繩磨塘鱧（Trimma okinawae）是蝦虎魚科中第一種被報(bào)道的雌雄同體雌雄同步成熟魚類。Kobayashi[50]等對(duì)沖繩磨塘鱧兩種細(xì)胞色素P450芳香化酶的特性研究中發(fā)現(xiàn)，P450芳香化酶A特異地表達(dá)于卵巢組織，其轉(zhuǎn)錄水平隨著卵母細(xì)胞的生長發(fā)育顯著增高，而在卵黃發(fā)生后迅速下降。在成熟睪丸的間質(zhì)細(xì)胞中可以檢測(cè)到P450芳香化酶A轉(zhuǎn)錄本。睪丸中芳香酶的表達(dá)與斑點(diǎn)叉尾鮰、虹鱒等魚的早期發(fā)現(xiàn)一致。然而，在性腺形成方式方面，這些物種與沖繩磨塘鱧的情況是不同的。沖繩磨塘鱧的獨(dú)特之處在于，無論發(fā)育處于哪個(gè)階段，其性腺中都有卵巢和精巢。Orlando等[51]對(duì)雌雄同體紅樹林鱂魚和雄性紅樹林鱂魚芳香酶基因差異表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，芳香化酶A在雌雄同體紅樹林鱂魚的性腺的表達(dá)遠(yuǎn)高于雄性紅樹林鱂魚，證實(shí)其雌雄同體中存在卵巢組織。通過以上研究表明，cyp19a1a在雌雄同體魚類性腺的表達(dá)譜證實(shí)了性腺芳香化酶cyp19a1a表達(dá)水平不受基因型控制，而主要受調(diào)控雌雄激素的芳香化酶的支配。由于芳香化酶對(duì)魚類生殖調(diào)控和性腺發(fā)育的獨(dú)特作用，因此可以采取人工手段（采用雌激素誘導(dǎo)XY基因型蘭州鲇精巢逆轉(zhuǎn)為卵巢或者采用雄激素或芳香化酶抑制劑誘導(dǎo)XX基因型蘭州鲇卵巢轉(zhuǎn)為精巢）改變魚類體內(nèi)的芳香化酶的水平，從而獲得XY基因型的偽雌魚和XX基因型的偽雄魚，而XY基因型的偽雌魚和XY正常雄魚人工授精可產(chǎn)生YY雄魚，其和XY基因型的雌雄同體蘭州鲇一樣（雌雄同體自體精卵人工授精獲得YY雄性自我受精系）。YY雄性可直接作為父本與激素誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)的XY偽雌魚或者YY偽雌魚進(jìn)行全雄性后代的生產(chǎn)。因此，此研究為雌雄同體以及生長速度和體型性別二態(tài)性魚類在培育全雌或全雄種群提供了理論依據(jù)。

本研究首次克隆了蘭州鲇cyp19a1a基因的cDNA全長序列及其表達(dá)模式，為探討cyp19a1a基因?qū)μm州鲇性別決定與分化、性腺發(fā)育和維持以及卵母細(xì)胞生長發(fā)育過程中的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對(duì)深入了解蘭州鲇性別決定與分化、性腺發(fā)育過程及其生殖調(diào)控積累資料，為后續(xù)通過基因編輯技術(shù)對(duì)性別決定與分化相關(guān)基因cyp19a1a在蘭州鲇分子性別控制育種以及應(yīng)用激素處理誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)的方式培育全雄蘭州鲇提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。