離子液體雙水相體系結(jié)合UPLC檢測(cè)食醋中雜環(huán)胺的方法

李敏，徐東明，楊鈺雯，賀姍姍，齊改改

鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

0 引言

雜環(huán)胺(Heterocyclic Aromatic Amines, HAAs)是高蛋白類(lèi)食物在長(zhǎng)時(shí)間高溫烹飪條件下，食物中的氨基酸、糖、肌酸等前體物質(zhì)經(jīng)過(guò)美拉德反應(yīng)生成的一類(lèi)有害物質(zhì)，具有比苯并芘、黃曲霉毒素等更強(qiáng)烈的致突變性，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其分為人類(lèi)可疑致癌物(2A級(jí))和人類(lèi)潛在致癌物(2B級(jí))兩大類(lèi)，研究者至今已分離鑒定出超過(guò)30種HAAs[1-3]。HAAs在日常食用的煎炸[4-5]、燒烤[6-7]類(lèi)食品中居多，但在奶酪[8]、酒[9]、醬油[10]、食醋[10]、大氣顆粒物[11]、香煙煙氣[12]、人類(lèi)尿液[13]、水[14]等樣品中也曾檢測(cè)到。目前，HAAs的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法(UPLC)[15]、氣相色譜法[16]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[17]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[18]等。由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，HAAs含量水平很低(以ng/g計(jì))，所以在對(duì)HAAs進(jìn)行定量分析前，需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。目前，常用的HAAs預(yù)處理方法主要包括液液萃取[19]、固相萃取[20]、固相微萃取[21]等，但這些方法需使用有機(jī)溶劑，易造成環(huán)境污染。因此，亟需開(kāi)發(fā)一種綠色環(huán)保、快速高效的檢測(cè)方法，以快速評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，降低誤食HAAs的風(fēng)險(xiǎn)。

離子液體作為一類(lèi)新型的綠色溶劑，具有良好的熱穩(wěn)定性及不易揮發(fā)、液程范圍寬、性質(zhì)可調(diào)控、可再生循環(huán)使用等優(yōu)點(diǎn)[22]，基于離子液體的液相微萃取技術(shù)在物質(zhì)定量分析中成為新的發(fā)展趨勢(shì)。其中，由離子液體與雙水相萃取技術(shù)相結(jié)合形成的離子液體雙水相體系在食品、生物、環(huán)境等樣品分析預(yù)處理中顯現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。J.Han等[23]建立了1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C4MIM]BF4)結(jié)合(NH4)2SO4的離子液體雙水相體系用于萃取牛奶、蜂蜜、肉中磺胺類(lèi)藥物的方法。崔運(yùn)成等[24]建立了離子液體雙水相體系用于萃取環(huán)境水樣中痕量鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)的方法。王軍等[25]建立了由新型離子液體N-乙基-N-丁基嗎啉四氟硼酸鹽([Nebm]BF4)與KH2PO4相結(jié)合的離子液體雙水相體系用于萃取牛血清白蛋白(BSA)的方法。以上研究表明，離子液體雙水相體系是一種萃取率高、綠色環(huán)保、操作簡(jiǎn)單的樣品預(yù)處理技術(shù)，但目前尚未見(jiàn)將離子液體雙水相體系應(yīng)用于HAAs定量分析的相關(guān)報(bào)道?；诖?，本研究擬采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定離子液體雙水相體系的最佳萃取條件，并結(jié)合UPLC檢測(cè)食醋中較為常見(jiàn)的兩種HAAs(1-甲基-9H-吡啶并[3, 4-b]吲哚(Harman)和9H-吡啶并[3, 4-b]吲哚(Norharmane))，以期建立一種綠色環(huán)保、快速高效的HAAs檢測(cè)方法，為HAAs的定量分析提供新的研究思路。

1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

分別稱(chēng)取Harman和Norharmane標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，加拿大Toronto Research Chemicals公司產(chǎn)，精確至0.01 mg)于25 mL容量瓶中，用甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn))定容至刻度線，混合均勻，得到混合標(biāo)液Ⅰ，其質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL；分別吸取5.00 mL、2.50 mL、1.00 mL、0.50 mL、0.25 mL混合標(biāo)液Ⅰ于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，混合均勻，即得到一系列Harman和Norharmane的混合標(biāo)液，其質(zhì)量濃度分別為0.20 mg/mL(混合標(biāo)液Ⅱ)、0.10 mg/mL(混合標(biāo)液Ⅲ)、0.04 mg/mL(混合標(biāo)液Ⅳ)、0.02 mg/mL(混合標(biāo)液Ⅴ)、0.01 mg/mL(混合標(biāo)液Ⅵ)，于4 ℃冰箱中貯存，備用。

2 離子液體雙水相體系萃取條件的確定

下列實(shí)驗(yàn)采用的UPLC條件如下：色譜柱為Agilent ZORBAX XDB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動(dòng)相由乙腈(A)和乙酸銨-乙酸緩沖液(B，pH值為4.5)組成，且V(A)∶V(B)=1∶4；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm；流速為1 mL/min；進(jìn)樣體積為20 μL。

2.1 離子液體雙水相構(gòu)成體系的選擇

筆者考查了6種離子液體(1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽([C4MIM]Br)、1-己基-3-甲基咪唑溴鹽([C6MIM]Br)、1-辛基-3-甲基咪唑溴鹽([C8MIM]Br)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C4MIM][BF4])、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C6MIM][BF4])和1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C8MIM][BF4])，均為分析純，上海成捷化學(xué)有限公司產(chǎn))與5種無(wú)機(jī)鹽(Na2CO3、NaCl、Na2HPO4、(NH4)2SO4和K2HPO4，均為分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司產(chǎn))形成雙水相體系的情況，此時(shí)，固定離子液體用量為300 μL，K2HPO4用量為0.5 g，體系pH值為8，超聲時(shí)間為3 min。結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，[CnMIM]Br(n=4，6，8)和K2HPO4能夠快速形成界面清晰的上、下相，且形成的離子液體雙水相體系穩(wěn)定。[CnMIM]Br(n=4，6，8)和Na2CO3也能形成離子液體雙水相體系，但分層較慢且上、下兩相界面模糊。[CnMIM][BF4](n=4，6，8)和(NH4)2SO4能形成離子液體雙水相體系，但在同等條件下與[CnMIM]Br(n=4，6，8)和K2HPO4形成的離子液體雙水相體系相比，其萃取不完全、萃取量較低，這可能是因?yàn)閇CnMIM][BF4]的極性低于[CnMIM]Br，不適合萃取HAAs。因此，最終選擇[CnMIM]Br(n=4，6，8)和K2HPO4形成的離子液體雙水相體系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 雙水相體系情況

針對(duì)確定的雙水相體系，筆者采用食醋樣品中加標(biāo)(混合標(biāo)液I)的方式，固定離子液體用量為300 μL，K2HPO4用量為0.5 g，體系pH值為8，超聲時(shí)間為3 min，進(jìn)一步考查了3種含有不同烷基鏈的離子液體([C4MIM]Br、[C6MIM]Br、[C8MIM]Br)對(duì)Harman和Norharmane的萃取效果。結(jié)果顯示，[C8MIM]Br-K2HPO4離子液體雙水相體系出峰無(wú)規(guī)律，不利于Harman和Norharmane的檢測(cè)。[C4MIM]Br和[C6MIM]Br對(duì)Harman和Norharmane的萃取效果如圖1所示。由圖1可以看出，同等條件下，Harman和Norharmane的萃取量隨著烷基鏈的增加而增加。因此，最終選用[C6MIM]Br-K2HPO4形成的離子液體雙水相體系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 [C4MIM]Br和[C6MIM]Br對(duì)Harman和Norharmane的萃取效果

2.2 [C6MIM]Br用量的選擇

離子液體的用量決定著能否將食醋中的Harman和Norharmane提取完全，也是決定提取效率的關(guān)鍵因素。筆者采用食醋樣品中加標(biāo)(混合標(biāo)液Ⅰ)的方式，固定K2HPO4用量為0.5 g，體系pH值為8，超聲時(shí)間為3 min，考查了[C6MIM]Br用量(100～500 μL)對(duì)Harman和Norharmane萃取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，當(dāng)[C6MIM]Br用量為100～200 μL時(shí)，萃取量隨著[C6MIM]Br用量的增加而增加，呈正相關(guān)趨勢(shì)；當(dāng)[C6MIM]Br用量為200～400 μL時(shí)，萃取量基本保持不變；當(dāng)[C6MIM]Br用量為400～500 μL時(shí)，萃取量增加不明顯。因此，在綜合考慮萃取量、富集倍數(shù)的前提下，選擇[C6MIM]Br用量為200 μL。

圖2 [C6MIM]Br用量對(duì)Harman和Norharmane萃取效果的影響

2.3 K2HPO4用量的選擇

雙水相體系的形成依賴(lài)無(wú)機(jī)鹽的加入，無(wú)機(jī)鹽會(huì)使離子液體相析出而單獨(dú)成相，同時(shí)降低目標(biāo)物在水相中的溶解度，使目標(biāo)物轉(zhuǎn)移到富離子液體相中，從而實(shí)現(xiàn)富集、分離的目的[26]。筆者以上相與下相之比(Vupper/Vbottom)作為指標(biāo)，采用食醋樣品中加標(biāo)(混合標(biāo)液Ⅰ)的方式，固定[C6MIM]Br用量為200 μL，體系pH值為8，超聲時(shí)間為3 min，考查了K2HPO4用量(0.1～1.0 g)對(duì)Harman和Norharmane萃取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，當(dāng)K2HPO4用量為0.1～0.3 g時(shí)，不能形成離子液體雙水相體系；當(dāng)K2HPO4用量為0.5 g時(shí)，Vupper/Vbottom達(dá)到最大值。因此，選擇K2HPO4用量為0.5 g。

圖3 K2HPO4用量對(duì)Harman和Norharmane萃取效果的影響

2.4 pH值的選擇

當(dāng)目標(biāo)物為弱堿性或弱酸性物質(zhì)時(shí)，體系pH值會(huì)影響目標(biāo)物在溶液中的存在形式，進(jìn)而影響萃取效果[27-28]。HAAs是弱堿性物質(zhì)，合適的pH值有利于HAAs的萃取，進(jìn)而達(dá)到更好的萃取效果。筆者通過(guò)加入適量的氨水(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn))溶液調(diào)節(jié)離子液體雙水相體系的pH值，采用食醋樣品中加標(biāo)(混合標(biāo)液Ⅰ)的方式，固定[C6MIM]Br用量為200 μL，K2HPO4用量為0.5 g，超聲時(shí)間為3 min，考查了體系pH值(6、8、10、10.5和11)對(duì)Harman和Norharmane萃取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，當(dāng)體系pH值為10時(shí)，萃取量最大，這可能是因?yàn)镠arman的酸度系數(shù)(pKa)為8.62，Norharmane的pKa為7.85，此時(shí)Harman和Norharmane均以游離堿形式存在，利于被[C6MIM]Br萃取到離子液體雙水相體系的上相。而當(dāng)體系pH值>10時(shí)，萃取量反而下降，這可能是因?yàn)轶w系中堿性過(guò)強(qiáng)會(huì)破環(huán)離子液體的結(jié)構(gòu)而降低離子液體的萃取容量。因此，選擇pH值為10。

圖4 pH值對(duì)Harman和Norharmane萃取效果的影響

2.5 超聲時(shí)間的選擇

超聲時(shí)間的長(zhǎng)短也會(huì)影響目標(biāo)物的萃取量，超聲時(shí)間太短易導(dǎo)致萃取不完全，超聲時(shí)間太長(zhǎng)又會(huì)造成資源的浪費(fèi)。筆者采用食醋樣品中加標(biāo)(混合標(biāo)液Ⅰ)的方式，固定[C6MIM]Br用量為200 μL，K2HPO4用量為0.5 g，體系pH值為10，考查了超聲時(shí)間(1 min、3 min、5 min、7 min和9 min)對(duì)Harman和Norharmane萃取效果的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，超聲時(shí)間對(duì)Harman和Norharmane的萃取效果影響不明顯。綜合考慮選擇超聲時(shí)間為3 min。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化

為了繼續(xù)探究Harman和Norharmane的最佳萃取條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用食醋樣品中加標(biāo)(混合標(biāo)液Ⅰ)的方式，進(jìn)一步以Harman、Norharmane萃取量為考查指標(biāo)，選擇[C6MIM]Br用量(A)、K2HPO4用量(B)、pH值(C)3個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3和表4。由表3和表4可知，影響Harman萃取量的主次因素依次為[C6MIM]Br用量、K2HPO4用量、pH值，最佳萃取條件組合為A2B1C2；影響Norharmane萃取量的主次因素和最佳萃取條件組合均與Harman相同。因此，確定Harman、Norharmane的最佳萃取條件為[C6MIM]Br用量200 μL，K2HPO4用量0.5 g，pH值10。

表2 正交試驗(yàn)因素和水平表

表3 Harman正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 Norharmane正交試驗(yàn)結(jié)果

3 離子液體雙水相體系結(jié)合UPLC檢測(cè)方法的建立

經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出離子液體雙水相體系最優(yōu)條件，其萃取過(guò)程如下：吸取1 mL食醋(購(gòu)自鄭州市某超市，調(diào)節(jié)其pH值為10)于2 mL離心管中，依次加入200 μL離子液體溶液(準(zhǔn)確稱(chēng)取10.00 g離子液體，用水溶解后，定容至10 mL容量瓶中)和0.5 g K2HPO4，渦旋混溶后，置于數(shù)控超聲波清洗器(KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn))中超聲3 min。然后將離心管置于離心機(jī)中，于8000 r/min條件下離心2 min，用微量注射器吸取富離子液體相(上相)并記錄其體積，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾至樣品瓶中，待測(cè)。采用UPLC檢測(cè)待測(cè)樣品，即得檢測(cè)食醋中Harman和Norharmane的方法。

4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限

取各個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)液Ⅰ～Ⅵ進(jìn)行UPLC檢測(cè)(進(jìn)樣量均為20 μL)，以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Harman的線性方程為y=185.3x+230.5，線性范圍為10.0～400.0 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5，；Norharmane的線性方程為y=162.1x+199.0，線性范圍為10.0～400.0 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5。結(jié)果表明，在設(shè)定的范圍內(nèi)，Harman和Norharmane的質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。將Harman和Norharmane混合標(biāo)液Ⅰ逐級(jí)稀釋并進(jìn)行UPLC檢測(cè)，直到測(cè)定的信噪比(S/N)=3時(shí)即為檢出限(LODs)，S/N=10時(shí)為定量限(LOQs)。結(jié)果顯示，Harman的LODs為0.50 μg/mL，LOQs為0.67 μg/mL；Norharmane的LODs為0.45 μg/mL，LOQs為0.64 μg/mL。

4.2 精密度評(píng)價(jià)

使用微量進(jìn)樣器精確量取30 μL Harman和Norharmane混合標(biāo)液Ⅰ，采用優(yōu)化后的離子液體雙水相體系進(jìn)行萃取。吸取20 μL上相進(jìn)行UPLC檢測(cè)，1 d內(nèi)平行檢測(cè)6次，根據(jù)峰面積計(jì)算日內(nèi)精密度；保持該方法不變，1 d 1次連續(xù)測(cè)定6 d，根據(jù)峰面積計(jì)算日間精密度。Harman和Norharmane日內(nèi)精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均為0.04%，日間精密度的RSD均為1.4%，表明優(yōu)化后的檢測(cè)方法精密度良好。

4.3 重復(fù)性評(píng)價(jià)

取同一批食醋樣品6份，采用優(yōu)化后的離子液體雙水相體系進(jìn)行預(yù)處理，吸取20 μL上相進(jìn)行UPLC檢測(cè)，記錄Harman和Norharmane的峰面積，并計(jì)算其RSD。Harman和Norharmane精密度的RSD均小于3%，表明優(yōu)化后的檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

4.4 回收率評(píng)價(jià)

在6份食醋樣品中分別加入20 μL、25 μL和30 μL的Harman和Norharmane混合標(biāo)液I，采用優(yōu)化后的離子液體雙水相體系進(jìn)行萃取，上相經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾至樣品瓶中，進(jìn)行UPLC檢測(cè)(進(jìn)樣量為20 μL)。Harman和Norharmane的加樣回收率為74.5%～96.3%，RSD為0.5%～2.5%，表明優(yōu)化后的檢測(cè)方法回收率良好。

4.5 方法驗(yàn)證分析

使用本文檢測(cè)方法分別對(duì)超市4種食醋中的Harman和Norharmane進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出Harman和Norharmane。在后期研究中，還應(yīng)增加所檢測(cè)HAAs的種類(lèi)，隨機(jī)抽查多個(gè)食醋樣本，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

5 結(jié)論

本文建立了一種離子液體雙水相體系結(jié)合UPLC快速檢測(cè)食醋中Harman和Norharmane的方法，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了離子液體雙水相體系的最佳萃取條件：選用[C6MIM]Br-K2HPO4為離子液體雙水相體系，[C6MIM]Br用量為200 μL，K2HPO4用量為0.5 g，pH值為10，超聲時(shí)間為3 min。在此條件下，Harman和Norharmane的線性范圍均為10.0～400.0 μg/mL，LODs分別為0.50 μg/mL和0.45 μg/mL，精密度、重復(fù)性和回收率均良好。該方法不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑，具有綠色環(huán)保、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可為HAAs的定量檢測(cè)分析提供新的研究思路。由于食醋中HAAs的來(lái)源及形成機(jī)制尚無(wú)定論，本研究結(jié)果還可為進(jìn)一步研究食醋中HAAs來(lái)源與致癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系、HAAs的減控措施提供參考。