中藥祛痘1號軟膜對金黃地鼠皮脂腺增生及其功能的影響

闕 雷，石紅喬，彭 陶，魏躍鋼

(1.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院 南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

中醫(yī)學認為，痤瘡是由于肺胃積熱，長期不愈，氣機不暢，而使痰濕內(nèi)生，血行瘀滯產(chǎn)生的皮膚疾患。南京市中醫(yī)院皮膚科治療室運用中藥祛痘1號軟膜外敷治療痤瘡多年，取得較好的療效。該軟膜中藥成分是在古方“顛倒散”的基礎上辨證加減。軟膜組成為中藥粉及軟膜基質(zhì)。為了進一步探索本藥治療痤瘡的原理，本研究通過動物實驗觀察該藥對金黃地鼠背部皮脂腺斑組織大小、微觀結構及增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)表達的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 采用8周齡的雄性金黃地鼠(維通利華實驗動物技術有限公司)，清潔級，體重80～120 g；南京中醫(yī)藥大學動物實驗倫理批準(202012A021)。

PCNA(Affinity，AF0239)，PI3K抗體(Proteintech，20584-1-AP)，Akt抗體(Abcam，Ab-8805)，DAB(Dako Denmark，K3468)；中藥祛痘1號軟膜的中藥由黃連、大黃、茯苓、虎杖、苦參、丹參、血竭、硫磺組成，均采購于南京市中醫(yī)院中藥房。軟膜制備方法：以上八味藥物均取干燥藥材，按照3∶5∶5∶5∶5∶5∶2∶2的質(zhì)量比例混合，研成細粉，過300目篩。軟膜基質(zhì)是以海藻酸鈉粉、磷酸鎂粉、氯化鈣粉及生粉按比例混合而成。中藥粉和面膜基質(zhì)按質(zhì)量1∶9的比例混合備用；維胺酯維E乳膏(國藥準字H20059598)；游標卡尺(上海恒量量具)，顯微鏡(NIKON，H550S)，成像系統(tǒng)(NIKON，DS-RI2)。

1.2 動物模型制備與分組干預 選取金黃地鼠背部皮脂腺斑塊作為痤瘡模型，將32只雄性金黃地鼠適應性飼養(yǎng) 1 周后，分為四組。空白組：予0.9%氯化鈉溶液每日1次搽拭皮脂腺斑塊；軟膜基質(zhì)組：予基質(zhì)外敷30 min后擦去；中藥軟膜組：予以中藥軟膜外敷30 min后揭去；陽性對照組：予維胺酯維E乳膏每日1次外用。在干預后第15天，進行指標檢測。

1.3 皮脂腺斑面積測量 首次藥物干預前及末次藥物干預1 d后，用剃刀剃光金黃地鼠背部雙側毛發(fā)，充分暴露皮脂腺斑，在光線充足的環(huán)境下，利用游標卡尺測量皮脂腺斑塊的最大橫徑(DT)和最大縱徑(DL)，兩個數(shù)值相乘，分別計算出雙側皮脂腺斑的面積。皮脂腺面積=DT(mm)×DL(mm)。

1.4 HE染色觀察皮脂腺斑病理結構 在藥物干預后第15天，將動物處死，取金黃地鼠背部皮脂腺斑組織，4%多聚甲醛固定后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片行HE染色，顯微鏡下觀察皮脂腺大小、厚度及松散程度。

1.5 免疫組化檢測皮脂腺斑PCNA、PI3K、Akt表達 將制備的皮脂腺斑組織切片先后進行脫蠟、水化、抗原修復、封閉、分別予以PCNA、PI3K、Akt一抗孵育、相應種屬的二抗孵育后，進行DAB顯色反應，鏡下觀察各組表達情況。

2 結 果

2.1 各組金黃地鼠皮脂腺斑面積比較 見表1。干預前各組皮脂腺斑面積比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在干預第8天時，各組面積比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在干預第15天時，中藥軟膜組和陽性對照組的同側皮脂腺斑面積小于空白組、軟膜基質(zhì)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 中藥軟膜組和陽性對照組皮脂腺斑的面積相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 各組金黃地鼠雙側皮脂腺斑面積比較(mm2)

2.2 各組金黃地鼠組織病理學表現(xiàn) 空白組：金黃地鼠皮脂腺呈分葉狀分布，腺體飽滿，數(shù)量多，排列緊密而厚；軟膜基質(zhì)組：部分皮脂腺較大，排列緊厚；中藥軟膜組：皮脂腺腺體厚度較空白組變薄，腺體體積變小，排列疏松；陽性對照組：皮脂腺腺體萎縮，數(shù)量少。中藥軟膜組的腺體排列較空白組、軟膜基質(zhì)組松散，腺體變小且數(shù)目減少，與陽性對照組效果接近(圖1)。

圖1 各組金黃地鼠皮脂腺組織病理學表現(xiàn)(HE染色)

2.3 各組金黃地鼠PCNA蛋白表達情況 PCNA蛋白是細胞增殖狀態(tài)的觀察指標，定位在細胞核的位置，陽性細胞的細胞核呈現(xiàn)棕黃色。每張切片任意選取 5 個陽性區(qū)域的高倍視野。與空白組、軟膜基質(zhì)組相比較，中藥軟膜組和陽性對照組整體PCNA的表達都有所下降，其中陽性對照組更為明顯。空白組與軟膜基質(zhì)組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；中藥軟膜組、陽性對照組皮脂腺斑PCNA表達比空白組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中藥軟膜組和陽性對照組PCNA表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 見圖2(表2)。

圖2 各組金黃地鼠皮脂腺PCNA免疫組化染色

表2 各組金黃地鼠皮脂腺PCNA免疫組化染色OD值

2.4 各組金黃地鼠PI3K、Akt的蛋白表達情況 PI3K、Akt抗體的染色定位在細胞核及細胞漿，呈現(xiàn)棕黃色的即陽性細胞。通過DAB顯色反應，鏡下觀察可見空白組和軟膜基質(zhì)組的陽性細胞數(shù)量多于中藥軟膜組和陽性對照組，并且顏色深，面積大。與空白組、軟膜基質(zhì)組相比較，中藥軟膜組和陽性對照組整體PI3K、Akt的蛋白表達都有所下降，其中陽性對照組更為明顯(圖3、4)。

圖3 各組金黃地鼠皮脂腺PI3K免疫組化染色

3 討 論

現(xiàn)代研究顯示，雄激素作用下皮膚的皮脂腺及其調(diào)控分泌的脂質(zhì)功能異常，以及微生物感染等因素是引發(fā)痤瘡的機制之一[1-3]。研究結果顯示多條通路與脂質(zhì)代謝有關，這些通路的激活能引起脂質(zhì)的異常分泌。膽固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白(SREBP)是可以影響脂質(zhì)代謝的重要因子[4-5]，該因子可以調(diào)節(jié)下游多種脂質(zhì)合成酶基因的表達，從而能夠影響脂質(zhì)代謝[6-7]。

黃秋紅等[8]通過雄激素激活HaCaT細胞的SREBP信號通路，再運用PI3K/Akt通路抑制劑干預，研究結果顯示PI3K/Akt信號通路在雄激素激活HaCaT細胞的SREBP信號通路過程中起到重要作用。丁暢等[9]研究發(fā)現(xiàn)通過荷葉堿的干預，可以抑制細胞的PI3K/Akt/mTOR通路，達到降低細胞內(nèi)脂質(zhì)的合成。在眾多與脂質(zhì)代謝相關聯(lián)的因素中，PI3K/Akt信號通路是重要的一個部分，該通路與細胞的增殖、代謝過程有著緊密的關系[10]。因此，我們可以通過藥物干預皮脂腺細胞中PI3K/Akt通路，調(diào)節(jié)皮脂合成和分泌，從而達到治療痤瘡的目的。PCNA存在于正常增殖細胞及腫瘤細胞內(nèi)，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標[11]。在痤瘡患者的皮損中，炎性細胞的浸潤和微生物的感染，均可能引起皮脂腺細胞增殖，激活PCNA。在本研究中，我們通過觀察中藥軟膜干預前后皮脂腺組織細胞PCNA表達情況變化，以研究中藥1號祛痘軟膜的療效是否跟感染細胞DNA增殖有關系。

研究選擇金黃地鼠作為動物實驗對象，是因為其背部的皮脂腺斑是天然的研究皮脂腺功能的動物模型，該模型也被國內(nèi)外認可[12]。顧煒等[13]在研究藥物對皮脂腺功能影響時，也曾采用金黃地鼠背部的皮脂腺斑作為動物模型，取得較好的觀察效果。對照組藥物維胺酯維E軟膏是臨床治療尋常痤瘡的常用藥物，其藥物功效包括可以抑制皮膚的脂質(zhì)分泌。

中醫(yī)學一般認為痤瘡多與肺胃積熱有關，若長期不愈，則氣機不暢，易導致痰濕內(nèi)生，血行瘀滯。祛痘1號軟膜的中藥組方在臨床已經(jīng)使用多年，前期曾有過臨床研究資料。張倩等[14]也曾觀察過此中藥組方的散劑治療尋常痤瘡的臨床療效，取得了滿意的效果。

中藥組方中大黃清熱瀉火、祛瘀解毒，為君藥。黃連清熱解毒，苦參清熱燥濕，為臣藥?；⒄壤麧瘛⑸?，血竭、丹參皆能活血化瘀、止痛，茯苓健脾除濕，硫磺則具有解毒殺蟲之效，共為佐藥。而很多現(xiàn)代研究結果也表明，中藥在抑制痤瘡丙酸桿菌、抑制皮脂分泌等方面有著很好的效果。現(xiàn)代藥理研究證實：黃連提取物可抗炎抑菌;大黃具有廣譜抗菌和免疫調(diào)節(jié)的作用[15-16]；硫磺與人體皮膚分泌物作用生成硫化物，可起到軟化皮膚角質(zhì)，抑制皮脂的功效[17]。有現(xiàn)代醫(yī)學研究報道黃芩苷等藥物可抑制皮脂腺細胞的活性[18-19]。本研究的軟膜屬膠膜型面膜，軟膜的成型原理是將溶于水的海藻酸鈉與鎂鹽作用，變成不溶于水的海藻酸鎂[20]。在用水調(diào)和軟膜粉外敷在痤瘡部位時，可以控制水分緩緩釋放，加強皮膚的水合作用，促進中藥成分的透皮吸收，增加治療效果。

在實驗結果中，我們發(fā)現(xiàn)與空白組和軟膜基質(zhì)組相比，中藥軟膜組的大鼠背部皮脂腺斑塊面積明顯縮小，皮脂腺厚度變薄，腺體體積變小，排列疏松。其PCNA表達降低，凋亡增加，也說明了皮脂腺細胞的增殖受到抑制。PI3K、Akt表達下調(diào)，提示了中藥1號軟膜治療痤瘡的機制，可能跟對PI3K/Akt通路的抑制有關聯(lián)。而這幾項觀察指標結果中，中藥1號祛痘軟膜組和陽性對照組相接近。綜上所述，中藥祛痘1號軟膜可有效抑制皮脂腺增生，為軟膜用于臨床治療痤瘡提供實驗室依據(jù)。