中藥復(fù)方糖耐康對KKAy糖尿病小鼠低度炎癥信號通路的影響

王 芬,何華亮,劉銅華,吳麗麗

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.解放軍武裝警察部隊(duì)北京市總隊(duì)醫(yī)院，北京 100027；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

2型糖尿病(Diabetes mellitus type 2,T2DM)已經(jīng)成為全球面臨的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。近年來，全球糖尿病的醫(yī)療成本至少是人均醫(yī)療保健支出的3.2倍，糖尿病并發(fā)癥的醫(yī)療成本較前上升到9.4倍[1]。同時(shí)，隨著與2型糖尿病發(fā)病密切相關(guān)的超重和肥胖的增長，該病已成為未來代謝性疾病發(fā)展趨勢更嚴(yán)重的預(yù)測代表[2-3]。目前已公認(rèn)，機(jī)體的慢性低度炎癥反應(yīng)不僅參與肥胖的病理過程，也是2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制之一。許多研究表明[4]，肥胖和T2DM患者的C-反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和單核細(xì)胞趨化因子1(MCP-1)等細(xì)胞因子的水平均有所升高；炎癥在T2DM的發(fā)病機(jī)制中起媒介作用[5]。此外，針對改善全身促炎細(xì)胞因子水平，如NF-κB途徑，有可能恢復(fù)胰島素敏感性和改善血糖水平[6-7]。其中，以Toll樣受體系列(TLR)為代表的炎癥反應(yīng)的啟動因子，在激活免疫細(xì)胞后，加劇原炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，繼而激活應(yīng)激激酶如IKK和JNK等，使它們磷酸化胰島素受體底物-1(IRS-1)，起到阻止胰島素受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并引發(fā)胰島素抵抗的作用[8]。因此，雖然2型糖尿病發(fā)病是由代謝失調(diào)引起，但已有學(xué)者建議將其視為一種自身炎癥性疾病[9]。

結(jié)合中醫(yī)藥在2型糖尿病及代謝異常干預(yù)的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)其有巨大的研究潛力。中藥復(fù)方糖耐康是治療2型糖尿病經(jīng)驗(yàn)方，主要針對消渴病燥熱內(nèi)盛、氣陰虧虛的病機(jī)，是在辨證論治基礎(chǔ)上結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)及藥理研究成果組方而成。前期研究結(jié)果表明，該方具有明確的改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖脂代謝、調(diào)節(jié)腸道菌群的作用[10]。為了進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，本項(xiàng)研究選取低度炎癥信號通路部分關(guān)鍵靶點(diǎn)作為觀察指標(biāo)，旨在明確其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物及飼料：SPF 級雄性 KKAy 小鼠 65 只及 C57BL/6J 小鼠 13 只，均購自北京華阜康生物科技有限股份公司[動物許可證號:SCXK(京)2014-0004]，10 周齡，體重(35.5±3.0)g。小鼠在無特定病原體(SPF級)條件下飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠飼養(yǎng)條件:溫度 (21±2) ℃，濕度 (60±10) %，12 h /12 h 光照黑暗循環(huán)。整體實(shí)驗(yàn)均已通過中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所的動物實(shí)驗(yàn)倫理會審查 (編號2018-013)，均符合實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的相關(guān)指導(dǎo)原則。動物喂養(yǎng)普通飼料及高脂飼料(豬油 10%、蛋黃粉 10%、普通飼料 80%)均由華阜康生物科技股份有限公司提供，在干燥、通風(fēng)環(huán)境儲存。

1.1.2 藥品及試劑:糖耐康顆粒由北京中醫(yī)藥大學(xué)藥廠制備，該顆粒由以下藥物按照 1∶4∶2∶4∶2 比例組成，包括人參、夏枯草、女貞子、番石榴葉、三白草。3 g/袋，顆粒與生藥比按1∶3.61當(dāng)量換算。用藥前以蒸餾水配制，4 ℃ 保存。

TNF-α 酶聯(lián)免疫試劑盒、IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒、MCP-1酶聯(lián)免疫試劑盒(批號L150715400)。Formamide 去離子甲酰胺(批號37B00160)、2×Taq PCR Green Mix(批號55H001200)、核酸染料(批號54D00150)。蛋白質(zhì)分子量Marker(美國 Bio-rad，批號310007919)，感光膠片(美國柯達(dá)，批號020901701)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號129736)，PVDF膜(德國 Millipore，批號K1EA1531FK)，ECL(美國Santa Cruz公司，批號I2608)，蛋白酶抑制劑(瑞典 Roche，批號19987900)，NF-κB兔來源的多克隆抗體(美國 Abcam公司，批號GR3236514-1)。

1.1.3 儀器：穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(Bio-Rad Powerpac HQ，USA)，垂直電泳槽(Bio-Rad MP3，USA)，Agilent 2100 生物分析儀 (Agilent Technologies,USA)，電子天平(Sartouris BS224S，GER)，紫外分光光度計(jì)，HiSeq2500 型高通量測序儀(美國Illumina公司)，Qubit 2.0 Fluorometer(Invitrogen,Carlsbad,CA)，IlluminaMiSeq儀器，3K15 型高速低溫離心機(jī)(美國Sigma公司)，T100 型梯度 PCR儀(美國Bio-Rad公司)，微量加樣器，DL-CJ-2NDI 型超凈工作臺(中國東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad Trans-Blot SD，USA)，計(jì)算機(jī)圖像分析儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模、分組及給藥：所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，設(shè)雄性C57BL/6J小鼠為正常組，給予普通飼料喂養(yǎng)；雄性KKAy小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)2周后，平均隨機(jī)血糖≥13.9 mmol/L，均為成模小鼠，共65只。按體重及隨機(jī)血糖隨機(jī)分為六組，正常組，阿卡波糖組(3.9 mg/kg)，糖耐康高、中、低劑量組(4.68、2.34、1.17 g/kg)及模型組(0.9%氯化鈉溶液20 ml/kg)，每組13只。給藥組均按0.01 ml/g的劑量標(biāo)準(zhǔn)灌胃給藥1次，正常組、模型組給予相同劑量的0.9% 氯化鈉溶液，共連續(xù)8周。每周均監(jiān)測并記錄血糖及體重。飼養(yǎng)過程中，全程自由取食、飲水。其中糖耐康中劑量組及模型組各死亡3只，每組各取10只取材。第8周，末次給藥后禁食不禁水10 h，予摘除眼球取血，平均約1 ml/只，分離血清備用。

1.2.2 血糖及體重檢測：觀察小鼠一般情況。在藥物干預(yù)期間，分別于第 0、4、8 周，在禁食 6 h 后，采用血糖儀尾靜脈取血法測定血糖；每周同一時(shí)間于清晨7時(shí)測量小鼠體重并記錄。

1.2.3 ELISA及Western blot檢測：半定量檢測血漿中 TNF-α 及 IL-1β、MCP-1的水平。每組各取6只檢測MCP-1。各項(xiàng)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

每組各4只采用Western blot法檢測肌肉組織NF-κB的蛋白表達(dá)水平。SDS-PAGE 蛋白垂直電泳:上樣量約40 μg，90 V 45 min濃縮，150 V 80 min 電泳分離。轉(zhuǎn)膜:按照海綿、濾紙、凝膠、PVDF 膜、濾紙、海綿依次順序裝好轉(zhuǎn)膜裝置120 V、150 mA轉(zhuǎn)膜60 min。封閉:15 ml Blocking buffer TTBS 37 ℃ 輕搖 1 h。NF-κB一抗(1∶2000)、GAPDH為內(nèi)參(1∶5000)。4 ℃孵育過夜，洗膜，加二抗，NF-κB二抗(1∶2000)、GAPDH為內(nèi)參(1∶3000)。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，Storm 掃描，對掃描圖像測特異蛋白條帶的灰度值。以β-actin 為內(nèi)參照，每個(gè)樣品重復(fù)測量 3 次。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況及治療前后體重變化 正常組小鼠體型適中，行動敏捷，毛色光亮，活動自如。KKAy 組小鼠形體肥胖，活動少，動作遲緩，攝食量及飲水量均增多。灌胃后期出現(xiàn)毛色凌亂、豎毛、動作緩慢、反應(yīng)遲鈍。

模型組與各給藥組均有不同程度體重上升，考慮與其高脂飼料喂養(yǎng)有關(guān)。與模型組比較，給藥組在降低體重方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與阿卡波糖組比較，糖耐康各劑量組的體重控制趨勢較為明顯。見表1。

表1 各組小鼠治療前后體重比較(g)

2.2 各組小鼠治療前后血糖變化比較 中藥復(fù)方糖耐康能夠明顯改善2型糖尿病小鼠血糖，糖耐康高劑量組與模型組血糖比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠治療前后血糖變化比較(mmol/L)

2.3 各組小鼠TNF-α、IL-1β 水平比較 阿卡波糖組和糖耐康高劑量組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明其具有明確的下調(diào)作用，其余給藥組均有一定的下調(diào)趨勢，見表3。

表3 各組小鼠 TNF-α、IL-1β 水平比較(ng/L)

2.4 各組小鼠MCP-1水平比較 對于MCP-1水平，糖耐康高劑量組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組小鼠MCP-1水平比較(pg/ml)

2.5 各組小鼠胰腺組織 MCP-1 病理學(xué)變化比較 胰腺胰島及腺泡細(xì)胞均著色，其中模型組染色陽性表達(dá)最強(qiáng)，其他用藥組均弱于模型組，糖耐康高劑量組染色弱陽性表達(dá)，正常組表達(dá)最弱(圖1)。

A：正常組；B：模型組；C：阿卡波糖組；D：糖耐康高劑量組；E：糖耐康中劑量組；F：糖耐康低劑量組

2.6 各組小鼠NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較 與模型組比較，阿卡波糖組與糖耐康高劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具有明確的下調(diào)作用，其余給藥組均有一定的下調(diào)趨勢，見表5(圖2)。

表5 各組小鼠NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較

1：正常組;2：模型組;3：阿卡波糖組;4：糖耐康高劑量組;5：糖耐康低劑量組;6：糖耐康中劑量組

3 討 論

隨著糖尿病發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，諸多證據(jù)表明，低度炎癥學(xué)說的分量在該疾病的發(fā)病機(jī)制中占比日益劇增。已有人強(qiáng)烈呼吁將抗炎劑納入2型糖尿病的治療方案中[11]。已證實(shí)，在炎癥信號通路中，對于肥胖和T2DM患者，其脂肪組織中TNF-α 水平及生物活性較高[12-13]，肥胖會導(dǎo)致脂肪分解和大量促炎性FFA釋放，增加局部炎性因子，促進(jìn)胰島素抵抗[14]?，F(xiàn)已明確其能夠通過抑制脂肪、肌肉組織上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制胰島素敏感性，加速胰島素抵抗進(jìn)而影響葡萄糖的正常代謝途徑，以促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生。IL-1β是最早出現(xiàn)的炎癥因子之一[15]，屬于多效性細(xì)胞因子[16]，MCP-1則是較為年輕的一種趨化細(xì)胞因子。機(jī)體炎性因子水平升高，可激發(fā)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量 MCP-1[17]。同時(shí)，高糖及低密度脂蛋白也可明顯刺激系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等[18]，改變細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/c-Jun N 末端激酶和 NF-κB 的相關(guān)信號 CCR2的獨(dú)立表達(dá)分泌 MCP-1，使血管內(nèi)皮更易受損[19]。因此控制MCP-1水平有助于改善肥胖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[20]。另外，脂多糖作為炎性反應(yīng)的啟動因子，也能夠通過NF-κB信號通路調(diào)控下游各種細(xì)胞因子，尤其是炎性因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[21-22]。故加強(qiáng)抑制NF-κB信號通路及炎性因子的水平能夠在一定程度上阻斷該通路介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)、延緩糖尿病的發(fā)展[23]。我們的研究結(jié)果提示，中藥復(fù)方糖耐康能夠明顯降低2型糖尿病小鼠空腹血糖水平，降低體重增長的趨勢。對比模型組，阿卡波糖組與糖耐康高劑量組能夠下調(diào)炎性因子TNF-α、IL-1β、MCP-1及NF-κB蛋白表達(dá)水平，抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)，減緩炎癥狀態(tài)。

中藥復(fù)方糖耐康由夏枯草、番石榴葉、三白草、女貞子及人參五味中藥組成。方中夏枯草味苦性寒，具有清肝火散郁結(jié)之功，為君藥。針對消渴病氣郁熱盛的病機(jī)。臣藥番石榴葉、三白草為民間地方藥材。其中番石榴葉味甘、澀，性平，具有甘平養(yǎng)胃、生津止渴、斂澀固陰之效。廣西醫(yī)學(xué)院糖尿病課題組曾發(fā)現(xiàn)其對正常人及糖尿病患者有確切降糖作用，從藥理研究證實(shí)它能夠改善糖尿病胰島素抵抗[24]。三白草味甘、辛，性寒，具有清熱解毒、利水消腫的功效。以上君、臣藥針對胰島素抵抗“實(shí)”證燥/熱的病理基礎(chǔ)。佐藥人參、女貞子益氣養(yǎng)陰、生津止渴。人參主治虛勞、消渴及氣血津液不足之證。女貞一味，培補(bǔ)肝腎之陰以充先天之本。綜觀全方，從上、中、下三焦入手，顧肺、脾(胃)、腎(肝)三臟之本。清中寓補(bǔ)，泄中有收，標(biāo)本兼顧，共奏清熱生津、益氣養(yǎng)陰之效。正對糖尿病前期胰島素抵抗的主要證候?qū)W特點(diǎn)之一。

本研究選取自發(fā)性2型糖尿病動物模型KKAy小鼠，其遺傳特性和病程發(fā)展特點(diǎn)與人類糖尿病類似，環(huán)境因素易控制，個(gè)體差異性較小[25]，并有較為成熟的技術(shù)支持，在實(shí)踐過程中得到較好的論證，是研究該疾病理想的動物模型。

本研究結(jié)果證實(shí)，中藥復(fù)方糖耐康具有明確地降低 2 型糖尿病 KKAy 小鼠的體重趨勢及血糖水平。抑制 TNF-α、IL-1β水平，抑制 MCP-1 及 NF-κB 蛋白的表達(dá)水平。其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)炎癥信號通路中上述關(guān)鍵靶點(diǎn)水平，減輕低度炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)及2型糖尿病的作用。該結(jié)論為進(jìn)一步加強(qiáng)中醫(yī)藥防治糖尿病的研究提供依據(jù)。