毛細(xì)管多重電泳技術(shù)鑒定水稻種子純度研究

范家萌，王至嚴(yán)，林慧慧，周桂林，王浩波

(合肥豐樂(lè)種業(yè)股份有限公司，農(nóng)作物種子新技術(shù)與新品種創(chuàng)制安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230088)

品種純度是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，品種純度鑒定包括田間鑒定和室內(nèi)鑒定2種方法。田間鑒定是在作物生育期間，結(jié)合檢查病蟲(chóng)雜草以及田間生育狀況和倒伏情況對(duì)田間進(jìn)行品種純度檢驗(yàn)，耗時(shí)費(fèi)力。室內(nèi)純度鑒定目前主要是SSR分子標(biāo)記鑒定。SSR分子標(biāo)記技術(shù)是一種基于擴(kuò)增PCR和微衛(wèi)星定位的DNA特性的標(biāo)記技術(shù)，微衛(wèi)星DNA的長(zhǎng)度呈現(xiàn)高度變異，但是其兩側(cè)的堿基序列高度保守，因此可以根據(jù)保守序列，設(shè)計(jì)引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度多態(tài)性，揭示不同的個(gè)體或品種間的遺傳差異。該技術(shù)一直以高效、準(zhǔn)確可靠、不受環(huán)境影響等優(yōu)勢(shì)而得到廣泛應(yīng)用。

分子標(biāo)記鑒定的效率和成本主要取決于PCR產(chǎn)物電泳所用儀器及電泳方法。目前分子標(biāo)記鑒定技術(shù)中電泳分析環(huán)節(jié)包括3種途徑：①聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)；②ZAG單色毛細(xì)管電泳儀電泳；③DNA分析儀的熒光電泳。其中PAGE操作復(fù)雜、分辨率不高、效率低；在試驗(yàn)操作過(guò)程中會(huì)有試劑污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)員及實(shí)驗(yàn)室安全衛(wèi)生都有不同程度的影響。DNA分析儀的熒光電泳由于儀器和試劑價(jià)格昂貴，運(yùn)行成本高，在商業(yè)化應(yīng)用中受到極大限制。ZAG單色毛細(xì)管電泳儀以進(jìn)樣量少、分析速度快、分離效率高、有機(jī)溶劑少、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、高分子等領(lǐng)域，但由于是單色熒光顯色，試劑耗材依靠廠家提供，造成單重電泳的使用成本偏高。筆者擬采用混合不同片段大小的PCR產(chǎn)物進(jìn)行多重電泳，以提高試劑耗材的利用率，進(jìn)一步提升ZAG單色毛細(xì)管電泳儀的使用效能。

1 材料與方法

試驗(yàn)品種。隨機(jī)選用合肥豐樂(lè)種業(yè)股份有限公司2021年生產(chǎn)的雜交水稻品種豐兩優(yōu)3305與常規(guī)稻品種潤(rùn)稻118。

試劑來(lái)源。PCR反應(yīng)所用Buffer、DNTP等試劑購(gòu)于上海生工生物工程有限公司，引物合成于安徽通用生物科技有限公司，酶購(gòu)于艾科瑞生物科技有限公司，試驗(yàn)耗材購(gòu)于合肥舜田實(shí)驗(yàn)部。

主要儀器設(shè)備。T100型梯度PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rad Laboratories，Inc.)公司；Nanodrop 2000C 型核酸蛋白分析儀，美國(guó)熱電公司；ZAG-Z7576毛細(xì)管電泳儀，Agilent公司生產(chǎn)。

DNA快速提取及質(zhì)量檢測(cè)。每個(gè)品種隨機(jī)取96株幼苗，每株幼苗取0.8 cm×0.8 cm大小的樣品，放入PCR板中，加入0.25 mol/L NaOH溶液20 μL，放進(jìn)水浴鍋中99 ℃煮2 min，然后加入0.25 mol/L Tris-HCl溶液30 μL后冷卻。用核酸蛋白分析儀檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量，DNA濃度在15～50 ng/μL，DNA質(zhì)量在1.8～2.0。

PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序。PCR反應(yīng)體系(10 μL)：DNA模板2.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddHO 4.5 μL，PCR Master Mix 2.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；然后每個(gè)循環(huán)變性：94 ℃15 s，退火55 ℃30 s，延伸72 ℃ 30 s。循環(huán)次數(shù)32次，72 ℃保溫10 min。

SSR分子標(biāo)記引物選擇。根據(jù)GB/T 39917—2021《主要農(nóng)作物真實(shí)性和純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè) 稻》中推薦的8對(duì)候選引物，參照豐兩優(yōu)3305的指紋圖譜，找到豐兩優(yōu)3305雙親帶型有差異的引物，分別是RM336、RM208、RM224、RM8277、RM19，在RM19標(biāo)記位點(diǎn)上的指紋是245/251，父母本差異偏小，排除該標(biāo)記位點(diǎn)，用RM224、RM8277、RM336、RM208進(jìn)行純度鑒定并組合雙重電泳。根據(jù)潤(rùn)稻118品種的SSR分子標(biāo)記上的帶型，選擇多態(tài)性較好且產(chǎn)物片段大小差異較大的3個(gè)引物RM224、RM8277、RM19進(jìn)行SSR分子標(biāo)記純度鑒定(表1)。

毛細(xì)管電泳。

普通單重毛細(xì)管電泳。將96孔PCR產(chǎn)物加buffer定容至25 μL，打開(kāi)ZAG軟件后，選擇樣品托盤(pán)Sample tray→ 添加托盤(pán)Add tray to queue → 選擇跑膠模式(1板費(fèi)膠模式+8板省膠模式)→ 點(diǎn)擊Edit更改電泳參數(shù)，一般設(shè)置電壓4～5 kV，室溫高于25 ℃時(shí)，每板電泳時(shí)間在50 min左右，溫度越低，電泳時(shí)間越長(zhǎng)。更改參數(shù)后之后點(diǎn)擊OK，在待電泳界面點(diǎn)擊綠色運(yùn)行標(biāo)識(shí)即可進(jìn)行電泳。

多重毛細(xì)管電泳。擴(kuò)增產(chǎn)物采用單色ZAG-Z7576毛細(xì)管電泳儀。將2～3個(gè)不同引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL至新的96孔PCR擴(kuò)增板，然后加雙蒸水定容至25 μL。軟件及儀器操作步驟與單重毛細(xì)管電泳一致。

表1 水稻純度鑒定SSR分子標(biāo)記

純度統(tǒng)計(jì)。

樣品純度=(供檢株數(shù)-雜株數(shù))/供檢株數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

豐兩優(yōu)3305在RM224標(biāo)記位點(diǎn)上的純度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，1 bp和500 bp處是試劑盒Marker的范圍，即PCR產(chǎn)物片段在1～500 bp。豐兩優(yōu)3305在RM224標(biāo)記位點(diǎn)的片段是159(母本帶)/185(父本帶)(表1)。H2孔沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，記為空，供檢株數(shù)94株，A8孔的帶型是母本帶159和非父本帶196；H6孔是僅一條母本帶159，H12孔是標(biāo)尺(圖1)。

圖1 豐兩優(yōu)3305在RM224 標(biāo)記位點(diǎn)的帶型Fig.1 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM224 marker

豐兩優(yōu)3305在RM8277標(biāo)記位點(diǎn)上的純度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，Marker與圖1一致。該產(chǎn)物片段是220(父本帶)/234(母本帶)(表1)。A8和H2孔沒(méi)有產(chǎn)物，記為空，H12孔是標(biāo)尺。供檢株數(shù)93株，所有單株的PCR產(chǎn)物帶型一致，沒(méi)有雜帶(圖2)。

豐兩優(yōu)3305在RM336標(biāo)記位點(diǎn)上的純度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，產(chǎn)物片段是133(父本帶)/159(母本帶)(表1)。其中，A2、G1、G2、H4、H5共5個(gè)孔沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，記為空，供檢株數(shù)91株，A4和H1孔都是1條母本帶159，其他孔帶型一致。

豐兩優(yōu)3305在RM208標(biāo)記位點(diǎn)上的純度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，產(chǎn)物片段是143(父本帶)/164(母本帶)(表1)。供檢株數(shù)96株，H7是一條母本帶164，其他孔帶型一致。

該試驗(yàn)對(duì)豐兩優(yōu)3305在RM224、RM8277、RM336、RM208標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行純度鑒定，鑒定結(jié)果匯總見(jiàn)表2。GB 4404.1—2008《糧食作物種子》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，水稻雜交種的大田用種純度不低于96.0%。由表2可知，4個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的純度結(jié)果均高于標(biāo)準(zhǔn)值。

將豐兩優(yōu)3305的RM224和RM8277的PCR產(chǎn)物混勻到同一96孔板，加水至25 μL，雙重電泳結(jié)果見(jiàn)圖5。條帶159/185是RM224標(biāo)記的產(chǎn)物片段，條帶220/234是RM8277標(biāo)記的產(chǎn)物片段。和單重電泳結(jié)果比較，結(jié)果一致，且2個(gè)標(biāo)記的產(chǎn)物之間沒(méi)有影響。

圖2 豐兩優(yōu)3305在RM8277標(biāo)記位點(diǎn)的帶型Fig.2 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM8277 marker

圖3 豐兩優(yōu)3305在RM336標(biāo)記位點(diǎn)的帶型Fig.3 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM336 marker

圖4 豐兩優(yōu)3305在RM208標(biāo)記位點(diǎn)的帶型Fig.4 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM208 marker

表2 豐兩優(yōu)3305的SSR分子標(biāo)記純度鑒定結(jié)果

將豐兩優(yōu)3305的RM336、RM208的產(chǎn)物PCR產(chǎn)物混勻到同一96孔板，加水至25 μL后混合進(jìn)行雙重電泳。條帶133/159是RM336標(biāo)記的產(chǎn)物片段，條帶143/164是RM208標(biāo)記的產(chǎn)物片段。如圖6所示，133和143兩個(gè)片段可以區(qū)分，而159和164兩個(gè)片段相差5 bp，帶型有重合，無(wú)法判讀結(jié)果。

圖5 豐兩優(yōu)3305在RM224、RM8277標(biāo)記位點(diǎn)的雙重電泳Fig.5 Double electrophoresis of Fengliangyou 3305 at the marked sites of RM224 and RM8277

圖6 豐兩優(yōu)3305在RM336、RM208標(biāo)記位點(diǎn)的雙重電泳Fig.6 Double electrophoresis of Fengliangyou 3305 at the marked sites of RM336 and RM208

根據(jù)豐兩優(yōu)3305雙重電泳結(jié)果可知，不同引物的產(chǎn)物片段差異超過(guò)10 bp可以進(jìn)行混合電泳，產(chǎn)物之間沒(méi)有影響，與單重電泳結(jié)果一致。潤(rùn)稻118純度檢測(cè)RM224、RM8277、RM19的片段大小分別是132/132、147/147、201/201，之間相差均在10 bp以上，產(chǎn)物可以混合電泳。3個(gè)標(biāo)記產(chǎn)物多重電泳結(jié)果見(jiàn)圖7。在RM224標(biāo)記位點(diǎn)上，F(xiàn)8沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，記為空，供檢株數(shù)94株，其他帶型一致沒(méi)有雜帶；在RM8277標(biāo)記位點(diǎn)上沒(méi)有雜帶和空孔；在RM19標(biāo)記位點(diǎn)上，H11孔顯示是雜帶，其他帶型一致。由表3可知，在RM224、RM8277、RM19標(biāo)記位點(diǎn)上，潤(rùn)稻118的純度分別為100%、100%、98.9%。

圖7 潤(rùn)稻118在RM224、RM8277、RM19標(biāo)記位點(diǎn)的三重電泳Fig.7 Triple electrophoresis of Rundao 118 at marker sites of RM224，RM8277 and RM19

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)選用豐樂(lè)水稻雜交品種豐兩優(yōu)3305和常規(guī)稻品種潤(rùn)稻118的不同引物進(jìn)行單重和多重電泳比對(duì)。結(jié)果表明，相差10 bp以上的PCR產(chǎn)物混合兩重和三重電泳，對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響。該試驗(yàn)在鑒定水稻雜交品種純度時(shí)，結(jié)合實(shí)際選用2個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行試驗(yàn)。今后在分子標(biāo)記純度鑒定中可以根據(jù)需要混合更多引物，驗(yàn)證雜交種更多重的毛細(xì)管電泳效果。

根據(jù)SSR分子標(biāo)記純度鑒定結(jié)果可以看出，同一品種在不同標(biāo)記位點(diǎn)上的純度結(jié)果不同，如豐兩優(yōu)3305品種在RM224標(biāo)記位點(diǎn)上純度結(jié)果是97.9%，在RM8277標(biāo)記位點(diǎn)上是100%?？赡苁窃撈贩N的父母本在RM224標(biāo)記位點(diǎn)上輕微分離造成的。通過(guò)分子標(biāo)記和田間純度鑒定結(jié)果比較分析，父母本在某個(gè)位點(diǎn)輕微分離，但不會(huì)造成品種表現(xiàn)型的變化，分子標(biāo)記純度鑒定時(shí)應(yīng)排除該標(biāo)記位點(diǎn)。

表3 潤(rùn)稻118的純度鑒定結(jié)果

該試驗(yàn)研究的多重毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)不同標(biāo)記的產(chǎn)物進(jìn)行混合多重電泳，即混合不同大小的DNA片段在一個(gè)毛細(xì)管上進(jìn)行電泳，混合3個(gè)PCR產(chǎn)物成本可以從2～3元降低到0.7～1.0元，相應(yīng)的電泳時(shí)間也縮短了2倍，多重毛細(xì)管電泳既降低檢測(cè)成本又提高試驗(yàn)效率，進(jìn)一步提升了毛細(xì)管電泳使用效能，為分子標(biāo)記鑒定技術(shù)更廣泛的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 34/T 3308—2018《兩系雜交水稻種子純度檢測(cè) 分子標(biāo)記法》規(guī)范了兩系水稻分子純度檢測(cè)的流程，針對(duì)的是PAGE電泳方法。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 39917—2021《主要農(nóng)作物真實(shí)性和純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè) 稻》，該標(biāo)準(zhǔn)的純度檢測(cè)毛細(xì)管電泳部分主要是針對(duì)DNA分析儀的多色熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)。該試驗(yàn)研究一種混合單色多重PCR產(chǎn)物的電泳技術(shù)，綜合了PAGE電泳與DNA分析儀的優(yōu)點(diǎn)，既可以克服單重電泳成本高的問(wèn)題，又進(jìn)一步規(guī)范毛細(xì)管電泳的技術(shù)流程和操作細(xì)節(jié)，保證試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。