豬瘟病毒的基因組學(xué)及診斷技術(shù)

文│史艷華（遼寧省法庫縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣與行政執(zhí)法中心）

豬瘟是由ASFV感染引起的一種可致豬類動物極高死亡率的疾病，其本質(zhì)是動物瘟疫，也是國家聯(lián)合衛(wèi)生組織在通過了衛(wèi)生法研究后，通報的一類疫病。豬瘟病毒在分子結(jié)構(gòu)上是一種呈現(xiàn)雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA序列病毒，可以通過蜱蟲進(jìn)行血液傳播與感染。在20世紀(jì)20年代，此類病毒首次在非洲被發(fā)現(xiàn)，并在50年代傳播到各國。直到1990年，各個國家正式認(rèn)識到了此病毒對于人類社會發(fā)展與動物生存的威脅，提出了針對此類病毒的防控手段與措施。

隨著防疫手段的不斷創(chuàng)新與升級，豬瘟病毒已基本在各個國家內(nèi)消除，直到2007年，豬瘟病毒再次在各個國家內(nèi)呈現(xiàn)，并出現(xiàn)了高速繁殖的趨勢。在我國遼寧沈陽地區(qū)，2018年遭受了豬瘟病毒的侵害，動物大量死亡，不僅對該地區(qū)當(dāng)時經(jīng)濟(jì)建設(shè)造成了較大的影響，同時也感染到了人體。豬瘟病毒在臨床上的主要表現(xiàn)為高燒、發(fā)熱、嘔吐、腹瀉、厭食等現(xiàn)象。經(jīng)過了一段時間的研究，仍未能及時產(chǎn)出有效治療或切斷病毒的疫苗。因此，要解決豬瘟病毒對人類造成的威脅，需要做好豬瘟病毒的診斷工作，及時發(fā)現(xiàn)存在異變的豬瘟病毒基因序列，將病毒對人體造成的損傷降至最低。為了落實此項工作，筆者將開展豬瘟病毒基因組學(xué)的分析，根據(jù)其基因序列，提出一種全新的診斷技術(shù)，做到對病毒的高效防治。

一、豬瘟病毒的基因組學(xué)及診斷技術(shù)

1.豬瘟病毒的基因組序列分析。豬瘟是危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一，為了實現(xiàn)對此類病毒傳輸?shù)那袛?，需要在開展診斷技術(shù)設(shè)計與研究前，進(jìn)行豬瘟病毒基因組學(xué)的分析。在此過程中，引進(jìn)CSFV軟件，進(jìn)行毒株基因組序列的分析，提取Brescia毒株與Alfort毒株，使用相同的方式，在軟件中進(jìn)行毒株基因組的分析，分析后發(fā)現(xiàn)基因組測試結(jié)果分別為12589bp與12604bp，對應(yīng)毒株的氨基酸序列同源性高達(dá)95%。由此可以證明，多種類型的豬瘟病毒基因組序列是相近的。

在深入對豬瘟病毒基因組序列的分析中發(fā)現(xiàn)，大部分基因組呈現(xiàn)單股、正鏈結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的感染性，基因組在動物體內(nèi)的沉降系數(shù)在35S～55S之間，分子量約為4×106單位，序列長度大約為12.1Kb，由5個非編碼區(qū)域、1個ORF區(qū)域、3個序列區(qū)域構(gòu)成?；蚪M序列示意圖如下圖1所示。按照圖1所示的結(jié)構(gòu)，即可實現(xiàn)對其他類型豬瘟病毒基因組序列圖的繪制。綜上所述，完成對豬瘟病毒的基因組序列分析。

2.提取豬瘟病毒基因組蛋白結(jié)構(gòu)。完成對豬瘟病毒的基因組序列分析后，提取豬瘟病毒基因組蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)行CSFV病毒的初步診斷。在此過程中應(yīng)明確CSFV病毒中的ORF基因可實現(xiàn)對多個氨基酸蛋白的有效編碼，在完成編碼后，進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)的解譯，并同步進(jìn)行蛋白宿主細(xì)胞中毒酶的加工，通過此種方式，便可以實現(xiàn)對結(jié)構(gòu)蛋白的生成。提取結(jié)構(gòu)蛋白中以非結(jié)構(gòu)方式呈現(xiàn)的蛋白，將其作為CSFV病毒基因組蛋白結(jié)構(gòu)。

3.豬瘟病毒基因組RNA的熒光檢測與診斷。完成對基因組蛋白結(jié)構(gòu)的提取后，采用熒光測試的方式，對豬瘟病毒基因組RNA進(jìn)行檢測與診斷。熒光測試屬于一種自然光發(fā)光測試反應(yīng)，測試中，將所選的毒株放置在培養(yǎng)器皿中，熒光素酶與毒株中的ATP發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，輔助使用光照儀器進(jìn)行熒光效果分析，即可實現(xiàn)豬瘟病毒的有效診斷。

測試中，使用熒光顯微鏡鎖定毒株中的基因序列，提取蛋白結(jié)構(gòu)，對其進(jìn)行RNA檢測。為了提高檢測結(jié)果的精度，可在測試中輔助搭配CCD軟件測定。在此基礎(chǔ)上，使用共聚焦設(shè)備，對逐步測定結(jié)果進(jìn)行光學(xué)層切處理，得到針對豬瘟病毒基因組RNA的三維定位信息。設(shè)定多個熒光檢測通路，選擇Timelaps進(jìn)行定時取圖，此種設(shè)備在實際應(yīng)用中具有較強(qiáng)的分辨率，可以提高檢測結(jié)果的精度與真實度。使用全內(nèi)反射儀器，對毒株細(xì)胞進(jìn)行膜內(nèi)測試，將測試結(jié)果進(jìn)行終端成像。使用雙光子設(shè)備，進(jìn)行長波激發(fā)熒光顯色，此設(shè)備在實際應(yīng)用中可以實現(xiàn)對活體組織細(xì)胞中病毒分子結(jié)構(gòu)與基因組結(jié)構(gòu)的測定，測定結(jié)果可以突破100微米的極限。

完成熒光檢測的相關(guān)工作后，等待培養(yǎng)皿中測試樣本的顯色程度，在完成完全顯色后，培養(yǎng)皿局部出現(xiàn)熒光顯色，可以提取局部組織按照上述步驟進(jìn)行二次熒光測試。對于測試區(qū)域內(nèi)80以上的顯色行為，即可直接得出診斷結(jié)果。通過此種方式不斷迭代處理，完成豬瘟病毒基因組RNA的熒光檢測，實現(xiàn)對豬瘟病毒的基因組學(xué)診斷技術(shù)的設(shè)計研究。

二、診斷技術(shù)應(yīng)用效果

為了證明本文設(shè)計的豬瘟病毒診斷技術(shù)在實際應(yīng)用中具有較強(qiáng)的優(yōu)勢，下述將通過實例應(yīng)用與對比分析的方式，對設(shè)計的技術(shù)進(jìn)行實踐檢驗。在此過程中，選擇某地區(qū)病毒防疫站作為實驗場所，由該防疫站內(nèi)的專業(yè)技術(shù)人員參與此次診斷技術(shù)實驗檢測工作。為了保證實驗過程的安全性，避免實驗中所使用的病毒外泄，擾亂社會發(fā)展秩序，需要在防疫單位內(nèi)搭建一個相對封閉的實驗場所，所有在場參與實驗的技術(shù)人員與工作人員需要穿著防護(hù)服進(jìn)入實驗場所。完成實驗中的準(zhǔn)備工作后，進(jìn)行病毒血清與毒株的制備。選擇K-15第80代細(xì)胞毒株作為實驗樣品，此樣品在通過了國家衛(wèi)生監(jiān)督檢查防疫站認(rèn)證后，在中國獸醫(yī)類藥品監(jiān)察機(jī)構(gòu)購買。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行豬瘟病毒在實驗室內(nèi)的繁殖與培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，將購買的毒株樣品細(xì)胞放置在培養(yǎng)器皿上，按照表1預(yù)設(shè)的實驗環(huán)境，進(jìn)行實驗樣品的制備。

按照上述方式，進(jìn)行實驗環(huán)境的布置，將細(xì)胞放置在上述環(huán)境中培養(yǎng)24小時，確保單層細(xì)胞覆蓋率達(dá)到85%以上時，使用專業(yè)的儀器設(shè)備，進(jìn)行豬瘟病毒的提取。使用設(shè)計的診斷技術(shù)，對實驗樣本進(jìn)行熒光測試，測試時長為15分鐘，熒光測試結(jié)果如圖2所示。

從上述圖2可以看出，熒光測試在5分鐘時，培養(yǎng)皿測試區(qū)域初步反應(yīng)顯色；熒光測試在10分鐘時，培養(yǎng)皿測試區(qū)域顯色已較為明顯；熒光測試在15分鐘時，培養(yǎng)皿測試區(qū)域已完全顯示。由此可以證明設(shè)計的豬瘟病毒診斷技術(shù)具有對病毒的有效診斷效果。

完成上述實驗后，選擇基于CHO-K1技術(shù)的診斷技術(shù)作為傳統(tǒng)技術(shù)，對制備的樣本進(jìn)行診斷與病毒檢測，記錄不同樣本的顯色時間，將培養(yǎng)皿測試樣本完全顯色作為指標(biāo)，記錄從診斷開始到診斷結(jié)束，兩種不同診斷技術(shù)所需要的時長。將結(jié)果整理成表格，如表2所示。

從表2所示的實驗結(jié)果可以看出，技術(shù)診斷耗時小于傳統(tǒng)技術(shù)診斷耗時，證明在相同條件下，本文設(shè)計的診斷技術(shù)在實際應(yīng)用中具有更高的診斷效率。綜上所述，得出此次對比實驗的結(jié)論：相比基于CHO-K1技術(shù)的診斷方法，筆者設(shè)計的豬瘟病毒診斷技術(shù)在實際應(yīng)用中，可以有效縮短診斷耗時，將診斷所需時長控制在15分鐘范圍內(nèi)。

三、結(jié)語

表1 豬瘟病毒實驗樣品制備環(huán)境與制備條件

表2 豬瘟病毒診斷技術(shù)耗時對比

筆者從豬瘟病毒的基因組序列分析、提取豬瘟病毒基因組蛋白結(jié)構(gòu)、豬瘟病毒基因組RNA的熒光檢測與診斷三個方面，完成了豬瘟病毒的基因組學(xué)及診斷技術(shù)的研究。并選擇基于CHO-K1技術(shù)的診斷技術(shù)作為傳統(tǒng)技術(shù)，開展對比實驗研究，通過對比實驗證明，設(shè)計的豬瘟病毒診斷技術(shù)在實際應(yīng)用中，可以有效縮短診斷耗時，將診斷所需時長控制在15分鐘范圍內(nèi)。因此，可在后續(xù)的研究中，嘗試將設(shè)計的方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的方法在臨床中使用，以此種方式解決我國動物產(chǎn)業(yè)在發(fā)展與建設(shè)中受到瘟疫干擾與抑制的問題。但要正式將此項技術(shù)廣泛推廣在市場，還需要對此方法進(jìn)行多次實驗，從不同層面證明此項診斷的可行性。