電針對小型豬熒光素鈉循經遷移的影響研究

王瑾玉，王燕平，熊 楓，王廣軍，賈術永，宋曉晶，王淑友，谷淑雅，張維波

(1.北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學院針灸研究所,北京 100700)

中醫(yī)經絡的科學內涵是針灸基礎研究的重大科學問題?，F(xiàn)代經絡研究在20世紀中葉正式起步，多學科介入經絡研究，發(fā)現(xiàn)了一批經絡現(xiàn)象[1]。張維波[2-3]在總結這些經絡現(xiàn)象及解析中醫(yī)古典文獻經絡氣血概念的基礎上提出了經絡的間質通道學說，認為經絡是存在于間質中、具有低流阻特性的組織液通道，隨后使用生物力學方法證明了經脈線的低流阻特性，又通過一系列實驗發(fā)現(xiàn)了循經低流阻通道(Low hydraulic resistance channel along meridians，LHRCM)[4]。循經低電阻特性是用低頻高壓窄脈沖電流在人體上發(fā)現(xiàn)的一種低阻經絡現(xiàn)象[5]。穆祥等[6]用同樣的方法在小型豬上發(fā)現(xiàn)了循經低電阻線(Low impedance line along meridian,LILM)。Zhang等[4]發(fā)現(xiàn)小型豬的LILM與以往實驗中測量到的LHRCM基本重合，二者在體表的平均距離差異為1.4 mm，用LILM可近似確定LHRCM的位置。2018年，美國一團隊使用熒光素鈉(Sodium fluorescein,SF)在體觀察到液態(tài)組織液的分布[7]。為使經絡可視化，并直接觀察到經絡中組織液的運動，研究人員建立了熒光照相法，使用SF示蹤經絡中的組織液,對大鼠的任脈LHRCM進行了活體顯示[8]。因為大鼠肢體窄小，很難觀測到 SF的循經遷移情況，所以選取了體積稍大四肢短粗的小型豬作為實驗動物模型，并對其在肢體上的循經遷移規(guī)律進行了觀測。結果發(fā)現(xiàn)在小型豬四肢12條LILM注射SF后，可以觀察到7條以注射點為中心的線狀遷移軌跡，這7條遷移軌跡與其對應的7條LILM的總吻合度達81.4%；在LILM旁開的非低電阻區(qū)域注射SF后未出現(xiàn)線狀遷移，而是以注射點為中心向四周擴散。對SF沿LILM遷移軌跡的橫斷面進行觀察后發(fā)現(xiàn)，SF沿皮膚和肌肉的間隙遷移，其橫斷面呈V字或Y字形，存在于間質中，是一種間質通道[9]。上述一系列實驗證明，機體內存在著與中醫(yī)經絡密切相關的循經間質通道。

《靈樞·九針十二原》有“欲以微針通其經脈，調其血氣”的描述。本研究基于經絡的間質通道學說，使用熒光照相法觀察了電針對SF在小型豬前肢外側中央LILM遷移的影響，并對電針調氣的可能機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 在北京市琉璃河科興試驗動物實驗基地，選擇4頭巴馬豬(2頭雄性，2頭雌性)進行實驗。實驗用的動物使用許可編號為SCXK (京)2017-0003。每天供應高濃度飼料(希望飼料有限責任公司)，8:00喂料150 g，20:00喂料100 g，不限水，單籠式喂養(yǎng)。在(20±2) ℃的環(huán)境下，50%～10%的相對濕度下，在實驗室內培養(yǎng)7 d后進行實驗。該實驗由中國中醫(yī)科學院倫理委員會批準后進行。

1.2 主要儀器和試劑 R620IE通用型動物麻醉機(深圳瑞沃德)、R409 PLUS大動物呼吸機(深圳瑞沃德)、WQ6F30經絡定位儀(北京市海淀區(qū)東華電子儀器廠)、LH202H 4導韓氏穴位恒流神經刺激儀(北京華衛(wèi)產業(yè)開發(fā)公司)、0.40 mm×25 mm 一次性使用針灸針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)、5D Mark2相機(日本Canon)、MC UV 77 mm窄帶濾色鏡(日本kenko)、600EX Ⅱ-RT閃光燈(日本Canon)、Filmer 600SLED燈(上海Starison)、濾色紙、T-2000型電子天平[精度0.5 g，美國雙杰兄弟(集團)]、異氟烷(進口)、 3%戊巴比妥鈉(進口)、鹽酸賽拉嗪注射液(獸藥字070012926)、20%熒光素鈉注射液(國藥準字H45011477)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組:本研究在四只小型豬的左右共八條前肢上進行實驗，采用同體比較，在不同日次分別進行實驗。電針組8例，即在每只小型豬的左右前肢各進行1次電針干預，共8次實驗；對照組8例，即在每只小型豬的左右前肢同樣位置進行不刺激的對照實驗，共8次實驗。同一只小型豬同一側前肢的兩次實驗間隔在3 d以上。

1.3.2 麻醉與備皮:用電推剪除毛發(fā)，露出前肢外側的皮膚，有臟污處用75%的酒精棉球擦拭干凈后晾干，隨后采用3%的戊巴比妥鈉溶液(0.5 ml/kg)和鹽酸塞拉嗪注射液(0.1 ml/kg) 分別對小型豬兩側臀部肌肉進行注射麻醉。

1.3.3 循經低電阻線的測定:將經絡定位儀參數(shù)調整為脈沖60～80 Hz，電流范圍50 μA，對低電阻點(Low impedance point,LIP)進行位置測量。測定時，將經絡定位儀的基準電極置于小型豬的耳廓背側面，用一根探頭與四肢縱向軸線呈垂直方向，進行均勻掃描，每隔約1 cm進行一次掃描，掃描過程中對微安表進行觀察，如若微安計指針陡然轉向右側且超過8 μA，則該點即為LIP，用彩色畫筆做記號，往復進行，將所探測到的LIP連接起來即為 LILM。在小型豬前肢的外側分別探測到3條LILM。本實驗選擇外側中央的1條LILM進行電針影響SF遷移的觀察。

1.3.4 示蹤劑的注射:根據(jù)既往研究結果[9]，確定使用20%、0.4 ml、深度3～4 mm的注射參數(shù)，體表SF的遷移顯示最清晰。在麻醉狀態(tài)下，電針組與對照組皆統(tǒng)一選取在左右前肢外側中央的LILM腕部上4.5 cm的一點作為注射點，用1 ml注射器垂直于皮膚表面刺入，深度3～4 mm，然后緩慢推注20%的SF溶液0.4 ml。

1.3.5 成像環(huán)境:工作環(huán)境溫度為(25±1) ℃，相對濕度為30%～60%，室內外通風隔絕。在SF注射和拍攝過程時處于暗室狀態(tài)，無陽光和燈光照射。

1.3.6 小型豬電針組與對照組的操作:小型豬在麻醉狀態(tài)下注射SF溶液后，電針組選擇原SF注射點作為進針點，將中研太和牌0.40×25 mm針灸針與皮膚呈60°角斜刺入皮膚15 mm，使針體與皮下肌肉組織充分接觸。隨后接入LH202H韓氏恒流電針儀，一側電極連接針體，另一側電極規(guī)定在小型豬耳廓外緣。采用100 Hz正負脈沖模式、脈寬0.2 ms、電流在6～9 mA之間適當調節(jié)，持續(xù)30 min，以肉眼可見肌肉出現(xiàn)持續(xù)地節(jié)律性收縮為度。對照組僅注射SF溶液，不做任何干預。

1.3.7 熒光照相法:將小豬置于實驗臺上，采用側臥位。在Canon5D2數(shù)字照相機安裝窄帶濾色鏡，距離小型豬0.5～1 m的范圍內，人工調整焦距和曝光。該系統(tǒng)以一臺主閃光燈、一臺副閃光燈為激發(fā)光源，其主、副閃光燈各安裝一張藍濾紙，主副閃光燈之間通過無線傳送保證曝光時間的同步。把主閃光燈放置在數(shù)碼相機側，位于小型豬腹側稍高一點，在小豬背側一邊，把副閃光燈放在更低的位置。LED燈配有藍濾紙，靠近小型豬放置，用以拍攝調焦(圖1)。

圖1 熒光照相裝置示意圖

1.4 觀察指標 分別在注射后即刻、針刺結束時、針刺結束后30 min對小型豬前肢SF注射部位一帶進行熒光照相，觀察SF體表遷移的動態(tài)軌跡。使用直尺測量SF注射60 min(電針后30 min)后SF體表遷移軌跡沿小型豬前肢縱軸的長度和沿橫軸的寬度，然后計算兩者的比例，即長寬比。遷移方向以一側方向的遷移長度比另一側大1/3以上為有方向性遷移的標準，即以注射點為中心，沿縱軸向上的向心長度比沿縱軸向下的離心長度大1/3以上稱為向心遷移，反之稱為離心遷移，若向心遷移長度與離心遷移長度的差異小于1/3，則稱為雙向(等長)遷移。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件。計量資料以均數(shù)±標準差表示，并進行正態(tài)性分析及方差齊性檢驗，兩者均符合者采用配對樣本t檢驗；若數(shù)據(jù)僅符合一項或均不符合時，采用Kruskal Wallis H檢驗；以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 電針組與對照組注射SF后遷移軌跡比較 電針組及對照組在小型豬前肢外側中部LILM的腕部以上約4.5 cm處注射SF溶液后，均呈現(xiàn)以注射點為中心，沿低電阻線方向出現(xiàn)線狀遷移軌跡，其遷移情況見表1(圖2)。

注：A、B為對照組注射SF 60 min后的遷移長度和寬度測量，C、D為電針組注射SF 60 min后的遷移長度和寬度測量，綠色×所示為注射點

表1 小型豬電針組與對照組注射SF 60 min后遷移軌跡比較(cm)

與對照組比較，電針組SF遷移軌跡的長度與寬度均明顯增加(P<0.01)。測量小型豬前肢的平均長度(從腕橫紋到腋橫紋)約為(13.50±0.69) cm，電針組平均遷移長度占前肢長度的百分比為33.3%±66.3%，對照組平均遷移長度占前肢長度的百分比為18.6%±36.5%。電針組的長度百分比相對于對照組增加了近1倍。

2.2 電針組與對照組注射SF后遷移方向比較 在小型豬前肢外側中部LILM的腕部以上約4.5 cm處注射SF溶液后，電針組及對照組SF遷移軌跡的方向情況如表2所示。

表2 電針組與對照組注射SF 60 min后遷移方向比較(cm)

結果顯示，注射60 min后，電針組以離心遷移為主，也有雙向遷移；對照組以離心遷移為主，除雙向遷移外，還有向心遷移。

3 討 論

SF作為一種易溶于水且無特異性親和性的“水指示劑”[10]，可與間質中的液態(tài)組織液結合，其波長515 nm的黃綠色熒光可被熒光照相法[7-9]有效捕捉到。本研究以SF為示蹤劑，通過熒光照相，可顯示組織液在體表的分布和運動情況。SF在組織液中的運動包括濃度擴散和組織液對流輸運，服從Fick擴散定律,如果存在組織液的向經脈流動和循經流動[4]，則SF在縱向(向心或離心)和橫向的遷移長度會顯著不同，并出現(xiàn)向心和離心兩個方向上遷移長度的不對稱。

研究發(fā)現(xiàn)，電針組和對照組均出現(xiàn)了SF沿LILM的體表遷移軌跡，但也有垂直于LILM沿肢體橫軸方向的遷移，兩組遷移的距離在縱向與橫向上皆明顯不對稱，表現(xiàn)為縱向循經的方向上有明顯優(yōu)勢的遷移，長寬比接近2.5，具有一定的線狀遷移特征，說明經脈通道存在一定的橫向約束性，此結果與本團隊之前的研究結果一致[9]。進一步比較發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，電針組的遷移軌跡在長度和寬度方面均有顯著增加，說明電針可以促進組織液的流動，使SF的遷移距離更長。

研究中觀察到電針組和對照組的SF遷移軌跡方向以離心遷移為主，也有雙向遷移，對照組還出現(xiàn)向心遷移。這種不同方向的遷移可能與經氣的運行方向有關。經脈是運行氣血的通道，《內經》中經脈的循行方向有不同的模式，主要的三種模式是上下交替的循環(huán)流注，自下而上循行和自上而下循行[11]。《靈樞·營氣》記述的“氣從太陰出注手陽明，上行注足陽明，下行至跗上，注大指間，與太陰合，下行至跗上，注大指間，與太陰合……合足厥陰，上行至肝，從肝上注肺”就屬于上下交替的循環(huán)流注，《靈樞·逆順肥瘦》對這種循行模式總結為“手之三陰，從臟走手，手之三陽，從手走頭，足之三陽，從頭走足，足之三陰，從足走腹” 。《靈樞·衛(wèi)氣》中經氣的運行為自下而上(向心)，而《靈樞·衛(wèi)氣行》所載衛(wèi)氣的循行都是從頭面行于手足的離心方面。本研究觀察到組織液遷移的不同方向，支持了《內經》中經氣運行不同方向的記載。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)影響組織液流動的因素有血管脈動、運動與肢體的主動和被動收縮等[12-14]。本研究通過電針引發(fā)的肌肉節(jié)律性收縮與肢體的主動被動收縮類似。電針可以提高肌肉組織的興奮性，引起肌肉收縮[15]，肌肉的節(jié)律性收縮可擠壓組織間隙并形成波動變化的組織液壓，根據(jù)組織液流動的達西定律，此波動壓力可推動組織液流動，形成更長更寬的SF軌跡，類似心臟節(jié)律性收縮推動血液流動的過程?！鹅`樞·經脈》云：“經脈者，伏行分肉之間”， 狹義的分肉可理解為“肉分之間，谿谷之會，以行榮衛(wèi)，以會大氣”(《素問·氣穴論》)的肌肉間隙，其兩側的肌肉形成了經脈通道的外壁，經絡通道周圍的肌肉狀態(tài)可能影響通道的通暢性,進而影響“氣-組織液”的運行[2]。賈術永等[16]在此基礎上使用恒流電針儀刺激小型豬四肢循經低流阻通道上的低流阻點附近的肌肉,發(fā)現(xiàn)當電流達到7 mA以上時,肌肉可出現(xiàn)強直收縮，同時流阻也顯著增加，說明肌肉狀態(tài)可影響肌肉間隙的大小和阻力，進而影響組織液的流動。為防止小型豬四肢肌肉對電刺激耐受，本實驗控制恒流電流在6～9 mA之間適當調節(jié),以從皮膚表面可觀察到肌肉節(jié)律性收縮為度，并保持肌肉一直處于節(jié)律性收縮而非強直或不收縮的兩種狀態(tài)，通過肌肉節(jié)律性收縮，組織液的運行動力得以加強。古人描述針刺“得氣”時施術者手下會有“如魚吞餌之勢”，即手下沉緊感。肌肉內的牽拉感受器-肌梭被認為是針刺得氣的解剖基礎之一，而肌梭激發(fā)的標志正是施術者有針下沉緊感或“吸針感”。當混有運動神經的纖維穿入肌肉或稱為“運動點”被刺中時，可以發(fā)生肉眼可見的整條肌纖維的抽搐[17]，這與本實驗通過控制電針參數(shù)從而觀察到的實驗現(xiàn)象相似。陸鳳燕等[18]發(fā)現(xiàn)，針刺穴區(qū)不同組織結構出現(xiàn)得氣針感過程中的積分肌電值(iEMG)顯著高于針刺前，證明針刺效應與肌肉的活動高度相關。此外，鄧麗芬等[19]使用電針觀察受試者足三里，得氣后可得到較強的電針肌縮反應，也說明電針引起肌肉反應的強弱可以作為判斷是否得氣或得氣程度的客觀參考指征之一。

肌肉屬中醫(yī)經筋的范疇。近年來針對經筋本質的探析可分為神經學說、肌肉學說、神經肌肉學說、肌筋膜以及一套相對完整的循行系統(tǒng)，其中尤以筋肉學說、神經肌肉學說最為盛行[20-21]。薛立功等[22]認為，“經筋”是一種以經脈為總綱，由骨骼肌、韌帶等組成的系統(tǒng)，也是一種對機體筋肉及其周圍組織生理表現(xiàn)和病理癥候的高度概述?！皦颜咧畾庋ⅲ浼∪饣?，氣道通，營衛(wèi)之行不失其常，故晝精而夜瞑。老者之氣血衰，其肌肉枯，氣道澀，五臟之氣相搏，其營氣衰少而衛(wèi)氣內伐，故晝不精，夜不瞑”(《靈樞·營衛(wèi)生會》)。說明經脈是“著藏”在“經筋”之中的，經筋經脈相伴而行，相須為用，經脈中的津液氣血可濡養(yǎng)經筋，使其束骨、利關節(jié)的功能正常，為經脈通道中氣血的運行提供了動力。而當經筋病變，失其正常舒縮功能，則經脈通道就變得滯澀，影響氣血的正常運行。本實驗用電針刺激屬于經筋的循經肌肉，引起其節(jié)律性收縮，促進了經脈中的組織液流動，加強經脈“行血氣，營陰陽”的功能，佐證了經脈與經筋的密切關系。李端午等[23]通過針刺受試者一側太沖穴，觀察到針刺可促進經脈內的核素運行，與用熒光素鈉示蹤的動物實驗結果相吻合。

本研究是在麻醉狀態(tài)下的小型豬上進行的，與清醒狀態(tài)下人的針刺情況仍有一定差異。進一步的研究可找尋一種在小型豬清醒狀態(tài)下進行針刺施術操作和示蹤觀察的實驗方法，使動物的狀態(tài)與人類針灸時更接近。當然，最終證明針刺對經氣的調節(jié)作用還需直接在人體上進行試驗，也可考慮從組織形態(tài)學角度對電針影響組織液流動的范圍進行更準確的測定，是針刺研究未來的方向。

本研究首次使用可視化方法研究針刺的效應，發(fā)現(xiàn)電針引起肌肉興奮可增強熒光素鈉線狀遷移，為經脈的間質通道學說和低流阻通道中的組織液與經氣密切相關的觀點[24]提供了進一步的影像學證據(jù)，也為針灸可通過經筋調節(jié)經脈氣血的途徑提供了科學依據(jù)。