基于16S rDNA基因測序探討咳嗽變異性哮喘與腸道菌群的關(guān)系

沈靈，曾琳琳，駱巧媚，范依霖，賀倩，段小云

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610031；2.四川省骨科醫(yī)院，四川成都 610041）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一種以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑為主要特征的呼吸系統(tǒng)疾?。?］。其臨床主要癥狀為慢性咳嗽，而無明顯氣促，喘息等癥狀，發(fā)病前期易被忽略，最終部分患者發(fā)展為典型哮喘，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量［2］。根據(jù)CVA 的發(fā)病特點(diǎn)，將其歸于中醫(yī)“風(fēng)咳”，“頑咳”等范疇，病位主肺［3］。中醫(yī)理論記載有“肺與大腸相表里”，認(rèn)為肺和大腸在氣機(jī)、經(jīng)絡(luò)、微生態(tài)三個(gè)層面相互作用，相輔相成，漸發(fā)展為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“肺-腸軸”。研究顯示，腸道菌群紊亂與哮喘、氣道炎癥、慢性阻塞性肺炎、肺功能損傷等肺部疾病密切相關(guān)［4-5］。故本研究基于“肺與大腸相表里”中醫(yī)理論，探討腸道菌群與CVA 的相關(guān)性，以期從腸道微生物角度深入了解CVA 發(fā)病機(jī)制，為CVA 臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步表征中醫(yī)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級BALB∕c 小鼠20 只，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，雌性。由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司供應(yīng)，動(dòng)物許可證號：SCXK（川）2020-030。飼養(yǎng)于溫度（20～25）℃，相對濕度30%～70%，光照時(shí)間12 h 的西南交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飲食飲水自由。所有程序均按照衛(wèi)生部頒布的《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》（1988 年）進(jìn)行。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)西南交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

十二水硫酸鋁鉀（明礬，批號：2018010101，成都市科隆化學(xué)品有限公司），卵清蛋白（OVA，貨號：A5503，Sigma公司），DNA Microprep Kit（批號：D4301，ZYMO RESEARCH 公司），Hiseq Rapid SBS Kit v2（批號：FC-402-4023，Illumina 公司），高通量測序儀（型號：HiSeq 2500 型，Illumina 公司），PCR擴(kuò)增儀（型號：9700型，Applied Biosystems公司），超聲霧化器（型號：402AI，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）。

1.3 CVA小鼠模型的復(fù)制

20只BALB∕c雌性小鼠按隨機(jī)原則分為對照組和模型組，每組10 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，開始造模。對照組0、7、14 d 腹腔注射0.2 mL 明礬溶液（1 mg 明礬溶于PBS），模型組給予等量OVA 混懸液（50μg OVA+1 mg 明礬溶于PBS）；21 d 起將小鼠放入密閉透明霧化箱，對照組每天用生理鹽水，模型組用1%OVA，霧化30 min，持續(xù)3 周。在此期間觀察小鼠一般體征并定時(shí)記錄體質(zhì)量。

1.4 咳嗽反應(yīng)測試

造模最后1 天，將對照組和模型組小鼠依次放入透明密封箱內(nèi)，霧化吸入氨水1 min，關(guān)閉霧化器后，讓小鼠于密封箱內(nèi)停留1 min 后開始記錄小鼠在4 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)及咳嗽潛伏期。

1.5 小鼠糞便收集

末次造模24 h 后，收集小鼠糞便3～4 顆于滅菌凍存管內(nèi)，后轉(zhuǎn)置于液氮中保存，全部收集完成后迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃存儲(chǔ)。

1.6 16S rDNA高通量測序分析

采用瓊脂糖電泳法提取總DNA，用PicoGreen染料法進(jìn)行樣本DNA 濃度檢測，使用特異引物515F 和806R 對樣本的16S 核糖體DNA（16S ribosomal DNA，16S rDNA）V4 區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行目的片段電泳檢測，將合格的目的片段回收后純化、定量，使用NEBNext Ultra ⅡDNA Library Prep Kit for Illumina建庫，在HiSeq 2500 平臺上進(jìn)行高通量測序?；赨search 軟件，在97%的一致性水平上對代表性序列進(jìn)行分類操作單元（OUT）聚類，進(jìn)行Alpha 多樣性、Beta多樣性、菌群組成及菌群差異分析。

1.7 小鼠肺組織病理染色

收集完糞便后，立即處死小鼠，取出其肺組織固定于40 g∕L 多聚甲醛中、脫水、包埋、切片、HE 染色、顯微鏡觀察肺組織病理情況。

1.8 相關(guān)性分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Spearman 系數(shù)分析CVA 小鼠的咳嗽次數(shù)、咳嗽潛伏期、體質(zhì)量與腸道菌群的相關(guān)性。應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行分析，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）或中位數(shù)M（P25～P75）表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果各組數(shù)據(jù)之間都呈正態(tài)分布且方差齊性用t檢驗(yàn)，如果不滿足方差齊性，采用校正t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CVA小鼠一般體征及體質(zhì)量變化

造模前，對照組與模型組小鼠精神狀態(tài)佳，毛發(fā)光亮順滑，飲食及排便正常，活動(dòng)度高，反應(yīng)敏捷，體質(zhì)量無明顯差異；在OVA 致敏階段，兩組小鼠表現(xiàn)正常，體質(zhì)量無明顯差異；在OVA 霧化激發(fā)階段，CVA 模型小鼠出現(xiàn)腹式呼吸，搔抓面部，咳嗽，煩躁不安，排便次數(shù)明顯增加、毛發(fā)枯黃，掉毛，活動(dòng)減少，喜扎堆等現(xiàn)象，整體狀態(tài)較對照組差，體質(zhì)量增長減慢，隨著造模時(shí)間延長體質(zhì)量明顯下降（P＜0.01；表1）。

表1 造模期間各組小鼠體質(zhì)量變化Table 1 Changes of body weight during modeling in each group（，n=10）

表1 造模期間各組小鼠體質(zhì)量變化Table 1 Changes of body weight during modeling in each group（，n=10）

P values were compared by T test or Mann-Whitney U test（14 d）as appropriate.1）compared with control，P ＜0.01.

2.2 CVA小鼠咳嗽反應(yīng)測試

與對照組相比，CVA 模型組小鼠4 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著增加，咳嗽潛伏期顯著縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01；表2）。

表2 各組小鼠咳嗽次數(shù)及咳嗽潛伏期Table 2 Number of cough and cough latency of mice in each group ［M（P25～P75），n=10］

2.3 CVA小鼠肺組織病理檢查

小鼠肺組織HE 染色結(jié)果如圖1 所示。對照組：支氣管結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞形態(tài)正常，無脫落、壞死，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組：肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎性浸潤明顯，氣道平滑肌增厚，肺泡壁破壞，偶見上皮細(xì)胞壞死。

圖1 小鼠肺組織病理檢查Fig.1 Pathological examination of lung tissue in mice

2.4 CVA小鼠腸道菌群的變化

2.4.1 OUT分析 末次造模24 h后，每組隨機(jī)選取6 只小鼠進(jìn)行16S rDNA 測序分析。12 個(gè)樣本通過高通量測序共得254 856 條Raw tags，過濾低質(zhì)量、短長度、嵌合體后，得到242 833 條有效序列。在97%的相似性水平下對有效序列進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類，結(jié)果顯示，模型組和對照組共有OTU 數(shù)目為1 371 個(gè)，特有OTU 是1 909 個(gè)和1 870 個(gè)，CVA 模型小鼠菌群OUT 相較于對照組發(fā)生顯著變化（圖2）。

圖2 基于OUT分布的Veen圖Fig.2 Veen graph based on OUT distribution（n=6）

2.4.2 Alpha 多樣性分析 Alpha 多樣性指數(shù)是反映樣本微生物群落復(fù)雜程度的重要依據(jù)，包括群落的豐富度及多樣性。群落豐富度可以用Chao 1 指數(shù)表示，其值越高，表明OTU 數(shù)目越多，群落物種總數(shù)越多；群落多樣性可以用Simpson指數(shù)表示，其值越大，群落多樣性越大。與對照組相比，模型組小鼠的Chao1 指數(shù)增高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Simpson指數(shù)顯著升高（P＜0.01），表明CVA模型小鼠腸道菌群豐富度有增加趨勢且物種多樣性高于對照組（表3）。

表3 Alpha多樣性分析結(jié)果Table 3 Alpha diversity analysis results（，n=6）

表3 Alpha多樣性分析結(jié)果Table 3 Alpha diversity analysis results（，n=6）

P values were compared by T test as appropriate.1）compared with control，P ＜0.01.

2.4.3 Beta 多樣性分析 Beta 多樣性分析能反映多個(gè)樣本間是否有顯著微生物群落差異，為了將樣本間的差異整體反映在二維坐標(biāo)上，選用最常用的Weighted Unifrac 距離計(jì)算方式進(jìn)行非度量多維尺度分析（Non-metric Multi-Dimensional Scaling，NMDS）。如圖3 所示，結(jié)果的應(yīng)力值（Stress）小于0.2，表明NMDS 分析結(jié)果可靠。圖中不同的點(diǎn)代表不同樣本，點(diǎn)之間距離越大，樣本組成差異越大。模型組與對照組組內(nèi)樣本距離接近，菌群組成無顯著差異，組間樣本點(diǎn)完全分開，表明CVA 模型小鼠相較于對照組小鼠腸道菌群組成發(fā)生明顯變化。

圖3 NMDS分析結(jié)果Fig.3 NMDS analysis results

2.4.4 物種組成分析 為了進(jìn)一步研究CVA 小鼠中腸道菌群組成的變化，對門和屬水平微生物相對豐度分析。門水平上，各組小鼠腸道菌群分屬26個(gè)菌門，對相對豐度前十的主要菌門分析發(fā)現(xiàn)，模型組和對照組小鼠中的優(yōu)勢菌門為Firmicutes、Bacteroidetes、Euryarchaeota、Proteobacteria、Spirochaetes和Actinobacteria，總占比分別為98.96%和99.07%。與對照組相比，模型組Firmicutes相對豐度下降，Bacteroidetes、Euryarchaeota、Proteobacteria相對豐度增加。其余優(yōu)勢菌和非優(yōu)勢菌在模型組和對照組間組成差異結(jié)果（圖4）。

圖4 門水平物種豐度累積柱狀圖Fig.4 Barplot of relative abundance at the phylum level

在屬水平上共檢測到376 個(gè)菌屬，對相對豐度前十的菌屬進(jìn)行分析。其中Lactobacillus、Lachnospiraceae NK4A136 group、Ruminococcaceae UCG-014為模型組和對照組共有優(yōu)勢菌屬。與對照組相比，CVA 模型小鼠Lactobacillus、Ruminococcaceae UCG-014、Treponema 2相對豐度下降；Lachnospiraceae NK4A136 group、Methanobrevibacter的相對豐度增加。剩余五種菌屬的相對豐度在模型組樣本中增加（圖5）。

圖5 屬水平物種豐度累積柱狀圖Fig.5 Barplot of relative abundance at the genus level

2.4.5 差異物種分析 為確定模型組與對照組間重要差異菌群，利用線性判別分析（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）進(jìn)行比較。由圖6可知，對照組在Bacteria、Firmicutes、Bacilli、Lactobacillus、Lactobacillaceae、Lactobacillales豐度較高，模型組在Archaea、Bacteroidetes、Euryarchaeota、Clostridia、Bacteroidia、Methanobacteria、Bacteroidales、Clostridiales、Methanobacteriales、Ruminococcaceae、Methanobacteriaceae、Prevotellaceae、Rikenellaceae、Methanobrevibacter、Prevotellaceae UCG-003豐度較高。

圖6 差異物種分析Fig.6 Difference of species analysis

2.5 相關(guān)性分析

為進(jìn)一步研究CVA 與腸道菌群的關(guān)系，利用Spearman 系數(shù)對CVA 特征（咳嗽次數(shù)、咳嗽潛伏期、體質(zhì)量）與腸道菌群進(jìn)行相關(guān)性分析。如表4所示，Methanobrevibacter、Ruminiclostridium 9、Bacte-roides、Escherichia-Shigella、RikenellaceaeRC9gut group、Catenibacterium、PrevotellaceaeUCG-003與CVA小鼠咳嗽次數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與咳嗽潛伏期及體質(zhì)量（42 d）呈正相關(guān)（P＜0.01 或P＜0.05）。RuminococcaceaeNK4A214 group、Alloprevotella、Ruminococcaceae UCG-013、Ruminococcus 1、coprostanoligenes group與咳嗽潛伏期呈正相關(guān)（P＜0.01 或P＜0.05）；Lactobacillus和Treponema 2與咳嗽潛伏期呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01 或P＜0.05）。Prevotellaceae NK3B31 group與小鼠體質(zhì)量呈正相關(guān)（P＜0.01）；Lactobacillus與體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。Lachnospiraceae NK4A136 group與咳嗽次數(shù)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Lactobacillus與咳嗽次數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.01）。上述結(jié)果表明小鼠腸道菌群的組成與CVA特征顯著相關(guān)。

表4 CVA特征與小鼠腸道菌群Spearman相關(guān)性分析Table 4 Spearman's rank correlation analysis between CVA characteristics and intestinal microflora of mice（n=6）

3 討論

3.1 CVA小鼠模型的驗(yàn)證

CVA 是一種以頑固性慢性咳嗽為臨床唯一或主要癥狀的慢性炎癥性疾病，參考文獻(xiàn)［6］，選擇常用的OVA 致敏并霧化激發(fā)復(fù)制小鼠CVA 模型。該研究可見模型組小鼠在霧化激發(fā)階段體質(zhì)量減輕，排便增加，腹式呼吸，煩躁、咳嗽等典型癥狀；咳嗽反應(yīng)提示模型組小鼠咳嗽次數(shù)顯著增加，咳嗽潛伏期縮短；肺組織HE 染色顯示CVA 模型小鼠肺部炎性浸潤明顯，支氣管結(jié)構(gòu)紊亂，氣道壁增厚等病理表現(xiàn)；上述癥狀與文獻(xiàn)記載CVA 小鼠癥狀相符［7-8］，提示OVA誘導(dǎo)的CVA小鼠模型復(fù)制成功。

3.2 結(jié)果分析及同類研究比較

臨床上，呼吸道疾病往往伴隨著胃腸道病變，如流感病人常常伴隨有惡心、腹瀉、腹痛等胃腸道相關(guān)疾病癥狀，此種現(xiàn)象在幼年患者身上尤為突出［9］。

“肺與大腸相表里”始載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，認(rèn)為肺和大腸通過經(jīng)絡(luò)、氣機(jī)構(gòu)成表里關(guān)系，在生理和病理上相互調(diào)節(jié)。隨著對微生物的深入研究，發(fā)現(xiàn)定植于兩個(gè)器官中的呼吸道菌群和腸道菌群雙向相關(guān)、互相影響，成為連接肺和大腸的樞紐［10］。既往研究證實(shí)支氣管哮喘、慢性阻塞性肺炎等肺部疾病往往伴隨腸道菌群紊亂，且肺與大腸胚胎早期具有同源性，即前腸經(jīng)過發(fā)展變化而形成了肺和器官，并且從功能成像角度進(jìn)行了證實(shí)，研究結(jié)果為從組織胚胎學(xué)方面解釋肺腸相關(guān)提供了科學(xué)論據(jù)［11］，也為“肺與大腸相表里”的菌群變化規(guī)律性提供了依據(jù)。吳佳佳實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，“從腸治肺”防治過敏性哮喘機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、促使腸道Treg 細(xì)胞、抑制Th17 細(xì)胞的分化，進(jìn)而緩解肺部炎癥有關(guān)［12］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腸道菌群OTU 數(shù)目、Chao1 指數(shù)和Simpson 指數(shù)高于對照組，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王永安等［13］研究結(jié)果一致，其研究表明哮喘小鼠腸道大腸桿菌及腸球菌等致病菌增加，乳酸菌減少；崔芳等［14］實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)哮喘模型小鼠物種豐富度高于對照組；Kho 等［15］研究表明，患病人群腸道益生菌數(shù)量和種類顯著減少，而致病菌增多；NMDS 分析結(jié)果也提示相較于對照組，模型組小鼠腸道菌群組成發(fā)生了一定變化。因此，我們初步推測模型組小鼠物種豐富度和多樣性高可能是因?yàn)槠涮幱趹?yīng)激狀態(tài)，腸道環(huán)境變化，腸道屏障能力下降，無法給益生菌提供適合的生長環(huán)境，從而使有害菌有機(jī)會(huì)大量繁殖［16-17］。

結(jié)合腸道菌群在門和屬水平的物種組成及差異物種分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上，模型組的厚壁菌門（Firmicutes）豐度顯著下降，擬桿菌門（Bacteroidetes）和廣古菌門（Euryarchaeota）數(shù)量明顯增加。研究發(fā)現(xiàn)呼吸道病毒感染小鼠腸道擬桿菌門（Bacteroidetes）數(shù)量增加［18］；厚壁菌門（Firmicutes）能維持機(jī)體免疫系統(tǒng)穩(wěn)定，其豐度下降與炎癥反應(yīng)相關(guān)［15］；Zhang 等［19］研究認(rèn)為廣古菌門（Euryarchaeota）可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在屬水平上，結(jié)合LEfSe 分析及Spearman 系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和普雷沃氏菌科UCG-003 屬（Prevotellaceae UCG-003）與CVA 關(guān)系最為密切。模型組乳酸桿菌屬（Lactobacillus）豐度下降，甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和普雷沃氏菌科UCG-003 屬（Prevotellaceae UCG-003）相對豐度顯著增加，其中乳桿菌屬為腸道有益菌，增強(qiáng)腸道屏障功能，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［20］，普雷沃氏菌屬在宿主內(nèi)比例上升易引起胃腸道不良反應(yīng)，造成腸道環(huán)境紊亂；非小細(xì)胞肺癌患者糞便樣本中富含甲烷短桿菌屬［21］。上述結(jié)果表明，CVA 小鼠存在腸道菌群紊亂，腸道菌群物種豐富度和多樣性增加，可能與致病菌（如甲烷短桿菌屬和普雷沃氏菌科UCG-003 屬）的增多和益生菌（如乳酸桿菌屬）的顯著減少密切相關(guān)，提示小鼠CVA 的發(fā)病可能有腸道菌群的參與。這與臨床上CVA 患者腸桿菌、酵母菌的數(shù)量多于健康人，而雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量少于健康人結(jié)果一致［22］。

鑒于此，我們在CVA 小鼠模型復(fù)制成功的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對CVA 小鼠的腸道菌群進(jìn)行高通量測序分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腸道菌群OTU 數(shù)目、Alpha 多樣性、Beta 多樣性、不同水平上的群落組成、差異物種組成等與對照組小鼠均有較大差異，表明CVA 小鼠伴有腸道菌群紊亂現(xiàn)象，因此，腸道菌群的調(diào)節(jié)可能在CVA 的治療中發(fā)揮不可替代的作用。

3.3 研究意義與不足

本文以“肺與大腸相表里”中醫(yī)理論為切入點(diǎn)，來探究腸道菌群與CVA 的關(guān)系，研究表明腸道菌群與CVA 的發(fā)病密切相關(guān)，為從腸道菌群治療CVA 提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。臨床上治療哮喘常選用氨茶堿、β1 受體阻斷劑、糖皮質(zhì)激素類等藥物，長期使用會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生一定的副作用。補(bǔ)充乳酸桿菌、降低有害菌（腸桿菌、腸球菌）數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡可為臨床治療CVA 提供一條新的思路。但基于腸道菌群組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜及功能多樣的特點(diǎn)，有關(guān)腸道菌群對CVA 的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。