空腸彎曲桿菌誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

李燕，毛玉丹，張幸鼎，牟相宇

（中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518107）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率在癌癥中居第三位，其發(fā)生與腸道微生物有著密切關(guān)系。已有研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬（Bacteroides）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、沙門氏菌屬（Salmonella）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）和彎曲桿菌屬（Campylobacter）等多種腸道病原體與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-4］?？漳c彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni）是一種帶莢膜的革蘭氏陰性桿菌，是常見的人畜共患食源性病原菌之一。人類感染C.jejuni后，會(huì)產(chǎn)生腸胃炎、腹瀉、腹部絞痛以及發(fā)熱的癥狀，并可能會(huì)伴有反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肝炎、格林-巴利綜合征和瑞特氏病等免疫性損傷性疾?。?-6］。C.jejuni81-176 會(huì)通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞致死性膨脹毒素進(jìn)而誘導(dǎo)DNA 損傷，在小鼠模型中促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生［7］。因此，C.jejuni感染不僅會(huì)導(dǎo)致患者產(chǎn)生腸胃炎，還有增加患者罹患結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的可能。然而，在C.jejuni誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌中，宿主基因是如何參與癌癥發(fā)生發(fā)展的，這一點(diǎn)仍不清楚。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序（RNA sequencing，RNA-seq）技術(shù)可以從整體水平上反映細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況［8］。為了更好的了解空腸彎曲菌誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌中的基因表達(dá)情況，本研究使用了C.jejuni誘導(dǎo)的ApcMin/+小鼠結(jié)直腸癌模型，在試驗(yàn)終點(diǎn)分離小鼠結(jié)直腸腫瘤組織以及癌旁組織，分別提取組織RNA 后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析，探索、篩選出差異基因，以提高對(duì)C.jejuni致癌的作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為結(jié)直腸癌的防治提供新的探索方向。

1 材料與方法

1.1 C.jejuni 81-176的培養(yǎng)

人類臨床分離株C.jejuni81-176 用彎曲桿菌屬選擇性培養(yǎng)基在37 ℃下微需氧條件下培養(yǎng)48 h。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)共選用18 只體質(zhì)量約為（18.0±3.0）g，雌性C57 BL∕6ApcMin/+小鼠（5-8 周齡），小鼠購(gòu)買自江蘇集萃藥康公司，于中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院動(dòng)物房SPF 級(jí)環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：N2022003）。隨機(jī)分為兩組，計(jì)為Mock（空白對(duì)照組，n=9）和Campy（C.jejuni處理組，n=9）。分別放入4 籠小鼠籠中（每籠4～5只）。

檢疫合格的小鼠在動(dòng)物房觀察一周后，進(jìn)行打耳標(biāo)標(biāo)記。為了使菌在腸道內(nèi)更容易定植，第1～7天，給小鼠飲用含有4 種混合抗生素的飲用水（100 mg∕L 萬(wàn)古霉素、200 mg∕L 甲硝唑、200 mg∕L 氨芐青霉素和200 mg∕L 新霉素）?？股靥幚砗?，第8 天以1 × 108CFU∕只的量給Campy 組小鼠灌胃C.jejuni，Mock 組以等量PBS 作為對(duì)照灌胃。隨后，在第15～20 天，在飲用水中加入25 g∕L 的葡聚糖硫酸鈉（DSS）。在第60 天，安樂死小鼠，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料取材。關(guān)于腫瘤部位與癌旁組織的取材實(shí)驗(yàn)時(shí)是以肉眼可見的隆起為腫瘤組織部位，以腫瘤中心為圓心距離3 mm 的地方為癌旁，癌旁組織所取的面積約為0.3 cm× 0.3 cm。腸道組織HE 染色由賽維爾生物科技有限公司完成。因Mock 組一只小鼠在予以DSS 水處理期間發(fā)生死亡，本文選用Mock組3只小鼠和Campy組4只小鼠的腫瘤和癌旁部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 RNA提取及文庫(kù)構(gòu)建與高通量測(cè)序

分別取對(duì)照組（3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)）和實(shí)驗(yàn)組小鼠（4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)）的結(jié)腸腫瘤和癌旁組織，放入裝有1 mL RNA later 的2 mL 離心管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存。提取RNA 時(shí)，先向2 mL EP 管中加入1.5 mL TRIzol 裂解液，后取適量組織于液氮保護(hù)下將組織樣品快速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入裂解液，使組織細(xì)胞充分裂解。按Invitrogen TRIzol 試劑盒（賽默飛有限公司）說(shuō)明分別提取組織的總RNA，F(xiàn)ragment analyzer（安捷倫生物有限公司）對(duì)RNA 的質(zhì)量和濃度進(jìn)行評(píng)估，質(zhì)量檢測(cè)合格（28 S∕18 S ＞1.0，RQN 值＞7.0）的樣本用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行），按照SMART cDNA 文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（寶生物工程有限公司）說(shuō)明書分別對(duì)樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫(kù)在BGISEQ 測(cè)序平臺(tái)（華大基因，中國(guó)深圳）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾及參考基因組比對(duì)

本實(shí)驗(yàn)委托華大基因進(jìn)行，具體步驟如下：利用過(guò)濾軟件SOA Pnuke 軟件［9］過(guò)濾低質(zhì)量reads，即去除測(cè)序片段中包含接頭的reads、去除未知堿基N含量大于5%的reads、去除低質(zhì)量（質(zhì)量值低于15的堿基占該reads 總堿基數(shù)的比例大于20%）的reads，篩選獲得clean reads，利用HISAT2 2.0.4 軟件［10］將clean reads 比對(duì)到參考基因組序列，使用Bowtie2 軟件［11］將clean reads 比對(duì)到參考基因序列上得到比對(duì)結(jié)果。比對(duì)完，通過(guò)統(tǒng)計(jì)比對(duì)率、reads在參考序列上的分布情況等，判斷比對(duì)結(jié)果是否通過(guò)第二次質(zhì)控（QC of alignment）。若通過(guò)，則進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。使用RSEM 軟件［12］計(jì)算各個(gè)樣品的基因表達(dá)水平。

1.5 生物信息學(xué)分析

進(jìn)行基因定量分析、基于基因表達(dá)水平的各項(xiàng)分析（主成分、相關(guān)性、差異基因篩選等等），并對(duì)篩選出的樣品間差異表達(dá)基因通過(guò)DAVID 平臺(tái)進(jìn)行g(shù)ene ontology（GO）富集分析和KEGG通路顯著性富集分析等更深入的挖掘分析。

參考物種信息如下，物種名：Mus_musculu，參考基因組版本GCF_000001635.26_GRCm38.p6（NCBI）。

1.6 qRT-PCR驗(yàn)證

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，用qPCR 驗(yàn)證篩選出的差異表達(dá)基因。反應(yīng)條件為95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循 環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析mRNA 表達(dá) 水平。引物由擎科生物科技有限公司合成，詳見二維碼1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 25.0 軟件處理。小鼠腸道腫瘤的數(shù)目的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較經(jīng)KS 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)分布和單因素ANOVA 分析中的方差齊性檢驗(yàn)方差齊性后，使用雙尾未配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì)算。差異基因的篩選和后續(xù)分析基于R 軟件中的DESeq2 程序包進(jìn)行分析，利用Benjamini 法校正后的P值以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，校正后的P值＜0.05 以及|log2fold change|＞2作為顯著差異表達(dá)的閾值。

2 結(jié)果

2.1 C.jejuni誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸癌造模情況

如圖1 所示，Campy 組小鼠的成瘤數(shù)量比Mock組小鼠的成瘤數(shù)顯著性增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)兩組均符合數(shù)據(jù)正態(tài)分布和方差齊性，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，（t=-3.079，P=0.008 ＜0.05）。D 圖展示的腸道HE 染色結(jié)果，Campy 組的腸道黏膜層增厚，中央見壞死區(qū)，上皮細(xì)胞邊緣不清，細(xì)胞核漿比增大，見不少核染色深，核仁明顯，有見核分裂象。Mock 組相較之下結(jié)腸腺體排列規(guī)則，細(xì)胞核比例大小正常。

圖1 C.jejuni促進(jìn)小鼠腫瘤發(fā)生Fig.1 C.jejuni promotes tumorigenesis in mice

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況

2.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控概況 每個(gè)實(shí)驗(yàn)小組小鼠的結(jié)直腸腫瘤以及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，本項(xiàng)目使用BGISEQ 平臺(tái)一共測(cè)了14個(gè)樣品，每個(gè)樣品平均產(chǎn)出6.67G 數(shù)據(jù)。樣品比對(duì)基因組的平均比對(duì)率為90.89%，比對(duì)基因的平均比對(duì)率為68.71%，一共檢測(cè)到18 964 個(gè)基因。測(cè)序質(zhì)量值大于30（Q30）的堿基占所有堿基的89.52%以上，測(cè)序比對(duì)效率均值約在90.25%。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，滿足后續(xù)分析要求（表1）。

表1 小鼠結(jié)直腸樣本RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量Table 1 Quality of RNA-seq data from mouse colorectal samples

2.2.2 基因表達(dá)水平分布 經(jīng)過(guò)預(yù)處理和過(guò)濾后，基因表達(dá)量用FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments）值歸一化表示，即每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的碎片大小，是對(duì)基因長(zhǎng)度和測(cè)序深度進(jìn)行校正后的值。本研究使用箱線圖展示各樣品基因表達(dá)水平的分布情況，評(píng)估各樣本中基因表達(dá)數(shù)據(jù)是否具有對(duì)稱性，分布的分散程度等信息。如圖2 所示，基因表達(dá)于各樣本中差異不大，分散程度相似。

圖2 樣品基因表達(dá)水平分布圖Fig.2 Distribution of gene expression in various samples

2.3 基因表達(dá)差異分析

經(jīng)DEseq2 分析，本試驗(yàn)在篩選的過(guò)程中，將差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）的絕對(duì)值＞4，即|log2FC|＞2，P值＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)熱圖可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)聚類，同一組內(nèi)表達(dá)相似的基因聚類后幾乎都出現(xiàn)在同一簇中。其中，F(xiàn)C 表示的是兩個(gè)組之間基因表達(dá)量的比值。差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）分布情況用火山圖表示。如圖3 所示，通過(guò)測(cè)序結(jié)果顯示，比較Campy 組腫瘤和癌旁組織，即Campy-tumor 與Campy-para，共發(fā)現(xiàn)394個(gè)顯著差異基因，其中341個(gè)基因上調(diào)，53個(gè)基因下調(diào)。比較Campy-tumor 與Mock-tumor，共有501個(gè)顯著差異基因，其中126個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，375 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。比較Campy-para 與Mockpara，共有316 個(gè)顯著差異基因，其中上調(diào)基因215個(gè)，下調(diào)基因101個(gè)。

圖3 樣本間基因表達(dá)差異分析Fig.3 Analysis of gene expression differences between samples

2.4 差異表達(dá)基因GO富集分析

對(duì)Campy 組與Mock 組腫瘤與癌旁組織三種比較組篩選出來(lái)的顯著性差異基因進(jìn)行GO 富集分析，以P＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。GO 富集分析主要包括三個(gè)部分，分子功能（molecular function，F(xiàn)M）、生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）以及細(xì)胞組分（cellular component，CC）。通過(guò)GO 富集分析結(jié)果可以看出，對(duì)比Campy 組腫瘤部位與癌旁部位，如圖4-1 所示，差異基因中的上調(diào)基因在生物學(xué)過(guò)程模塊中，主要富集在肽酶活性的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞的遷移、傷口愈合、白細(xì)胞細(xì)胞-細(xì)胞黏附等，分子功能模塊中，細(xì)胞因子活性、受體配體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合通路富集程度較高；下調(diào)基因在生物學(xué)過(guò)程中表達(dá)量顯著性差異較大的基因主要富集在脂肪酸代謝通路，其余還有脂肪細(xì)胞分化、棕色脂肪細(xì)胞分化通路等。

圖4-1 Campy-tumor 組對(duì)比Campy-para 組差異基因GO富集分析Fig.4-1 GO enrichment of DEGs from Campy-tumor group vs.Campy-para group

可以看出，C.jejuni作用下的小鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展借助表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附因子特異性結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)受體激活，并通過(guò)一系列的蛋白水解、跨膜運(yùn)輸?shù)扔绊懩[瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。

對(duì)比Campy組與Mock組的腫瘤組織，如圖4-2所示，上調(diào)基因中除了主要富集在膜、刷狀緣相關(guān)的細(xì)胞組分通路外，在生物學(xué)過(guò)程中主要富集在陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)其他生物、抗菌肽介導(dǎo)的抗菌體液免疫反應(yīng)、膽固醇平衡和粘膜固有免疫途徑以及分子功能通路的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、血紅素結(jié)合以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等；下調(diào)基因中主要富集在生物學(xué)過(guò)程中的多種免疫相關(guān)通路包括單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B 細(xì)胞、T 細(xì)胞等的增殖和活化通路調(diào)節(jié)，分子功能通路上主要富集到的通路是GTP酶、碳水化合物、細(xì)胞因子等多種蛋白質(zhì)的結(jié)合和調(diào)節(jié)通路。

圖4-2 Campy-tumor組對(duì)比Mock-tumor組差異基因GO富集分析Fig.4-2 GO enrichment of DEGs from Campy-tumor group vs.Mock-tumor group

對(duì)比Campy組和Mock組的癌旁部位，如圖4-3所示，上調(diào)基因中顯著性差異較大的主要富集在生物學(xué)過(guò)程中的其他生物膜破裂、抗菌肽介導(dǎo)的抗菌體液免疫反應(yīng)、抗菌體液反應(yīng)、防御細(xì)菌反應(yīng)和粘膜固有免疫途徑以及分子功能中的多種物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性，與Campy 與Mock 組的腫瘤部位相似；下調(diào)基因中基因表達(dá)差異較大的主要富集在生物學(xué)過(guò)程中的消化途徑和分子功能的絲氨酸類肽酶活性和絲氨酸水解酶活性途徑。

圖4-3 Campy-para組對(duì)比Mock-para組差異基因GO富集分析Fig.4-3 GO enrichment of DEGs from Campy-para group vs.Mock-para group

2.5 KEGG通路分析

對(duì)三種對(duì)比組的差異基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，判斷基因富集的閾值為P＜0.05。我們分別挑選了基因上調(diào)和下調(diào)的富集最顯著的前10 條通路進(jìn)行展示（其中Campy-tumor 組對(duì)比Campypara 組的下調(diào)基因只富集在6 條通路），如圖5 所示。對(duì)于Campy-tumor組和Campy-para組，細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用通路是上調(diào)基因中差異最顯著且富集最多的通路，其余還有IL-17 信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路等；富集最多顯著性最高的下調(diào)基因通路是PPAR 信號(hào)通路，其次是神經(jīng)活性配體-受體相互作用。對(duì)于Campy-tumor 組和Mocktumor組，上調(diào)基因中富集最多的是代謝途徑，富集最顯著的是脂肪的消化和吸收；下調(diào)基因中富集最多且最顯著的是細(xì)胞黏附分子，其余還有細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的互作、癌癥中的通路和NF-κB信號(hào)通路等。關(guān)于Campy-para 組和Mock-para 組，上調(diào)基因富集最多的為代謝途徑，其余還有癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、金黃色葡萄球菌感染和NOD 樣受體信號(hào)通路等；下調(diào)基因富集最多且最顯著的是胰腺分泌，其余還有代謝途徑、蛋白質(zhì)的消化和吸收等。

圖5 KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

2.6 韋恩圖法分析

為了明確C.jejuni誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌（Campy-tumor 組）的基因表達(dá)特點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)了兩個(gè)對(duì)照，分別為Campy-para 組和Mock-tumor 組。前述分析可知，Campy-tumor 與對(duì)照組Campy-para 相比，共發(fā)現(xiàn)394 個(gè)差異表達(dá)基因；而Campy-tumor 與另一個(gè)對(duì)照組Mock-tumor相比，共有501個(gè)差異表達(dá)基因；結(jié)果顯示，有17 個(gè)差異表達(dá)基因（圖6A 紅藍(lán)交匯處），在兩次對(duì)照中均有出現(xiàn)，意味著它們?cè)贑.jejuni誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展可能起到重要作用。

兩個(gè)對(duì)照組之間的比較，即Mock-tumor 與Mock-para 相比，得到1 008 個(gè)差異表達(dá)基因（黃色區(qū)域）。這些基因表達(dá)變化是Apc基因缺失導(dǎo)致的癌變本身即具有的，它們的表達(dá)變化不依賴于C.jejuni的誘導(dǎo)。另一方面，Campy-para 與Mock-para相比，得到316 個(gè)差異表達(dá)基因（綠色區(qū)域）。這些基因表達(dá)變化與C.jejuni感染有關(guān)，但與癌變這一結(jié)果不相關(guān)。因此，為了得到更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕Y(jié)果，我們從上述紅藍(lán)交匯處的17 個(gè)基因減去了與黃色區(qū)域交匯的1 個(gè)基因（紅藍(lán)黃交匯區(qū)）和與綠色區(qū)域交匯的2 個(gè)基因（紅藍(lán)綠交匯區(qū)），剩下14 個(gè)基因。這14 個(gè)基因表達(dá)的變化在C.jejuni誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到了重要且獨(dú)特的作用，因此我們稱其為“核心差異表達(dá)基因”。其中，有5 個(gè)基因（Lipf、Gm1987、Ascl5、Saxo1和Plekhs1）表達(dá)上調(diào)，9 個(gè)基因（Lrp2、Phex、Serpina3c、Fabp4、Vwa3a、Tmem52、Lrrn4、Upk3和Crb2）表達(dá)下調(diào)（表2）。其中表達(dá)量差異超過(guò)30 倍的有：Lipf（1×106倍）、Gm1987（1×103或1×106倍，取決于不同的對(duì)照組）、Ascl5（約32倍）、Phex（約32倍）。

表2 14個(gè)核心差異表達(dá)基因Table 2 Fourteen core DEGs

上述14 個(gè)基因的組間表達(dá)量聚類圖、GO 注釋信息和KEGG 注釋信息如圖6（B-F）所示?？梢钥吹?，在GO 注釋信息里的生物學(xué)過(guò)程模塊里這些差異表達(dá)基因主要參與了細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、生物過(guò)程的調(diào)控、對(duì)刺激的反應(yīng)、代謝通路等過(guò)程；在分子功能模塊，主要參與了結(jié)合功能；在細(xì)胞組分模塊，主要與細(xì)胞和膜相關(guān)。在KEGG 通路注釋信息里，這些核心差異表達(dá)基因主要參與了代謝相關(guān)通路和癌癥發(fā)生相關(guān)通路，代謝相關(guān)通路有：代謝途徑、膽固醇代謝、脂肪消化吸收、脂肪細(xì)胞里的脂肪分解調(diào)節(jié)、甲狀腺激素的合成和甘油酯類代謝通路，與癌癥相關(guān)的通路包括了細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作、趨化因子信號(hào)通路、河馬信號(hào)通路、NFκB信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、刺猬信號(hào)通路。

圖6 韋恩圖法分析與14個(gè)核心DEGs的功能分析Fig.6 Venn diagram analysis and the resulting 14 core DEGs with functional analysis

2.7 qRT-PCR 對(duì)RNA-seq結(jié)果的驗(yàn)證

我們用qRT-PCR 對(duì)上述14 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。與Campy-para 相比，Campy-tumor 中Lipf、Gm1987、Ascl5、Saxo1、Plekhs1mRNA 表達(dá)上調(diào)，Lrp2、Phex、Serpina3c、Fabp4、Vwa3a、Tmem52、Lrrn4、Upk3b、Crb2表達(dá)下調(diào)，升降趨勢(shì)與RNA-seq結(jié)果完全一致，其中有9 個(gè)基因（Gm1987、Saxo1、Plekhs1、Lrp2、Serpina3c、Fabp4、Tmem52、Lrrn4、Upk3b）的表達(dá)兩組間具有顯著性差異（P＜0.05；圖7），表明測(cè)序結(jié)果重復(fù)性較好，可信度較高。

圖7 14個(gè)核心DEGs的qRT-PCR結(jié)果Fig.7 qRT-PCR results of 14 core DEGs

3 討論

已知C.jejuni對(duì)宿主造成疾病主要是依賴運(yùn)動(dòng)、黏附、侵襲和產(chǎn)毒素這些毒力因子［13］，其產(chǎn)生的細(xì)胞致死性膨脹毒素（cytolethal distending toxin，CDT）是目前已知的促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生的關(guān)鍵因素［7］，然而宿主基因是如何參與C.jejuni誘導(dǎo)癌癥發(fā)生的，這一點(diǎn)仍不清楚。因此，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以揭示在C.jejuni誘導(dǎo)的腫瘤中表達(dá)改變的宿主基因。

ApcMin/+小鼠是研究腸道腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的經(jīng)典模型［14］，通過(guò)給ApcMin/+小鼠灌胃C.jejuni81-176 株細(xì)菌誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生，再用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）破壞腸上皮屏障加快建模。通過(guò)評(píng)估小鼠的成瘤情況，我們發(fā)現(xiàn)C.jejuni誘導(dǎo)下的小鼠腫瘤數(shù)量顯著高于對(duì)照組，表明C.jejuni可以促進(jìn)小鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生，與前人的研究［7］相符。在已報(bào)道的動(dòng)物模型中［7］，觀察到C.jejuni誘導(dǎo)的CRC 有兩個(gè)先決條件：即宿主的Apc基因突變和有一個(gè)致炎環(huán)境（如DSS處理）。因此，檢測(cè)到的基因表達(dá)變化可以被描述為當(dāng)前CRC模型（即包含Apc-和DSS 前提）下，C.jejuni誘導(dǎo)的CRC基因表達(dá)變化。

通過(guò)較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?duì)照，我們指出了14 個(gè)可能在C.jejuni誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中起到重要且獨(dú)特作用的基因。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的qRT-PCR 驗(yàn)證，14 個(gè)基因中的9 個(gè)（Gm1987、Saxo1、Plekhs1、Lrp2、Serpina3c、Fabp4、Tmem52、Lrrn4、Upk3b）在結(jié)直腸腫瘤和癌旁部位的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。其中關(guān)于表達(dá)上調(diào)的基因，Plekhs1在人類里也有同源基因，有研究表明它的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了蛋白激酶B 的磷酸化，繼而增加致癌活性，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、存活和侵襲，該基因能促進(jìn)甲狀腺癌的惡化［15］，也可以作為膀胱癌［16］和胃癌［17］的基因標(biāo)志物，但目前關(guān)于它的表達(dá)是如何被調(diào)控的以及和結(jié)直腸癌的關(guān)系尚不清楚。結(jié)直腸作為臨近胃和膀胱的一個(gè)器官，C.jejuni很可能通過(guò)某些方式引起該基因的高表達(dá)，繼而引發(fā)結(jié)直腸癌的發(fā)展。Saxo1編碼微管穩(wěn)定蛋白，對(duì)纖毛等有特異性，目前關(guān)于它的報(bào)道主要關(guān)注在小鼠精子活力方面，鑒于我們的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是雌性小鼠，所以該基因的具體作用還有待探究。還有一個(gè)值得關(guān)注的基因是Gm1987，目前尚沒有在Pubmed 數(shù)據(jù)庫(kù)里發(fā)現(xiàn)有關(guān)該基因的數(shù)據(jù)，但它在我們的研究中提示參與了多條信號(hào)通路，包括有細(xì)胞因子-細(xì)胞因子信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路以及趨化因子信號(hào)通路，這些都是癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中極其重要的通路，所以該基因值得進(jìn)一步探究。

關(guān)于我們篩選出的C.jejuni誘導(dǎo)結(jié)直腸癌有關(guān)的表達(dá)下調(diào)的6 個(gè)核心差異表達(dá)基因，只有2 個(gè)基因有被報(bào)道與CRC 有關(guān)。Fabp4是一種編碼脂肪酸結(jié)合蛋白4 的基因，人類基因組上也有同源基因。有報(bào)道表明在CRC 患者的腫瘤細(xì)胞中FABP4蛋白表達(dá)降低，推測(cè)FABP4 參與了PPARγ 通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲［18］。Lrrn4編碼富含亮氨酸重復(fù)序列神經(jīng)元4 蛋白，先前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，LRRN4 在正常結(jié)腸組織中的豐度較低，在CRC組織中的水平更低［19］。然而前不久的一項(xiàng)研究表明它在CRC 中無(wú)論是mRNA 還是蛋白水平的表達(dá)都較高，其通過(guò)RAS∕MAPK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的幾種惡性表型［20］。這種矛盾的結(jié)果可能是由于方法或者樣本數(shù)不同引起的。還有一篇文獻(xiàn)報(bào)道了Lrrn4和我們篩選的另一個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因Upk3b它們編碼的蛋白LRRN4 和uroplakin 相較于原代間皮細(xì)胞在間皮瘤內(nèi)表達(dá)下調(diào)或缺失［21］，但與CRC 相關(guān)的研究目前沒有任何報(bào)道。Lrp2編碼低密度脂蛋白相關(guān)蛋白2 或維生素D 相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白megalin，它在結(jié)腸等多個(gè)上皮細(xì)胞系中表達(dá)［22］，目前還沒有研究調(diào)查L(zhǎng)rp2與CRC 之間的可能關(guān)聯(lián)，但與Lrp2相關(guān)的基因Cubn曾在一項(xiàng)薈萃分析里報(bào)道與CRC 存在一定的關(guān)系［23］。Serpina3c是小鼠中人類SERPINA4基因的一個(gè)分支，是調(diào)節(jié)脂肪生成過(guò)程中信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因素，它可以通過(guò)Wnt∕βcatenin-PPARγ途徑參與脂肪分化的調(diào)節(jié)，在Serpina3c-/-小鼠中引起脂肪細(xì)胞分化受損［24］。雖然目前沒有報(bào)道它與癌癥的直接關(guān)系，但脂肪代謝的紊亂往往會(huì)促進(jìn)癌癥的發(fā)展。關(guān)于Tmem52基因，有少量的文獻(xiàn)介紹其在肺腺癌組織中表達(dá)上升［25］?？偟脕?lái)說(shuō)，我們推測(cè)可能是這些表達(dá)下調(diào)的基因所編碼的產(chǎn)物沒有為腫瘤提供競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，所以在腫瘤部位的表達(dá)會(huì)受抑制。有趣的是，在我們的研究中篩選出來(lái)的核心差異表達(dá)基因，大多數(shù)目前還沒有被報(bào)道與CRC 之間的關(guān)系，這值得將來(lái)進(jìn)一步的探索。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)篩選出來(lái)的差異基因進(jìn)行GO富集、KEGG 通路富集分析，Campy組與Mock組相比，差異基因參與了機(jī)體許多重要的生物學(xué)過(guò)程：生物膜破裂、蛋白質(zhì)水解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及與細(xì)菌引起的免疫反應(yīng)相關(guān)的通路：抗菌肽介導(dǎo)的抗菌體液免疫反應(yīng)、抗菌體液反應(yīng)、防御革蘭氏陽(yáng)∕陰性細(xì)菌反應(yīng)和粘膜固有免疫途徑。之前的研究表明，通過(guò)對(duì)C.jejuni81-176感染的無(wú)菌ApcMin/+小鼠的遠(yuǎn)端結(jié)腸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，C.jejuni感染的小鼠中有兩條致癌途徑富集——神經(jīng)活性配體-受體相互作用和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用［7］，在我們的Campy 組與Mock 組對(duì)比以及Campy 組的腫瘤與癌旁組織對(duì)比中也有這兩條通路的富集。此外，代謝通路在Campy 組對(duì)比Mock 組中富集最顯著，提示著C.jejuni感染下代謝反應(yīng)相當(dāng)活躍。綜上，差異基因參與了多條重要的生物學(xué)通路，提示結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展通過(guò)代謝、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)通路進(jìn)行。需要指出的是，本研究campy-tumor-2 號(hào)小鼠的基因表達(dá)情況與該組其它小鼠差異明顯，然而該鼠的腫瘤數(shù)量（4 個(gè)）與該組平均水平（4 個(gè)）相當(dāng)。我們認(rèn)為此小鼠組學(xué)數(shù)據(jù)的不同是個(gè)體差異性所致，我們將在后續(xù)研究中擴(kuò)大樣本量來(lái)平衡個(gè)體差異問題。

綜上所述，本研究通過(guò)較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?duì)照，指出了9 個(gè)可能在C.jejuni誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要且獨(dú)特作用的基因：Gm1987，Plekhs1，Saxo1，Lrp2，Serpina3c，F(xiàn)abp4，Tmem52，Lrrn4，Upk3b。為后續(xù)研究這些基因在C.jejuni誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌中的作用提供了新的方向和思路。需要指出的是，關(guān)于這“9 個(gè)宿主基因”，我們目前得出的結(jié)論是“可能”參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，我們將在后續(xù)的研究中擴(kuò)大樣本量，并對(duì)上述基因進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。