組蛋白去乙?；敢种苿┩ㄟ^下調(diào)MCM2-7表達抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖

李慧鋒，袁忠民，3，吳森斌，馬瑩，趙凡一，何偉文，2，梁建峰，2，伍健偉，2

（1.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學研究所，廣東廣州 510260；2.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院番禺院區(qū)神經(jīng)外科，廣東廣州 511400；3.粵港澳大灣區(qū)腦科學與類腦研究中心，廣東廣州 510515）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤（glioma）是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，由于其浸潤性生長和放化療耐藥性，膠質(zhì)瘤的復發(fā)率高，預后差，死亡率高［1-2］。因此，研究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制及尋找新的靶向性藥物，對于治療膠質(zhì)瘤和改善預后具有重要意義。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors，HDACIs）是一類新型的抗癌藥物，它能夠抑制腫瘤生長、阻滯細胞周期、誘導細胞分化和凋亡［3-4］。根據(jù)化學結構的不同可分為四類：短鏈脂肪酸類，如NaBu 和VPA；異羥肟酸類，如TSA、SAHA 和LBH589；苯酰胺類，如MS-275 和M344；環(huán)肽類，如FK-228。其中，SAHA 已被FDA 批準用于治療皮膚性淋巴癌，其它組蛋白去乙?；敢种苿┮苍谶M行腫瘤治療的臨床試驗［5］。微小染色體維持蛋白（minichromosome maintenance proteins，MCMs）是一類DNA 復制起始時發(fā)揮關鍵作用的解旋酶，參與每個細胞周期內(nèi)的新DNA 生成［6］。MCM2、3、4、5、6 和7 在G1 期早期形成MCM2-7 六聚體加載到DNA 復制起始位點，在G1 后期形成MCM2-7 雙六聚體啟動S 期DNA 復制。在癌細胞中MCM2-7高表達，這使得六聚體向雙六聚體轉(zhuǎn)換時間較正常細胞短，加速細胞周期，促進細胞惡性增殖［7-8］。本研究利用多種HDACIs 處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U251 和H4，觀察對細胞增殖、細胞周期及MCM2-7 表達的影響，探討HDACIs 抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人膠質(zhì)瘤細胞株U251 和H4 細胞由國家實驗細胞資源共享平臺提供。高糖培養(yǎng)基DMEM 和0.25%胰酶購自Invitrogen 公司，胎牛血清購自Gibco 公司。LBH589、M344、SAHA、TSA 和CPX 購自Selleck公司。RT-qPCR試劑購自日本Toyobo 公司。96 孔板和6 孔板購自NEST 公司。Anti-BrdU、anti-MCM2、anti-MCM7、anti-Ac-H3K9、anti-Ac-H3K27 和anti-H3購自Cell Signaling Technology。Anti-MCM3 和anti-MCM6 購自生工生物工程有限公司，Anti-MCM4、anti-MCM5 和anti-GAPDH 購自Proteintech公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)及藥物處理方法 用體積分數(shù)10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)U251 和H4 細胞，設置培養(yǎng)箱溫度為37 ℃，CO2濃度為5%，每2～3 d 用胰酶消化傳代1 次。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。HDACIs 儲存濃度為1 000×工作濃度，溶劑為DMSO。環(huán)丙沙星鹽酸鹽溶于水，儲存濃度為分別為0.05mmol∕L×200，0.2 mmol∕L×200，0.5 mmol∕L×200，1.0 mmol∕L×200，使用時用培養(yǎng)基200倍稀釋。

1.2.2 MTT 法檢測組蛋白去乙?；敢种苿251 和H4 細胞增殖的影響 將對數(shù)期生長U251和H4細胞用胰酶消化后接種于96孔板，每孔100μL細胞懸液，每組設6 個平行復孔。當細胞生長至融合度為50%時，分別用0.2、0.5、1.0 和2.0 μmol∕L LBH589 處理U251 和H4 細胞24 h。用0.5 μmol∕L LBH589 處理U251 和H4 細胞8、12、16 和24 h。多種組蛋白去乙?；敢种苿?.5 μmol∕L LBH589、1.0μmol∕L M344 和1.0μmol∕L SAHA）處理24 h，對照組加入等量溶劑DMSO，MTT 法檢測細胞存活率，方法同上。處理結束后每孔加入10μL MTT 溶液（5 g∕L）繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，每孔加入100μL二甲基亞砜（DMSO），搖床振蕩10min，用酶標儀檢測490 nm 波長下各孔的吸光度值［9］。

1.2.3 BrdU 摻入試驗檢測組蛋白去乙酰化酶抑制劑對U251 細胞DNA 復制的影響 6 孔板U251細胞密度達到60%至70%時，分別用0.5μmol∕L LBH589、0.5μmol∕L TSA 處理U251 細胞，對照組加入等量溶劑，24 h 后向培養(yǎng)基中加入終濃度為10μmol∕L 5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo deoxyuridine，BrdU），培養(yǎng)箱孵育4 h，40 g∕L 多聚甲醛室溫固定30min，用PBS洗3遍后加入2mol∕L的鹽酸（溶于0.1%Tween-20 的PBS）37 ℃孵育30 min，正常山羊血清封閉1 h，加入BrdU 一抗（1：100），4 ℃過夜，再用PBS洗3次，加入Cy3標記的二抗室溫孵育1 h。洗3 遍后，用Hochest33258 室溫染核10 min，免疫熒光顯微鏡觀察并拍照［10-11］。

1.2.4 流式細胞儀檢測多種組蛋白去乙酰化酶抑制劑對U251 和H4 細胞周期的影響 用多種組蛋白去乙?；敢种苿?.5 μmol∕L LBH589、1.0μmol∕L M344 和1.0μmol∕L SAHA）處理U251和H4細胞12h后，使用PBS洗一遍，胰酶消化吹散后收集于1.5mL EP管，離心（4 ℃，644×g，5 min，r=9.5 cm）后棄上清，加入1 mL PBS 洗兩遍，4 ℃，644×g，r=9.5 cm，離心5 min。加入75%溶于PBS的乙醇500 μL，于-20 ℃冰箱過夜后離心棄上清，PBS 洗兩遍，加入500μL 溶于PBS 終濃度為50μg∕mL 的碘化丙啶（Propidium iodide，PI）于室溫避光染色30 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期［12］。

1.2.5 RT-qPCR 法檢測組蛋白去乙酰化酶抑制劑對U251 和H4 細胞MCM2-7 mRNA 表達的影響用多種組蛋白去乙?；敢种苿?.5 μmol∕L LBH589、1.0 μmol∕L M344 和1.0 μmol∕L SAHA）處理U251和H4細胞12 h后，用Trizol法提取總RNA，RT-qPCR 分別檢測MCM2-7 的表達。引物序列見表1。

表1 MCM2-7及GAPDH引物序列Table 1 Primers of MCM2-7 and GAPDH

1.2.6 Western blotting 檢測組蛋白去乙酰化酶抑制劑對U251和H4細胞MCM2-7蛋白表達的影響組蛋白去乙?；敢种苿?.5 μmol∕L LBH589、1.0 μmol∕L M344 和1.0 μmol∕L SAHA）處理U251和H4細胞12 h后，每孔加入2 mL冰PBS洗兩遍后，用加入蛋白酶抑制劑的IP buffer 收集細胞，BCA 法測定蛋白濃度并配平。灌制4%集成膠和10%分離膠，200 V 電壓電泳45 min，100 V 電壓轉(zhuǎn)膜100 min，50 g∕L 脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加入一抗（Anti-MCM2-7、anti-AcH3K9、anti-AcH3K27、anti-H3 1：1 000 和 anti-GAPDH 1：10 000）4 ℃孵育過夜，回收一抗后再分別加入HRP標記抗兔或抗鼠二抗室溫孵育1 h，ECL 發(fā)光后曝光。

1.2.7 MTT 法檢測CPX 對U251 和H4 細胞增殖的影響 分別用不同濃度CPX（0.05、0.2、0.5 和1.0 mmol∕L）處理U251 和H4 細胞24 h，0.5 mmol∕L CPX處理U251 和H4 細胞不同時間（8、12、16 和24 h），MTT法檢測相對細胞數(shù)，方法同上。

1.2.8 流式細胞術檢測CPX 對細胞株U251 和H4細胞周期的影響 用0.5 mmol∕L 的環(huán)丙沙星處理U251 或H4 細胞12 h 后，流式細胞儀檢測細胞周期，方法同上。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示。3 組及以上樣本的均數(shù)比較采用單因素方差分析，隨后的組間比較如符合方差齊性采用LSD 法，否則采用Dunnett-t3 檢驗。P＜0.05 被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HDACIs 對U251和H4細胞增殖的影響

2.1.1 不同濃度LBH589對U251及H4細胞增殖的影響 分別用0.2、0.5、1.0 和2.0μmol∕L LBH589 處理U251及H4細胞24 h后，MTT 法測定吸光度值后統(tǒng)計分析每組相對細胞數(shù)。差異具有統(tǒng)計學意義（U251：F=229.200，P=0.000，H4：F=32.328，P=0.000，圖1A）。采用LSD 法進一步作兩兩比較，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），LBH589 濃度0.2 μmol∕L 與0.5 μmol∕L 組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），LBH589 濃度為0.5 μmol∕L達到半數(shù)抑制濃度后隨濃度增加相對細胞數(shù)差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.1.2 0.5μmol∕LLBH589作用不同時間對U251和H4細胞增殖的影響分別用0.5μmol∕L LBH589 處理U251 和H4 細胞8、12、16 和24 h，相對細胞數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義（U251：F=67.211，P=0.000，H4：F=53.195，P=0.000；圖1B）。采用LSD 法進一步兩兩比較，除了U251 細胞8 h 組與對照組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）外，其他處理與對照組相比，相對細胞數(shù)均減少（P＜0.05）。隨著處理時間的延長，相對細胞數(shù)越少（P＜0.05）。

2.1.3 不同種類組蛋白去乙?；敢种苿251和H4細胞增殖的影響分別用0.5μmol∕LLBH589、1.0μmol∕L M344 和1.0μmol∕L SAHA 處理U251 和H4 細胞24 h 后，MTT 法測定吸光度后統(tǒng)計相對細胞數(shù)，差異具有統(tǒng)計學意義（U251：F=26.600，P=0.000，H4：F=55.461，P=0.001；圖1C 和D）。采用LSD 法進一步統(tǒng)計分析，與對照組相比，相對細胞數(shù)均減少（P＜0.05）。

圖1 HDACIs抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖Fig.1 HDACIs suppresses the proliferation of glioma cells

2.2 HDACIs抑制U251細胞的DNA合成

用0.5 μmol∕L LBH589、0.5 μmol∕L TSA處理U251 細胞24 h 后，加入BrdU 繼續(xù)孵育4 h 后檢測細胞增殖率。與對照組比較，BrdU 的摻入率降低，差異具有統(tǒng)計學意義（F=161.628，P=0.000；圖2）。采用LSD 法進一步作兩兩比較，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 HDACIs抑制U251細胞DNA合成Fig.2 HDACIs suppresses DNA synthesis of U251 cells

2.3 HDACIs阻滯U251和H4細胞周期

分別用0.5 μmol∕L LBH589、1.0 μmol∕L M344和1.0μmol∕L SAHA處理U251和H4細胞12 h后，流式細胞儀檢測細胞周期，細胞周期的S 期的比例差異具有統(tǒng)計學意義（U251：F=4.478，P＜0.05；H4：F=3.821，P＜0.05；圖3）。采用LSD法進一步兩兩分析，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 HDACIs減少U251和H4細胞周期的S期在整個細胞周期比率Fig.3 HDACIs reduce the S-phase of U251 cell cycle

2.4 HDACIs下調(diào)U251 和H4 細胞內(nèi)MCM2-7 mRNA水平

分別用0.5 μmol∕L LBH589、1.0 μmol∕L M344和1.0 μmol∕L SAHA 處理U251 和H4 細胞12 h 后，RT-qPCR 檢測MCM2-7 mRNA 的表達。與對照組相比，MCM2-7 的表達均減少，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

HDACIs 處理U251（圖4A）和H4（圖4B）細胞株MCM2-7 的統(tǒng)計結果分別為：MCM2（U251：F=1036.480，P=0.000，H4：F=77.715，P=0.000）；MCM3（U251：F=158.980，P=0.000，H4：F=381.592，P=0.000）；MCM4（U251：F=657.406，P=0.000，H4：F=83.059，P=0.000）；MCM5（U251：F=803.059，P=0.000，H4：F=382.211，P=0.000）；MCM6（U251：F=352.036，P=0.000，H4：F=88.841，P=0.000）；MCM7（U251：F=49.167，P=0.000，H4：F=325.376，P=0.000）。

圖4 HDACIs下調(diào)MCM2-7 mRNA水平Fig.4 HDACIs inhibit MCM2-7 mRNA expression

2.5 HDACIs減少U251 和H4細胞MCM2-7 蛋白表達

為了探討組蛋白去乙?；敢种苿┦欠褚惨种颇z質(zhì)瘤細胞MCM2-7蛋白的表達，用多種組蛋白去乙?；敢种苿ò?.5 μmol∕L LBH589、1.0μmol∕L M344 和1.0 μmol∕L SAHA）處理U251 和H4細胞12 h 后，Western blotting 結果顯示，與對照組相比，MCM2-7 蛋白表達均減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖5）。

圖5 HDACIs減少U251和H4細胞MCM2-7 蛋白表達Fig.5 HDACIs inhibit MCM2-7 protein expression

U251 和H4 細胞株MCM2-7 蛋白表達的統(tǒng)計結果分別為：MCM2（U251：F=19.770，P=0.000，H4：F=61.786，P=0.000）；MCM3（U251：F=21.068，P=0.000，H4：F=211.440，P=0.000）；MCM4（U251：F=162.830，P=0.000，H4：F=55.091，P=0.000）；MCM5（U251：F=24.646，P=0.000，H4：F=1 132.800，P=0.000）；MCM6（U251：F=41.849，P=0.000，H4：F=103.920，P=0.000）；MCM7（U251：F=52.731，P=0.000，H4：F=113.600，P=0.000）。

Ac-H3K9（U251：F=29.615，P=0.000，H4：F=358.502，P=0.000）；Ac-H3K27（U251：F=370.974，P=0.000，H4：F=13.960，P=0.002）。

2.6 環(huán)丙沙星抑制MCM2-7 活性對U251 和H4細胞增殖的影響

2.6.1 不同濃度環(huán)丙沙星對U251 和H4 細胞增殖的影響 環(huán)丙沙星（CPX）是解旋酶MCM2-7 活性抑制劑，為了確定抑制MCM2-7 后U251 細胞的增殖率是否降低，MTT 法檢測向U251和H4細胞后加入0.05、0.2、0.5和1.0 mmol∕L CPX 24 h后，各組相對細胞數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義（U251：F=65.099，P=0.000，H4：F=287.348，P=0.000；圖6A），進一步對U251 和H4細胞采用LSD法兩兩比較，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），隨著濃度的增大，細胞增殖率逐漸減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.6.2 環(huán)丙沙星作用不同時間對U251和H4細胞增殖的影響 用0.5 mmol∕L 的環(huán)丙沙星分別作用U251 和H4 細胞8、12、16 和24 h 后，MTT 法檢測細胞相對數(shù)，差異具有統(tǒng)計學意義（U251：F=152.488，P=0.000，H4：F=187.348，P=0.000；圖6B）。

圖6 環(huán)丙沙星抑制膠質(zhì)瘤細胞U251和H4增殖Fig.6 CPX suppresses the proliferation of glioma cells

2.7 環(huán)丙沙星阻滯U251和H4細胞周期

為了確定抑制MCM2-7后U251和H4細胞周期是否改變，流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)加入0.5 mmol∕L CPX 12 h 后，與對照組相比，U251 和H4 細胞周期S 期均顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義（U251：t=5.306，P=0.000，H4：t=2.306，P=0.000；圖7）。

圖7 環(huán)丙沙星減少U251和H4細胞周期的S期Fig.7 CPX reduces the S-phase of U251 and H4 cells cell cycle

3 討論

由于局部侵襲性強且缺少針對性治愈方法，膠質(zhì)瘤是目前最具致命性的癌癥之一。盡管手術切除和放化療手段在不斷提高，膠質(zhì)瘤生存率仍未得到改善［13-14］。分子生物學的發(fā)展提高了對膠質(zhì)瘤發(fā)病機制的認識，完善了膠質(zhì)瘤的診斷、分級和治療手段。惡性膠質(zhì)瘤伴隨DNA 復制能力增強的特點，DNA 復制調(diào)控蛋白MCM2-7 的表達與腫瘤的WHO分級密切相關［15-16］。

乙酰化和去乙?；膭討B(tài)平衡調(diào)節(jié)著基本的生理功能如細胞存活、死亡、周期等，而乙?；Ш庖鸬幕虮磉_異常會導致上述功能紊亂，繼而造成多種疾病的發(fā)生［17-18］。特別是，HDACs活性增強介導的去乙?；录驯蛔C明是膠質(zhì)瘤等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要病理原因［19］。在這種微環(huán)境條件下，一系列抑癌基因如p21、p16、Rb 的表達下調(diào)，而原癌基因如Raf1、EGFR、c-Jun 高表達，促進癌癥發(fā)生［20-21］。我們發(fā)現(xiàn)HDACs 活性介導了MCM2-7 表達，增強了DNA 復制能力，這可能是腫瘤細胞適應惡性增殖的一種特征。HDACs 的底物包括組蛋白和非組蛋白，它們一方面通過去乙酰化核小體上組蛋白H3、H4、H2A 和H2B，使染色體結構重塑以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［22］。另一方面，還通過改變轉(zhuǎn)錄因子乙?；癄顟B(tài)，影響其活性，調(diào)控基因表達［23］。但HDACs通過何種機制調(diào)控MCM2-7表達，尚需進一步研究。

總之，本研究闡明了HDACIs 抑制MCM2-7 表達和DNA 復制起始進程是其重要抗癌機制之一。另一方面，這些研究結果還表明在膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)MCM2-7 的表達依賴HDACs 活性，高活性的HDACs 促進MCM2-7 表達以增強DNA 復制能力，適應惡性增殖。我們的研究不僅揭示了HDACIs的抗癌新機制，還首次報道了MCM2-7 表達依賴HDACs 活性，為認知膠質(zhì)瘤的發(fā)生本質(zhì)和靶向治療提供了新的理論和實驗依據(jù)。