北方漢族31個(gè)X染色體短串聯(lián)重復(fù)片段突變及遺傳多態(tài)性研究

徐妍，劉巖，郝世誠(chéng)，張金佩，劉革新，陶玉婷，王顯眾，袁麗

（中國(guó)政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

女性含有兩條X 染色體，除連鎖基因外，在減數(shù)分裂時(shí)可以發(fā)生同源重組，隨機(jī)遺傳給子代一條X 染色體，與常染色體類似。男性體內(nèi)只有一條X染色體，且除擬常染色區(qū)外，X 染色體與Y 染色體缺乏同源重組［1］，因此減數(shù)分裂時(shí)男性個(gè)體的XSTR 以一種類似于Y-STR 的單倍型方式傳遞給其女兒。這種獨(dú)特的遺傳方式使X-STR 在含有女性的親緣關(guān)系鑒定案件，如全同胞姐妹、同父異母半同胞姐妹、祖母和孫女、父女、母子或母女、三聯(lián)體鑒定中［2-3］能夠發(fā)揮獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值，并且可以利用X-STR 的基因頻率或單倍型頻率計(jì)算親緣關(guān)系的似然率。當(dāng)然，當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用多個(gè)X-STR 檢驗(yàn)時(shí)需關(guān)注基因座之間是否存在連鎖不平衡，以及突變等問(wèn)題［4］。在一些家系重建案件中，檢驗(yàn)更多的X-STR 來(lái)獲得更多的遺傳信息［5］，以推導(dǎo)出重建人員更多確切的基因分型，往往能獲得非常好的效果。既往報(bào)道的X-STR 基因座數(shù)量有限，而在復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定時(shí)往往需要檢測(cè)更多的XSTR，這些基礎(chǔ)群體數(shù)據(jù)缺乏，亟需有群體遺傳信息來(lái)支撐案件的分析?；谝陨媳尘埃疚膶?duì)北方漢族群體和家系樣本檢測(cè)31 個(gè)X-STR 基因座，開展了X-STR 遺傳多態(tài)性、連鎖不平衡檢驗(yàn)和突變情況的研究。

1 材料與方法

1.1 樣本

在獲取知情同意條件下采集209 個(gè)中國(guó)北方漢族家系樣本，具體為：205 個(gè)母親-女兒-父親三聯(lián)體，2 個(gè)母親-女兒二聯(lián)體，2 個(gè)父親-女兒二聯(lián)體。所有家系樣本已經(jīng)常染色體STR檢驗(yàn)，親權(quán)指數(shù)均超過(guò)10 000，支持有親子關(guān)系。家系樣本用于觀察31 個(gè)X-STR 基因座在414 次減數(shù)分裂過(guò)程中的突變率。選擇所有家系中母親∕父親樣本，分別組成207個(gè)女性∕男性無(wú)關(guān)個(gè)體群體，總共無(wú)關(guān)個(gè)體為414 人。本研究所設(shè)計(jì)樣本實(shí)驗(yàn)均經(jīng)中國(guó)政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)研究院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［批準(zhǔn)號(hào)No.2020003］，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

1.2 X-STR分型檢測(cè)

用Chelex-100 法提取基因組DNA。分別按照AGCU X19 STR 試劑盒和MicroreaderTM19X Direct ID System試劑盒說(shuō)明書擴(kuò)增各樣本DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Applied Biosystems 3130 遺傳分析儀檢測(cè)、Gene-Mapper?ID-X v1.4軟件分析，獲得31個(gè)X-STR基因座的基因型，分別為DXS101、DXS981、DXS6789、DXS6795、DXS6800、DXS6803、DXS6807、DXS6809、DXS6810、DXS7132、DXS7133、DXS7423、DXS7424、DXS8378、DXS9902、DXS9907、DXS10074、DXS10075、DXS10079、DXS10101、DXS10103、DXS10134、DXS10135、DXS10148、DXS10159、DXS10162、DXS10164、GATA165B12、GATA172D05、GATA31E08和HPRTB。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)于209 個(gè)家系的X-STR 分型結(jié)果，依據(jù)遺傳規(guī)律觀察是否存在突變的基因座，并計(jì)算發(fā)生突變的基因座突變率。僅針對(duì)207 例女性X-STR基因座結(jié)果，使用Arlequin v3.5 軟件進(jìn)行31 個(gè)XSTR 遺傳標(biāo)記的Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)及連鎖不平衡檢驗(yàn)。使用Arlequin v3.5 軟件對(duì)男、女群體等位基因頻率分布進(jìn)行顯著性差異分析。使用StatsX v2.0 軟件統(tǒng)計(jì)各基因座的等位基因頻率、觀察雜合度（heterozygosity observed，Hobs）、期望雜合度（expected heterozygosity，Hexp）、基因差異度（gene diversity，GD）、女性個(gè)人識(shí)別率（discrimination power of female，DPF）、男性個(gè)人識(shí)別率（discrimination power of male，DPM）、多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）、平均父權(quán)排除概率（mean exclusion chance，MEC）：父女或母子二聯(lián)體X 染色體標(biāo)記的平均父權(quán)排除概率（MEC_Desmarais_duo）、涉及女兒的三聯(lián)體X 染色體標(biāo)記的平均父權(quán)排除概率（MEC_Desmarais）。此外，將本研究的北方漢族群體分別與德國(guó)、日本、廣東漢族、四川藏族群體［6-9］進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 31個(gè)X-STR基因座的突變情況

根據(jù)遺傳規(guī)律觀察209個(gè)家系的X-STR 分型，經(jīng)分析在19個(gè)基因座（DXS981、DXS10148、DXS7132、HPRTB、DXS9907、DXS10162、DXS7424、DXS10159、DXS10075、GATA172D05、DXS10135、DXS9902、DXS6810、DXS10164、DXS10101、DXS10079、DXS10103、DXS6789、GATA165B12）上發(fā)現(xiàn)29 個(gè)新發(fā)突變。總家系平均突變率為0.002 3。在這19 個(gè)X-STR 基因座上突變率最高的基因座 是DXS10135，為0.012 1；其次是HPRTB，為0.007 2；DXS7132、DXS10159、DXS981、DXS10162基因座突變率均為0.004 8（表1）。

2.2 31個(gè)X-STR基因座的遺傳多態(tài)性

207 例女性樣本的31 個(gè)X-STR 基因座基因型分布P 值均大于0.05，均符合Hardy-Weinberg 平衡。414 例無(wú)關(guān)個(gè)體的31 個(gè)X-STR 基因座共檢測(cè)出了344 個(gè)不同的等位基因。對(duì)男、女群體等位基因分布頻率進(jìn)行顯著性差異分析后的P值均大于0.05，表明31 個(gè)X-STR 等位基因頻率分布在男、女兩個(gè)群體中不存在顯著差異，同時(shí)女性群體符合Hardy-Weinberg 平衡，故將女性、男性樣本合并計(jì)算每個(gè)基因座的等位基因頻率。表2 列出了合并后的基因座等位基因頻率。等位基因的頻率分布在0.001 6-0.810 0 之間，其中DXS6800 的等位基因16頻率最高，為0.810 0。

表2 31個(gè)X-STR基因座在中國(guó)北方漢族群體中的等位基因頻率Table 2 Allele frequencies of 31 X-STR loci in Northern Han of Chinese（n=414）

續(xù)表

續(xù)表

中國(guó)北方漢族群體31個(gè)X-STR基因座的法醫(yī)學(xué)參數(shù)見表3。31 個(gè)X-STR 基因座的PIC 在0.312 7-0.912 4之間，DPM在0.330 5-0.918 1之間，DPF在0.534 0-0.987 6之間，MEC_Desmarais 在0.312 7-0.912 4，MEC_Desmarais_duo 在0.193 5-0.844 6之間。根據(jù)ChrX-STR.org 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∕∕www.chrx-str.org∕）中的公式，31個(gè)X-STR的女性群體累積個(gè)人識(shí)別概率為1-1.578 4×10-31，男性群體累積個(gè)人識(shí)別概率為1-4.566 4×10-19。累積的平均父權(quán)排除概率，三聯(lián)體為1-2.281 9×10-17，二聯(lián)體為1-2.509 0×10-12。

表3 31個(gè)X-STR基因座在中國(guó)北方漢族群體中的法醫(yī)學(xué)參數(shù)Table 3 Forensic parameters of 31 X-STR loci in Northern Han of Chinese

2.3 31個(gè)X-STR基因座的連鎖不平衡分析結(jié)果

在31 個(gè)X-STR 基因座配對(duì)組成的465 個(gè)配對(duì)基因座中，一共30 對(duì)基因座連鎖不平衡檢驗(yàn)P＜0.05，見表4。經(jīng)Bonferroni校正（0.05∕465=0.000107 526 9），仍有1對(duì)基因座（DXS10103-DXS10101）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，存在連鎖不平衡。DXS10103-DXS10101 單倍型共有60 種，單倍型頻率在0.004 8-0.087 0 之間（表5），其中單倍型16-31的頻率最高，為0.087 0。

表4 連鎖不平衡檢驗(yàn)中P值小于0.05的基因座對(duì)Table 4 Locus pairs with P value less than 0.05 in linkage disequilibrium test

表5 DXS10103-DXS10101單倍型頻率Table 5 Haplotype frequency of DXS10103-DXS10101

2.4 北方漢族群體與其他四個(gè)群體之間X-STR基因座等位基因頻率分布的比較

本研究的北方漢族群體分別與德國(guó)、日本、廣東漢族、四川藏族群體比較P值見表6。北方漢族群體與德國(guó)群體在可比較的13 個(gè)基因座上均存在明顯差異，與日本群體在可提供數(shù)據(jù)比較的14 個(gè)基因座中有8 個(gè)基因座存在差異，與廣東漢族群體在11個(gè)基因座中的3個(gè)基因座上存在差異、與四川藏族群體在可比較的19 個(gè)基因座中的6 個(gè)基因座上存在差異。

表6 北方漢族群體與其他四個(gè)群體之間X-STR基因座等位基因頻率分布的差異檢驗(yàn)結(jié)果Table 6 Difference test results of allele frequency distribution of X-STR loci between northern Han population and other four populations

3 討論

經(jīng)家系分析，31個(gè)X-STR在414次減數(shù)分裂中發(fā)生了29 個(gè)突變，且均為一步突變，未觀察到有一個(gè)家系出現(xiàn)2 個(gè)突變。除4 個(gè)突變來(lái)源不明外，有22 個(gè)突變來(lái)源于父親，有3 個(gè)突變來(lái)源于母親，父源性突變與母源性突變的觀察值比例約為7.3：1，表明了父源性突變相比較于母源性突變來(lái)說(shuō)更容易發(fā)生。這種突變機(jī)率的差異可能來(lái)源于生殖細(xì)胞分化形成卵子和精子過(guò)程中細(xì)胞分裂次數(shù)的差異［10］。對(duì)于女性來(lái)說(shuō)，分裂形成卵子的卵原細(xì)胞在胚胎發(fā)育結(jié)束時(shí)幾乎已經(jīng)確定，而對(duì)于男性來(lái)說(shuō)，精原細(xì)胞能不斷地進(jìn)行有絲分裂，增加細(xì)胞數(shù)量并分化為精母細(xì)胞。因此，相比于卵子，精子的形成經(jīng)歷了更多的細(xì)胞分裂，這有可能是父源性突變率更高的原因之一。除突變來(lái)源外，突變率的大小還可能與遺傳標(biāo)記重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)特征、種群、樣本量大小等因素有關(guān)［11-12］。本次研究的北方漢族人群中，31個(gè)X-STR 基因座平均突變率為0.002 3，與常染色體STR 和Y-STR 的平均突變率相近［13-16］。在北方漢族群體，DXS7132、HPRTB、DXS10159、DXS981、DXS10162 和DXS10135 基因座的突變率明顯高于平均突變率。對(duì)31個(gè)X-STR 突變情況的研究，提示我們?cè)跈z測(cè)X-STR 時(shí)，特別是DXS7132、HPRTB、DXS10159、DXS981、DXS10162 和DXS10135 這幾個(gè)突變率較高的基因座，需要保持謹(jǐn)慎，不要因?yàn)閭€(gè)別基因座不符合遺傳規(guī)律而排除具有某種親緣關(guān)系，尤其是矛盾等位基因來(lái)自于父源。

在31 個(gè)X-STR 基因座中，共28 個(gè)基因座表現(xiàn)出了高度的多態(tài)性［17］，即PIC＞0.5，多態(tài)性較差的基因座有DXS7423、DXS7133、DXS6800。31 個(gè)XSTR 的女性群體累積個(gè)人識(shí)別概率為1-1.578 4×10-31，男性群體累積個(gè)人識(shí)別概率為1-4.566 4×10-19，可以作為常染色體STR 的有力補(bǔ)充來(lái)滿足個(gè)人識(shí)別的需求。31 個(gè)X-STR 三聯(lián)體累積的平均父權(quán)排除概率為1-2.281 9×10-17，二聯(lián)體累積的平均父權(quán)排除概率為1-2.509 0×10-12，可以有效地輔助常染色體STR進(jìn)行復(fù)雜親緣關(guān)系的鑒定。

本次研究的北方漢族女性群體31個(gè)X-STR 基因座的基因型結(jié)果經(jīng)連鎖不平衡檢驗(yàn)，在Bonferroni 校正（P＜0.05∕465=0.000 107 526 9）后，仍有1 對(duì)基因座（DXS10103-DXS10101）具有顯著性差異，存在連鎖不平衡現(xiàn)象。因此，在案件涉及北方漢族的，統(tǒng)計(jì)分析中DXS10103-DXS10101按照單倍型頻率來(lái)計(jì)算。同時(shí)，本次連鎖不平衡檢驗(yàn)也反映出，雖然在X 染色體上報(bào)道了4 個(gè)連鎖群，但是實(shí)際檢驗(yàn)出來(lái)的X-STR連鎖不平衡并沒(méi)有理論上的多，即使是位于同一個(gè)連鎖群內(nèi)，也有可能不存在連鎖不平衡的情況，這在其他研究中也有類似的報(bào)道［18］。

不同群體之間的顯著性差異研究可以發(fā)現(xiàn)，北方漢族群體與德國(guó)群體存在明顯差異，與日本群體、四川藏族群體、廣東漢族群體均存在一定程度上的差異。人種差異越大、地域分布越廣泛，群體之間的差異也越大。這可能源于更為相近的地理距離或更為接近的種群在遺傳上更具有同源性。因此在實(shí)踐中應(yīng)用X-STR時(shí)選擇相對(duì)應(yīng)的群體是至關(guān)重要的。