揚(yáng)子鱷源普通變形桿菌FliL基因缺失株的構(gòu)建及其特性分析

李林俐,朱來旭,張雪,費(fèi)榮梅*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095;2.深圳海關(guān),廣東 深圳518026)

揚(yáng)子鱷(Alligatorsinensis)為我國一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物,被《世界自然保護(hù)聯(lián)盟》(IUCN)的紅色名錄列為極度瀕危物種。自1987年我國開始揚(yáng)子鱷的人工飼養(yǎng)繁育,現(xiàn)已經(jīng)取得巨大成功。近年來,由于種群密度增大、遺傳進(jìn)化等原因,揚(yáng)子鱷疾病時(shí)有發(fā)生。對(duì)越冬期間人工養(yǎng)殖條件下的發(fā)病揚(yáng)子鱷取樣檢測(cè),均發(fā)現(xiàn)有尿酸鹽沉積、腎病等癥狀,從發(fā)病的揚(yáng)子鱷體內(nèi)分離到多株普通變形桿菌,且該變形桿菌與人工養(yǎng)殖揚(yáng)子鱷的發(fā)病不無關(guān)聯(lián)[1]。

變形桿菌(Proteus)為革蘭陰性條件致病菌,屬于腸桿菌科變形桿菌屬,廣泛存在于動(dòng)物腸道、土壤和養(yǎng)殖水體等環(huán)境中[2]。近年來,關(guān)于該菌屬細(xì)菌引起的人食物中毒及動(dòng)物細(xì)菌性疾病的案例多有報(bào)道,如對(duì)蝦、中華鱉、石斑魚等[3-8]。變形桿菌的FliL、ZapA、HpmA、HpmB、RpoA等毒力因子均可在不同毒性揚(yáng)子鱷源普通變形桿菌菌株中檢測(cè)到,但并未發(fā)現(xiàn)這些毒力因子與菌株毒力強(qiáng)弱的線性關(guān)系[9]。變形桿菌可分化為2種細(xì)胞形態(tài):在液體環(huán)境中的短桿狀的泳動(dòng)細(xì)胞(swimmer cell)長(zhǎng)度1.5～2.0 μm,每個(gè)細(xì)菌有4～10根鞭毛[10];在黏性環(huán)境中的群集細(xì)胞(swarmer cell)中,長(zhǎng)度10～80 μm,其胞質(zhì)內(nèi)有多個(gè)均勻間隔的類核,每個(gè)小區(qū)由數(shù)百或數(shù)千鞭毛推動(dòng)[11-13],這些細(xì)胞沿該細(xì)胞體長(zhǎng)軸緊密排列形成1個(gè)群體,可在鞭毛的推動(dòng)下,快速遷移運(yùn)動(dòng)[14]。群集細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有多個(gè)均勻間隔的小區(qū),每個(gè)小區(qū)由數(shù)百或數(shù)千鞭毛推動(dòng),群集細(xì)胞可獨(dú)特地適應(yīng)宿主細(xì)胞表面環(huán)境,是調(diào)節(jié)幾種重要致病因子的關(guān)鍵。在奇異變形桿菌中有超過50種基因參與群集細(xì)胞的分化[15]。細(xì)菌的周期性群集運(yùn)動(dòng)(swarming motility,SM)是指運(yùn)動(dòng)細(xì)菌以群體方式在培養(yǎng)基表面由接種點(diǎn)向周圍進(jìn)行的依賴鞭毛的遷移運(yùn)動(dòng)。對(duì)變形桿菌的進(jìn)一步研究表明,其分化能力和SM均與其致病性緊密相關(guān)[16]。FliL基因是鞭毛操縱子中的第一個(gè)基因,其編碼蛋白是一種單跨膜蛋白,由160個(gè)氨基酸組成的小蛋白質(zhì)(相對(duì)分子質(zhì)量:18 000),位于Mot蛋白附近,可與位于細(xì)胞質(zhì)膜上方的MS(membrane/supramembrane)環(huán)相互作用,可在高負(fù)荷條件下(如高黏性環(huán)境中)對(duì)加強(qiáng)鞭毛馬達(dá)功能起重要作用[17-18]。

鑒于細(xì)菌鞭毛與細(xì)菌的致病性和趨利避害的化學(xué)趨向性運(yùn)動(dòng)緊密相關(guān),為探究FliL基因?qū)P(yáng)子鱷源普通變形桿菌生物學(xué)特性的影響,本試驗(yàn)通過Red重組系統(tǒng)對(duì)揚(yáng)子鱷源普通變形桿菌進(jìn)行FliL基因敲除,構(gòu)建FliL基因缺失株和互補(bǔ)株,通過比較野生株與FliL基因缺失株在細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性和對(duì)小鼠致病性上的差異,來探究FliL基因在揚(yáng)子鱷源普通變形桿菌中的作用,為研究人工養(yǎng)殖揚(yáng)子鱷痛風(fēng)癥的致病機(jī)制提供理論支持,也為人工養(yǎng)殖揚(yáng)子鱷的疾病防控提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、引物和質(zhì)粒

揚(yáng)子鱷源普通變形桿菌XX2株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離、純化和保存,于2012—2013年分離于安徽省宣城揚(yáng)子鱷繁殖研究中心發(fā)病揚(yáng)子鱷。根據(jù)GenBank已公布的變形桿菌HI4320(NC_010554.1)的FliL基因序列,使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(表1)。質(zhì)粒pKD4、pKD46、pCP20、pGEN-MCS均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

表1 本試驗(yàn)所用的引物序列Table 1 Primers sequences in this study

1.2 主要試劑

1.3 FliL同源重組片段(打靶片段)的擴(kuò)增

以pKD4質(zhì)粒(2邊帶有FRT位點(diǎn)和Kanr基因)為模板,利用引物對(duì)C-FliL-F/R擴(kuò)增打靶片段,目的片段為1 647 bp。50 μL PCR反應(yīng)體系:2×FastTaqPCR Master Mix 25 μL,上、下游引物(10 mol·L-1)各 1 μL,菌液模板2 μL,ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,共29個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物于10 g·L-1瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。

1.4 重組菌XX2/pKD46的制備

將XX2菌液按照1∶100(體積比)轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,冰浴20 min,5 000 r·min-1離心10 min,收集菌體,先用ddH2O充分洗滌2次,再用10%滅菌甘油洗滌2次,最后用10%滅菌甘油以1∶100重懸細(xì)胞,制成XX2感受態(tài)細(xì)胞。

將pKD46質(zhì)粒(帶有Ampr基因)電擊轉(zhuǎn)化XX2感受態(tài)細(xì)胞。電擊參數(shù):電壓2.25 kV,電阻200 Ω,電容 25 μF。電擊后加入30 ℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基,30 ℃、100 r?min-1振蕩培養(yǎng)約1 h后,取100 μL涂布于含50 μg·mL-1Amp的抗性LB平板,30 ℃培養(yǎng)2～3 h后篩選陽性克隆。

1.5 XX2/pKD46感受態(tài)細(xì)胞的制備及電轉(zhuǎn)化

將篩選好的XX2/pKD46重組菌按照1∶100轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,按照1∶100加入L-阿拉伯糖誘導(dǎo)1 h,再按照1.4節(jié)方法制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,利用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入打靶片段,進(jìn)行重組替換,依次用含有Kan和Amp的平板篩選出對(duì)Amp敏感且有Kan抗性的重組菌XX2ΔFliL∶∶Kan。用FliL基因鑒定引物對(duì)R-FliL-F/R對(duì)FliL基因進(jìn)行PCR驗(yàn)證。50 μL PCR反應(yīng)體系:2×FastTaqPCR Master Mix 25 μL,上、下游引物(10 mol·L-1)各1 μL,菌液模板2 μL,ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,共29個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物于10 g·L-1瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。

用卡那抗性基因同源臂鑒定引物對(duì)E-FliL-F/R對(duì)重組菌株進(jìn)行PCR鑒定。50 μL PCR反應(yīng)體系:2×FastTaqPCR Master Mix 25 μL,上、下游引物(10 mol·L-1)各1 μL,菌液模板2 μL,ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,共29個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物于10 g·L-1瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。

1.6 XX2ΔFliL∶∶Kan菌株Kan抗性的消除

將pCP20質(zhì)粒(溫敏性質(zhì)粒)電擊轉(zhuǎn)化XX2ΔFliL∶∶Kan菌株以消除其Kanr基因,37 ℃培養(yǎng)過夜。先將菌液接種普通LB平板,再挑單菌落接種含有Kan的LB平板,挑選出不能在含Kan的LB平板上生長(zhǎng)的單菌落。最后于42 ℃培養(yǎng)消除pCP20質(zhì)粒,獲得普通變形桿菌XX2FliL基因缺失株XX2ΔFliL。

1.7 缺失互補(bǔ)株的構(gòu)建

以XX2菌株的基因組DNA為模板,用引物對(duì)MCS-F/R擴(kuò)增FliL基因。50 μL PCR反應(yīng)體系:2×FastTaqPCR Master Mix 25 μL,上、下游引物(10 mol·L-1)各1 μL,菌液模板2 μL,ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,共29個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物于10 g·L-1瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。

將該片段克隆至轉(zhuǎn)移載體pGEN-MCS(轉(zhuǎn)移質(zhì)粒),獲得互補(bǔ)質(zhì)粒pGEN-MCS-FliL。質(zhì)粒經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證后,再按照1.4節(jié)方法制備電轉(zhuǎn)化XX2ΔFliL感受態(tài)細(xì)胞,將互補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XX2ΔFliL感受態(tài)細(xì)胞,用含有Amp的LB平板進(jìn)行篩選,PCR驗(yàn)證后獲得互補(bǔ)株XX2ΔFliL/pFliL。

你們看不起我。我說著，從褲兜里掏出一把小刀，刺啦一下劃破自己的手臂，血像一條紅色的蚯蚓，翻滾著掉在地上。我今天以血為誓，咱走著瞧，非混出個(gè)樣子來給你們看看，這瞎巴大學(xué)，我不讀，照樣出人頭地。我罵完這一句，咣當(dāng)一聲甩開門，出了宿舍。

1.8 生長(zhǎng)曲線的繪制

將培養(yǎng)過夜的XX2株、XX2ΔFliL株和XX2ΔFliL/pFliL株分別以1∶100的體積比接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng),每隔30 min取樣1次,共取樣24次,測(cè)定不同時(shí)期菌液D600值,使用軟件Graphpad Prism 8.0繪制生長(zhǎng)曲線。

1.9 細(xì)菌群集運(yùn)動(dòng)和細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)

挑取XX2株和XX2ΔFliL株單菌落于1 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)過夜。在Mot半固體瓊脂(3 g·L-1瓊脂)培養(yǎng)基和LB固體瓊脂培養(yǎng)基中心點(diǎn)接種過夜培養(yǎng)物。通過分時(shí)段測(cè)量細(xì)菌在LB固體瓊脂培養(yǎng)基表面的遷移距離和遷移速度來測(cè)定細(xì)菌的群集運(yùn)動(dòng)。通過分時(shí)段測(cè)量細(xì)菌在Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基表面的遷移距離和遷移速度來判斷細(xì)菌動(dòng)力,再將過夜培養(yǎng)的菌液以1∶100稀釋后接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)2.75 h(此時(shí)菌株可產(chǎn)生最多的假性群集細(xì)胞[15]),將培養(yǎng)物涂布于LB固體瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)4.5 h。顯微鏡觀察前用2 mL PBS沖洗LB瓊脂表面。

1.10 菌株致病性的測(cè)定

分別將XX2株和XX2ΔFliL株的LB培養(yǎng)物以1∶100接種THB液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)8 h。用生理鹽水稀釋菌液并配制成1×104、1×105、1×106、1×107和1×108CFU·mL-1的菌液。取清潔級(jí)雄性小鼠40只,隨機(jī)分為2大組,每大組又隨機(jī)分為5小組,每小組4只小鼠。每組分別腹腔注射不同濃度稀釋菌液0.2 mL。飼養(yǎng)、觀察并記錄小鼠的死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 FliL基因缺失株的PCR鑒定

以pKD4為模板擴(kuò)增FliL基因上、下游同源臂及Kan抗性基因所得的同源重組片段,PCR產(chǎn)物大小與目標(biāo)片段1 647 bp大小相符(圖1-A)。將同源重組片段電轉(zhuǎn)化至XX2感受態(tài)細(xì)胞后,FliL基因與同源片段進(jìn)行重組,再利用重組菌株帶有Kan抗性的特點(diǎn)對(duì)獲得菌株進(jìn)行初步篩選,得到疑似FliL基因缺失的菌株。因?yàn)镕liL編碼基因全序列短于同源臂DNA片段長(zhǎng)度,用引物對(duì)C-FliL-F/R進(jìn)一步進(jìn)行PCR鑒定,篩選出FliL基因缺失株(如圖1-B所示),缺失陰性株能夠檢測(cè)到目標(biāo)FliL基因770 bp大小的條帶。再用E-FliL-F/R與R-FliL-F/R引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果如圖1-C所示。

圖1 FliL基因缺失株的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of FliL gene fragment deletion strain A. 引物對(duì)C-FliL-F/R擴(kuò)增同源重組片段(M. DNA標(biāo)準(zhǔn)品;1、2. 同源重組片段);B. 引物對(duì)R-FliL-F/R對(duì)重組菌株的鑒定(M. DNA標(biāo)準(zhǔn)品;1. FliL基因缺失株;2. 缺失對(duì)照);C. 引物對(duì)E-FliL-F/R對(duì)重組菌株的鑒定(M. DNA標(biāo)準(zhǔn)品;1～10. Kan抗性陽性株;11. Kan抗性陰性株;12. 空白對(duì)照)。A. The peimer pairs C-FliL-F/R amplified homologous recombination fragment(M. DNA Marker;1,2. Homologous recombination fragment).B. The peimer pairs C-FliL-F/R identified the recombinant strains(M. DNA Marker;1. XX2ΔFliL strain;2. Deletion control). C. The peimer pairs E-FliL-F/R identified the recombinant strains(M. DNA Marker;1-10. Kanr positive strain;11. Kanr negative strain;12. Blank control).

2.2 XX2ΔFliL/pFliL互補(bǔ)株的鑒定

互補(bǔ)質(zhì)粒pGEN-MCS-FliL電轉(zhuǎn)化至XX2ΔFliL感受態(tài)后,經(jīng)含有Amp的LB平板篩選挑取疑似菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證,PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果(圖2)顯示,有與預(yù)期大小相符的2 784 bp特異性條帶,表明互補(bǔ)質(zhì)粒pGEN-MCS-FliL成功轉(zhuǎn)入XX2ΔFliL菌株,獲得互補(bǔ)株XX2ΔFliL/pFliL。

圖2 互補(bǔ)株XX2ΔFliL/pFliL的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of complementary strains of XX2ΔFliL/pFliL M. DL5000 DNA標(biāo)準(zhǔn)品;1:互補(bǔ)株陰性;2. 互補(bǔ)株陽性。M. DL5000 DNA marker;1. Complementary strain of negative;2. Complementary strain of postivite.

2.3 生長(zhǎng)速度測(cè)定

如圖3所示:XX2株、XX2ΔFliL株和XX2ΔFliL/pFliL株的生長(zhǎng)速度在接種后的前5 h沒有明顯區(qū)別(X2=4.134×10-3,P>0.05),5 h后野生株XX2的生長(zhǎng)速度均快于FliL基因缺失株XX2ΔFliL和互補(bǔ)株XX2ΔFliL/pFliL,而互補(bǔ)株XX2ΔFliL/pFliL的生長(zhǎng)速度快于FliL基因缺失株XX2ΔFliL。

圖3 XX2株、XX2ΔFliL株和XX2ΔFliL/pFliL株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curve of XX2、XX2ΔFliL and XX2ΔFliL/pFliL strains

圖4 細(xì)菌在LB固體瓊脂培養(yǎng)基(A)和Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基(B)上的運(yùn)動(dòng)情況Fig.4 The movement of bacteria on LB solid agar medium(A)and Mot semi-solid agar medium(B)

2.4 細(xì)菌群集運(yùn)動(dòng)和細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)

XX2株和XX2ΔFliL株過夜培養(yǎng)物接種Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基和LB固體瓊脂培養(yǎng)基,觀察細(xì)菌群集細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng),如圖4所示。分時(shí)段測(cè)量并記錄XX2株和XX2ΔFliL株在LB固體瓊脂培養(yǎng)基和Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基上遷移距離與遷移速度。如圖5所示,在LB固體瓊脂培養(yǎng)基表面XX2ΔFliL株的遷移距離遠(yuǎn)低于XX2株,遷移速度低于XX2株。在Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基上XX2ΔFliL株的遷移距離略低于XX2株,其遷移速度也沒有顯著差異(X2=3.649,P>0.05)。

將稀釋后的過夜培養(yǎng)物接種新鮮LB液體培養(yǎng)基,取37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)2.75 h后的假性群集細(xì)胞培養(yǎng)物涂布LB固體瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)4.5 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察。如圖6所示:視野可見野生株在培養(yǎng)基表面細(xì)胞體長(zhǎng)軸上緊密排列形成一個(gè)群體,而FliL基因缺失株則為單細(xì)胞狀態(tài)。

圖5 細(xì)菌在LB固體培養(yǎng)基(A、C)和Mot半固體培養(yǎng)基(B、D)上的遷移情況Fig.5 The migration of bacteria on LB solid medium(A,C)and Mot semi-solid medium(B,D)

2.5 XX2株和XX2ΔFliL株小鼠致病性試驗(yàn)

小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,XX2株對(duì)小鼠的LD50為2.3×106CFU·mL-1,致病力強(qiáng)XX2ΔFliL株對(duì)小鼠的LD50為4.9×108CFU·mL-1,FliL基因缺失株LD50升高了約100倍,致病力弱。表明FliL基因的缺失會(huì)導(dǎo)致?lián)P子鱷源普通變形桿菌毒力的下降。

圖6 細(xì)菌在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4.5 h后的形態(tài)Fig.6 The morphology of bacteria after culturing in LB medium for 4.5 h

表2 XX2株和XX2ΔFliL株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50)

3 討論

變形桿菌為革蘭陰性菌,具鞭毛、無莢膜、無芽胞,在固體培養(yǎng)基上呈擴(kuò)散生長(zhǎng),可形成遷移生長(zhǎng)現(xiàn)象[19]。鞭毛作為細(xì)菌運(yùn)動(dòng)最常見的細(xì)胞器之一,是由細(xì)胞表面突出的絲狀螺旋槳結(jié)構(gòu)和嵌入細(xì)胞膜的旋轉(zhuǎn)馬達(dá)組成。FliL基因是變形桿菌中的1個(gè)重要毒力因子,同時(shí)也是鞭毛操縱子中的第1個(gè)基因,其編碼的單跨膜蛋白可與位于細(xì)胞質(zhì)膜上的MS環(huán)相互作用,在高負(fù)荷條件下(如高黏性環(huán)境中)起到加強(qiáng)鞭毛馬達(dá)功能的作用[17-18]。

本試驗(yàn)利用Red重組系統(tǒng)對(duì)揚(yáng)子鱷源普通變形桿菌的FliL基因進(jìn)行敲除,成功構(gòu)建FliL基因缺失株和互補(bǔ)株。細(xì)菌生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示:接種5 h后FliL基因缺失株生長(zhǎng)速度慢于野生株,說明FliL基因的缺失確實(shí)會(huì)影響揚(yáng)子鱷源普通變形桿菌的增殖,但其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。有研究表明,FliL基因缺陷會(huì)導(dǎo)致特異性表型的變化,如在螺旋體中,曾觀察到FliL基因突變體在運(yùn)動(dòng)性上具有缺陷,并伴隨周質(zhì)鞭毛方向的逆轉(zhuǎn)[20]。在α-桿菌屬物種中,FliL基因無效突變可導(dǎo)致非運(yùn)動(dòng)表型[21]或鞭毛的釋放[22]。在腸道細(xì)菌如大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌和奇異變形桿菌中,FliL基因的缺失并不影響其泳動(dòng)運(yùn)動(dòng),但在群集運(yùn)動(dòng)中具有明顯的缺陷[23],在本試驗(yàn)中該現(xiàn)象同樣得到證實(shí)。本試驗(yàn)細(xì)菌群集運(yùn)動(dòng)和動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果顯示:在LB固體瓊脂培養(yǎng)基表面FliL基因缺失株的遷移距離遠(yuǎn)低于野生株,其遷移速度也低于野生株,說明FliL基因缺失株的群集運(yùn)動(dòng)明顯下降,表明FliL基因?qū)ζ胀ㄗ冃螚U菌的群集運(yùn)動(dòng)是必不可少的。而在Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基上FliL基因缺失株的遷移距離雖略低于野生株,但是遷移速度并沒有明顯不同,表明FliL基因僅在一定程度上影響了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力。

群集細(xì)胞可獨(dú)特地適應(yīng)生命體組織器官的表面環(huán)境[24-26],其感知和響應(yīng)宿主細(xì)胞表面環(huán)境的能力是調(diào)節(jié)幾種重要致病因子的關(guān)鍵[27-28]。群集細(xì)胞的分化除了可使細(xì)菌進(jìn)行鞭毛依賴的群集運(yùn)動(dòng)外,還可產(chǎn)生其他毒力因子如尿素酶、溶血酶和蛋白酶等,可協(xié)助細(xì)菌在膀胱和腎臟器官的定殖與感染[29]。除了作為運(yùn)動(dòng)器官外,鞭毛也與細(xì)菌致病力緊密相關(guān),鞭毛及其運(yùn)動(dòng)性可促進(jìn)細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附與侵襲,參與大分子蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn),在細(xì)菌生物被膜形成過程中起重要作用,并且鞭毛與細(xì)菌毒力因子的分泌也密切相關(guān)。本試驗(yàn)FliL基因缺失株LD50升高了約100倍,為低致病力菌株,表明FliL基因與細(xì)菌毒力緊密相關(guān),FliL基因缺失可降低揚(yáng)子鱷源普通變形桿菌的毒力。

綜上所述,本試驗(yàn)結(jié)果明確了FliL基因?qū)ζ胀ㄗ冃螚U菌群集運(yùn)動(dòng)是必不可少,并在一定程度上影響了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力,FliL基因缺失株與野生株的LD50相差約100倍,表明FliL基因的缺失會(huì)影響普通變形桿菌的毒力,為進(jìn)一步研究揚(yáng)子鱷源變形桿菌對(duì)揚(yáng)子鱷痛風(fēng)等疾病奠定基礎(chǔ)。