不同花型及花徑切花菊花香揮發(fā)物多樣性分析

張萬博,馬曉瑩,陳素梅,陳發(fā)棣,姜一凡

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀農(nóng)業(yè)重點實驗室/國家林業(yè)和草原局華東地區(qū)花卉生物學(xué)重點實驗室,江蘇 南京 210095)

菊花(Chrysanthemummorifolium)作為中國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一,集觀賞、茶用、藥用及食用功能于一體,產(chǎn)量居四大切花之首[1-2]。經(jīng)過不斷雜交選育,全世界已培育出2萬多個菊花品種,中國品種總數(shù)已超4 000個[3]。根據(jù)菊花的生長習(xí)性和栽培類型,主要可分為傳統(tǒng)菊、切花菊、盆栽型和地被菊[4]。其中,切花菊因具有花型多樣、色彩豐富、用途廣泛、瓶插壽命長、可周年供應(yīng)、成本低及高產(chǎn)出等優(yōu)點,近年來深受消費市場青睞[5]。此外,菊花頭狀花序中所含的精油揮發(fā)性成分也可貢獻出包括花香、果香、草香、木香及薄荷香型等在內(nèi)的多種香氣屬性[6]。在切花菊產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的大背景下,除選育品質(zhì)優(yōu)良、花色艷麗的新品種外,具備芳香特性也可作為切花菊育種新的重要目標之一。因此,探明已有不同品種的切花菊花香揮發(fā)物成分及其釋放規(guī)律對研究切花菊香氣的形成機制及芳香型品種的培育十分重要。

花香是由一系列常溫下高蒸汽壓、低沸點、低分子量的揮發(fā)性有機化合物組成。按照生物合成途徑,可將花香揮發(fā)物分為萜類化合物、苯丙氨酸/苯環(huán)類化合物、脂肪酸衍生物等[7]。近些年隨著對揮發(fā)物收集與分析方法的不斷更新完善和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,開花植物如蘭花(Cymbidiumssp.)、玫瑰(Rosarugosa)、百合(Liliumsiberia)、茉莉(Jasminumsambac)和梔子(Gardeniajasminoides)等花香成分鑒定、釋放規(guī)律及調(diào)控機制的研究被相繼報道[8]。而關(guān)于菊屬植物花香研究主要圍繞不同地域野菊(C.indicum)、茶用型菊花、地被菊及切花菊‘神馬’花香揮發(fā)物分析、精油分離提取及其生物活性功能驗證等展開[9-10],尚缺乏對于切花菊品種花香揮發(fā)物成分鑒定及釋放差異的研究。

植物釋放花香通常會受到花朵性狀,如不同的花型花徑、花香合成部位、花發(fā)育時期及授粉狀態(tài)、內(nèi)源生物鐘等[11]或外界環(huán)境等多重的影響。通過長期的人工雜交選育,菊花頭狀花序出現(xiàn)不同的生長性狀可能會直接或間接地影響其自身某些次生代謝產(chǎn)物的積累,特別是對于種類繁多且不同花型結(jié)構(gòu)及花徑大小的切花菊品種,其花香揮發(fā)物釋放可能會存在差異[12]。因此,本研究選取不同類型切花菊品種,利用動態(tài)頂空收集法收集盛花期新鮮切花菊頭狀花序的花香揮發(fā)物,并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析各揮發(fā)性組分的釋放量差異,以期為改良菊花氣味特征及拓展相關(guān)應(yīng)用產(chǎn)業(yè)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所選44個切花菊品種均收集于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中國菊花種質(zhì)資源保存中心溫室內(nèi),在自然光照下由同一母株扦插無性繁殖,生長溫度23～28 ℃,濕度80%。所有樣品舌狀花全部開放,部分品種露出管狀花且花粉自然散出(表1,圖1)。按照Su等[4]的方法分類,將44個切花菊品種分為蜂窩型、輻射型、松針型、風車型、迷你型、蓮座型、托桂型和單瓣型8種花型。采樣時期于2019年及2020年11月完成。

表1 本研究所選44個切花菊品種Table 1 The selected 44 cut chrysanthemum varieties in this study

圖1 本研究所選44個切花菊品種Fig.1 The selected 44 cut chrysanthemum varieties in this study

1.2 花香揮發(fā)物的收集

采用動態(tài)頂空收集法收集切花菊花香揮發(fā)物。試驗均選在晴朗天氣進行,隨機采摘切花菊頭狀花序(帶5 cm左右花莖)插入裝有30 mL去離子水的錐形瓶中,立即帶回實驗室。收集切花菊花香揮發(fā)物于玻璃容器(高為30 cm,瓶口直徑為10 cm)中,供給瓶內(nèi)0.7 L·min-1活性炭純化空氣,平衡20 min后連接裝填有Porpark Q(美國沃特世科技有限公司)吸附硅膠的吸附柱,用200 μL含0.001%(體積分數(shù))乙酸壬酯(色譜純,西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司)內(nèi)標的二氯甲烷(色譜純,上海麥克林生化科技有限公司)洗脫后待進樣測定。設(shè)立空白頂空收集瓶作為對照組,所有樣品收集時間統(tǒng)一為10:00—13:00。稱取切花菊樣品鮮重,使用游標卡尺(MNT-150T,上海美耐特實業(yè)有限公司)測量10朵處于盛花期頭狀花序的最大橫徑,并將切花菊品種花徑大小分為3類(≤40 mm、40～60 mm、≥60 mm)。試驗重復(fù)3次,且每組收集花香的頭狀花序數(shù)量保持一致。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析

使用安捷倫三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent Intuvo 9000/7000D,美國安捷倫科技有限公司)分析鑒定花香揮發(fā)物成分。以流速為1 mL·min-1氦氣于HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)上分離。設(shè)置花香不分流模式,進樣口溫度為260 ℃,梯度升溫程序在40 ℃時開始,然后以5 ℃·min-1速率升至250 ℃,并保持20 min。MS條件:離子源溫度為230 ℃,電離能為70 eV,質(zhì)譜掃描范圍為40～500 amu。

根據(jù)揮發(fā)物保留時間計算保留指數(shù),并與數(shù)據(jù)庫NIST17(National Institute of Standards and Technology 17)中檢索化合物參考值比對定性。保留指數(shù)使用C7—C40碳氫化合物標準品(色譜純,美國Sigma-Aldrich公司)計算得出?；ㄏ汜尫潘俾视嬎愎?釋放速率(ng·g-1·h-1)=(樣品揮發(fā)物峰面積/內(nèi)標揮發(fā)物峰面積)×內(nèi)標物含量/(頂空收集時間×每組樣品鮮重)。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2016軟件計算各種花香揮發(fā)物釋放速率,采用GraphPad Prism 8.0軟件對不同品種揮發(fā)物釋放量進行比較分析和相關(guān)性分析;使用TB tools(0.66版本)軟件繪制不同切花菊揮發(fā)物成分熱圖;使用SPSS 19.0軟件對44個切花菊品種主要花香揮發(fā)物進行主成分分析(PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 切花菊花香揮發(fā)物成分分析

采用動態(tài)頂空收集法和GC-MS分析菊花自然狀態(tài)下花香揮發(fā)物的釋放情況。結(jié)果表明:在保留各品種揮發(fā)物成分占總量1%以上的基礎(chǔ)上共鑒定出55種揮發(fā)性化合物,包含42種單萜及其含氧衍生物,9種倍半萜類化合物,以及2種苯環(huán)類化合物和2種脂肪酸類化合物。不同切花菊品種花香釋放速率存在較大差異,其中Cm37(‘南農(nóng)紫峰’)花香揮發(fā)物釋放速率最高,達1 392.84 ng·g-1·h-1(圖2-A)。萜類化合物是大部分切花菊花香的主要成分,特別是單萜類化合物,其總釋放速率占總量的55.16%～100%。但Cm29(‘南農(nóng)紫點點’)和Cm19(‘南農(nóng)粉風車’)所含苯環(huán)類化合物較高,分別占該切花菊品種總釋放速率的85.26%、72.19%(圖2-B)。

圖2 44個切花菊品種花香揮發(fā)物總釋放速率(A)及各種類成分比例(B)Fig.2 Total emission rate(A)and composition percentage(B)of floral volatiles in 44 cut chrysanthemum varieties

2.2 不同花型切花菊花香揮發(fā)物釋放差異

對8種花型切花菊不同類別揮發(fā)物成分的總釋放速率分布進行比較(圖3),結(jié)果顯示不同花型切花菊的花香釋放速率存在較大差異。雖然迷你型切花菊總揮發(fā)物平均釋放速率高于其他花型(圖3-A),但蓮座型萜類化合物,特別是單萜類化合物的總釋放速率(159.93～1 392.84 ng·g-1·h-1)更高(圖3-B)。蓮座型單萜總釋放速率與迷你型倍半萜總釋放速率均高于其他花型(圖3-C、D)。另外,迷你型切花菊苯環(huán)類化合物的釋放速率更高(圖3-E)。脂肪酸衍生物的比較結(jié)果顯示,托桂型切花菊總釋放速率更高(圖3-F)。

圖3 不同花型切花菊花香揮發(fā)物總釋放速率Fig.3 Total emission rate of floral volatiles from different cut chrysanthemum types A. 花香揮發(fā)物Floral volatiles;B. 萜類化合物Terpenoids;C. 單萜類化合物Monoterpenoids;D. 倍半萜類化合物Sesquiterpenoids;E. 苯環(huán)類/苯丙氨酸類化合物Benzenoids/phenylpropanoids;F. 脂肪酸類化合物Fatty acid derivatives.

2.3 不同花徑切花菊花香揮發(fā)物釋放差異

如圖4所示:隨著切花菊花徑增加,花香平均總釋放速率呈現(xiàn)下降趨勢?；◤健?0 mm的切花菊所含單萜類化合物、倍半萜類化合物及苯環(huán)類化合物平均釋放速率均較高。另外,大部分花徑≤40 mm的切花菊釋放出較高平均水平的脂肪酸類化合物。

圖4 不同花徑切花菊花香揮發(fā)物總釋放速率Fig.4 Total emission rate of floral volatiles from different cut chrysanthemum diameters A. 花香揮發(fā)物Floral volatiles;B. 萜類化合物Terpenoids;C. 單萜類化合物Monoterpenoids;D. 倍半萜類化合物Sesquiterpenoids;E. 苯環(huán)類/苯丙氨酸類化合物Benzenoids/phenylpropanoids;F. 脂肪酸類化合物Fatty acid derivatives.

2.4 花香揮發(fā)物成分聚類熱圖分析

如圖5所示:基于花香揮發(fā)物成分的釋放速率可將不同切花菊品種分為4個類群,同一類群中不同花型切花菊分布較為分散。但在類群Ⅲ中,迷你型品種Cm32(‘南農(nóng)岱雪’)、Cm33(‘南農(nóng)峨眉’)、Cm34(‘南農(nóng)粉云’)、Cm37(‘南農(nóng)紫峰’)和托桂型品種Cm41(‘南農(nóng)小金星’)出現(xiàn)聚集情況,說明其具有較為相似的花香釋放模式。從花香揮發(fā)物成分的分類情況上看,檜烯(sabinene)、桉樹醇(eucalyptol)、樟腦(camphor)釋放速率較高且在大部分切花菊品種中均有出現(xiàn),特別是在Cm32(‘南農(nóng)岱雪’)、Cm33(‘南農(nóng)峨眉’)和Cm37(‘南農(nóng)紫峰’)中釋放速率極高值。順式-乙酸菊烯酯(cis-chrysanthenol acetate)、萜品油烯(terpinolene)、Filifolone、反式-菊烯醇(trans-chrysanthenol)、(2E,3Z)-2-亞乙基-6-甲基-3,5-二烯醛[(2E,3Z)-2-ethylidene-6-methyl-3,5-heptadienal]是類群Ⅰ和類群Ⅱ中切花菊品種的重要花香揮發(fā)物組分。苯環(huán)類化合物,如苯甲醛(benzaldehyde)和苯乙醛(benzeneacetaldehyde)則多次出現(xiàn)于類群Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的切花菊品種中,且在所有迷你型切花菊品種中均被檢測到。

圖5 所選切花菊花香成分釋放速率聚類熱圖分析Fig.5 Clustering heatmap analysis of volatile components in chrysanthemum materials不同顏色字代表8種花型。Different color fonts represent eight flower types.

2.5 花香揮發(fā)物成分主成分分析(PCA)

基于花香揮發(fā)物成分在不同切花菊品種的出現(xiàn)次數(shù),試驗選定重復(fù)出現(xiàn)30次以上的9種花香揮發(fā)物進行主成分分析。如圖6-A所示:前2個主成分因子合計貢獻率達63.9%,以此來作為坐標軸繪制主成分因子載荷圖;同樣,在對44個品種進行主成分分析時,以第1主成分(貢獻率50.96%)和第2主成分(貢獻率為27.19%)繪制二維散點圖(圖6-B)。結(jié)果顯示,以 9種主要的花香揮發(fā)物成分分析為例,可將其分為3組,而與之對應(yīng)的44種切花菊也被分為3個類群。其中樟腦可以將組Ⅰ的品種與其他品種分開來,桉樹醇和Filifolone可以區(qū)分組Ⅱ的品種和其他品種,而檜烯、萜品油烯、菊油環(huán)酮(chrysanthenone)、桃金娘醛(myrtenal)、順式-乙酸菊烯酯、乙酸冰片酯(bornyl acetate)可以區(qū)分組Ⅲ的品種和其他品種。不同花型或是花徑的切花菊品種花香釋放分布不一致,未在某一花型或花徑范圍內(nèi)出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。

圖6 切花菊揮發(fā)物主要成分主成分分析(PCA)Fig.6 Principal component analysis(PCA)of the main volatiles in 44 cut chrysanthemums A. 9種主要揮發(fā)物在PC1與PC2上的載荷圖(c1. 香檜烯;c2. 桉樹醇;c3. 萜品油烯;c4. Filifolone;c5. 菊油環(huán)酮;c6. 樟腦;c7. 桃金娘醛;c8. 順式-乙酸菊烯酯;c9. 乙酸冰片酯);B. 44個切花菊品種花香揮發(fā)物PCA得分分布圖(按圖5顏色標注)。A. Loading plot of Eigenvector load values of 9 main volatiles on PC1 and PC2(c1.Sabinene;c2. Eucalyptol;c3. Terpinolene;c4. Filifolone;c5. Chrysanthenone;c6. Camphor;c7. Myrtenal;c8. cis-chrysanthenol acetate;c9. Bornyl acetate);B. PCA score distribution of floral volatiles from 44 cut chrysanthemum varieties(The label color is the same as in Fig.5).

3 討論

作為菊花重要的觀賞器官,不同舌狀花及管狀花花數(shù)、花瓣大小及花器官組成了形態(tài)各異的花型及大小不一致的頭狀花序[4]。菊花具有豐富的核內(nèi)變異特性[12-13],使得不同花型切花菊可能產(chǎn)生包括揮發(fā)物在內(nèi)的更多種類次生代謝物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)不同花型切花菊花香的釋放速率存在較大差異,這與先前報道的不同菊花品種中花香揮發(fā)物釋放量不同相似[14-15]。在本文選定的44個切花菊品種中,大部分迷你型系列品種釋放速率較高,而花徑較大的松針型系列切花菊品種釋放速率相對較低,可能是由于迷你型頭狀花序上管狀花數(shù)量較多,而松針型切花菊主要以舌狀花為主。Sun等[14]對不同花型菊花揮發(fā)物分析后得出蜂窩型可以產(chǎn)生較多的花香揮發(fā)物,這與本研究結(jié)果的差異可能是因收集揮發(fā)物的菊花品種不同所致。另外,花徑在40 mm以下的切花菊釋放出更高水平的花香揮發(fā)物,這與花徑較小的野菊及地被菊頭狀花序中積累的花香揮發(fā)物含量較高的趨勢類似[9]。因此,培育管狀花明顯的切花小菊可作為芳香型菊花的育種目標之一。此外,主成分分析顯示9種主要花香揮發(fā)物質(zhì)可將44個切花菊品種分為3個類群,但每組中的菊花品種在花型或花徑分布上較為分散,表明其與花香釋放的相關(guān)性較弱。這可能是由于菊花雜交過程中復(fù)雜的遺傳背景、舌狀花或管狀花上花香釋放的組織細胞形成結(jié)構(gòu)或數(shù)量差異以及有無產(chǎn)生花粉等因素所致有關(guān)[10]。

萜類化合物是菊花花香的主要揮發(fā)物性組分之一[16]。本研究中自然狀態(tài)下切花菊釋放出較多種類的單萜及其氧化物,且釋放量占花香釋放量的比例較高,例如檜烯、萜品油烯、桉樹醇、菊油環(huán)酮、樟腦、反式菊烯醇、順式乙酸菊烯酯和乙酸冰片酯均出現(xiàn)在不同花型及花徑大小的切花菊品種中。同樣在野菊、茶用菊、觀賞菊品種中也檢測到了相同的花香揮發(fā)性成分[17-19]。從單萜化合物對花香香氣評價的影響上看,本試驗所選切花菊品種中幾乎不含有先前報道中的檸檬烯(limonene)、芳樟醇(linalool)、(E)-β-羅勒烯[(E)-β-ocimene]及香葉醇(geraniol)等具備花香香氣特征的揮發(fā)物成分[20],而是以莰烯型(camphene type)單萜氧化物及菊烯醇型(chrysanthenol type)為主的揮發(fā)物組成[21]。這2種類型的單萜化合物已被證實在菊花精油中多與木香和草香香型具有較強的相關(guān)性,這可能是導(dǎo)致降低切花菊嗅覺吸引力,使其并未呈現(xiàn)出芳香性植物特征的原因之一[6]。然而,本研究結(jié)果顯示Cm19(‘南農(nóng)粉風車’)、Cm25(‘南農(nóng)彩點點’)、Cm29(‘南農(nóng)紫點點’)和Cm31(‘南農(nóng)極點’)釋放出以苯甲醛及苯乙醛為主的苯環(huán)類花香組分,這可為培育芳香型切花菊品種提供可能。在風信子(Hyacinthusorientalis)、鳶尾(IristectorumMaxim.)及巖薔薇(Cistusladanifer)中,苯甲醛呈現(xiàn)出多種果香型香氣[22];而苯乙醛給人以強烈的風信子特征香氣[20],由此推測出迷你型“點點”系列切花菊可作為改良菊花氣味特征的候選親本品種。對于更多切花菊品種的花香感官屬性有待于進一步的系統(tǒng)評價。

近年來,分子育種逐漸成為改良菊花性狀的重要方法之一[23]。隨著植物源揮發(fā)性萜類物質(zhì)生物合成途徑研究的不斷深入,某些單萜及單萜氧化物已被證實在菊屬植物甚至是菊科植物中,如野菊、除蟲菊(Tanacetumcinerariifolium)和洋甘菊(Matricariarecutita),可通過一步或多步生化反應(yīng)催化形成[24-26]。因此,導(dǎo)入外源基因或沉默甚至敲除相關(guān)代謝途徑上的影響菊花香氣屬性的關(guān)鍵基因可為花香的遺傳改良提供新的有效辦法。在雜交培育菊花新品種的背景下,充分了解不同花型及花徑切花菊花花香釋放的多樣性,不僅可為挖掘潛在的調(diào)控菊花花香關(guān)鍵基因提供基礎(chǔ),也可對控制菊花花香氣成分生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆及功能驗證提供理論依據(jù)[27]。未來,可運用多組學(xué)對花香關(guān)鍵調(diào)控基因進行挖掘,并結(jié)合基因工程技術(shù)對切花菊花香品質(zhì)進行改良,為切花菊相關(guān)應(yīng)用產(chǎn)業(yè)的開發(fā)提供依據(jù)。