半楓荷調(diào)控RA模型的非靶向代謝組學(xué)研究

王華坤， 肖方靜， 賓萬娟， 傅春青， 尹 麗,2*

( 1. 玉林師范學(xué)院 生物與制藥學(xué)院, 廣西 玉林 537000; 2. 玉林師范學(xué)院地產(chǎn)藥用資源開發(fā)與生物工程技術(shù)中心, 廣西 玉林 537000 )

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎又稱類風(fēng)濕(rheumatoid arthritis, RA)，是一種病因未明的以關(guān)節(jié)滑膜炎癥病變?yōu)橹鞯娜硇月约膊?，滑膜炎癥、關(guān)節(jié)腫脹疼痛、軟骨和骨損壞、功能受限為主要癥狀(Kowalik et al., 2018; Zulfiqar et al., 2019; Pandey et al., 2019)，RA影響患者的生命周期、治療周期長且醫(yī)療費(fèi)用較高。臨床上用于治療RA藥物主要有非甾體類抗炎(NSAIDS) (Zavodovsky & Sivordova, 2018; Malano & Strusberg, 2019; Abbasi et al., 2019)、改善病情抗風(fēng)濕藥(DMARDs)(Roodenrijs et al., 2018; Cacciapaglia et al., 2018; Khilfeh et al., 2019)、糖皮質(zhì)激素(George & Baker,2019; Lillegraven et al., 2019)、生物劑制(Aletaha & Smolen, 2018)等，能夠改善僵硬及減緩?fù)闯?，但常出現(xiàn)物質(zhì)代謝和水鹽代謝紊亂、免疫耐受及胃腸道方面的副作用，不宜長期用藥(Krüger, 2018; Wilson et al., 2019)。因此，研究人員將重點(diǎn)轉(zhuǎn)向傳統(tǒng)中藥及方劑，篩選藥性溫和、毒副作用少、活性成分和作用機(jī)制比較明確的中藥緩解病患痛苦。

半楓荷()為金縷梅科半楓荷屬，全株入藥，是中國特有的單種屬植物(國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會, 1999)。藥用半楓荷始載于《嶺南采藥錄》，具有活血化瘀止痛、溫經(jīng)散寒除濕的作用(南京中醫(yī)藥大學(xué), 2006)，主治“肢體麻痹、風(fēng)濕腰腿痛、跌打損傷、關(guān)節(jié)不利、半身不遂、產(chǎn)后風(fēng)癱”等，為民間驗(yàn)方的組成之一，廣泛使用于苗族、瑤族、畬族、壯族等多個民族，有著悠久的臨床用藥歷史和確切的療效(中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會, 1984; 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會, 1999; 中國科學(xué)院廣西植物研究所, 2005)。廣西壯族民間用半楓荷煎湯當(dāng)茶飲，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效甚佳，臨床上以金縷梅科半楓荷最為常用且抗風(fēng)濕效果最佳(Liang et al., 2015; Yang et al., 2016)。由于半楓荷資源稀少，分布零散，所以目前對半楓荷的研究屬于起步階段。葉興狀等(2020)分析了半楓荷轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)信息，為分子標(biāo)記輔助育種提供參考。田曉明等(2018，2021)先后采用UPLC-QTOF/MS分析半楓荷根不同部位化學(xué)成分及半楓荷不同組織間差異代謝物，發(fā)現(xiàn)瓜氨酸、膽酸、白藜蘆醇和7-羰基豆甾醇等化學(xué)成分在根皮中含量最高，不同組織中差異萜類化合物主要為三萜化合物。廖娜等(2019)成功制備金縷半楓荷的總多酚并證實(shí)其具有顯著的抗菌、抗氧化能力。蔣楊等(2021)發(fā)現(xiàn)半楓荷的水、醇提取物對小鼠具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用。目前，關(guān)于半楓荷的研究主要涉及遺傳育種、化學(xué)成分和藥理活性等方面，鮮少涉及代謝組學(xué)領(lǐng)域。

代謝組學(xué)可用于研究RA疾病特征和發(fā)病機(jī)制(Ma et al., 2018)，采用代謝組學(xué)和動物病癥模型相互結(jié)合的研究思路和方法，偏重應(yīng)用現(xiàn)代分析手段考察類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)展進(jìn)程中的內(nèi)源性小分子代謝物，闡明疾病發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制。本課題組前期通過圖譜指認(rèn)以及文獻(xiàn)調(diào)研(梁偉紅等,2015; 盧海嘯等, 2015)，明確了半楓荷抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥用部位為半楓荷根，抗炎鎮(zhèn)痛天然活性物質(zhì)含量豐富。同時，采用弗氏完全佐劑(CFA)誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，以足腫脹、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、大鼠體重增加、免疫器官指數(shù)、外周血液單核細(xì)胞中環(huán)氧合酶-2(COX-2)和5-脂氧合酶(5-LOX)表達(dá)水平及大鼠血清中炎性細(xì)胞因子表達(dá)為依據(jù)，初步證實(shí)半楓荷根正丁醇提取部位高劑量組具有顯著的抗RA活性。半楓荷在廣西少數(shù)民族地區(qū)使用廣泛且療效確切，但活性成分及作用機(jī)制不清，為了進(jìn)一步闡明該壯藥對RA調(diào)控作用，本研究借助UPLC/QTOF-MS對半楓荷根活性部位提取物給藥前后RA模型大鼠血漿進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，擬探討以下問題：(1) 大鼠給藥組和模型組血漿是否存在差異代謝物；(2) 差異代謝物富集在哪些信號通路；(3) 半楓荷正丁醇提取物主要通過調(diào)節(jié)哪些內(nèi)源性代謝物水平從而調(diào)控RA。以期從內(nèi)源性代謝物的角度為半楓荷根抗RA的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材

半楓荷 ()由玉林師范學(xué)院盧海嘯教授采集并鑒定為金縷梅科半楓荷屬植物半楓荷的干燥根。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示半楓荷根正丁醇提取部位高劑量組具有顯著的抗RA活性，故選其作為該文實(shí)驗(yàn)用藥。提取方法：干燥的半楓荷根藥材經(jīng)粉碎過篩，選用75%乙醇回流提取2～3次，每次0.5～1.5 h，合并提取液，減壓濃縮得到浸膏，用水混懸后正丁醇進(jìn)行萃取，合并3次萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑并濃縮為稠浸膏即得，出膏率為10.67%。

1.2 動物

SPF級健康SD種雄性大鼠，體重(250±1) g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心 [許可證號：SCXK(桂)2014-0002]。飼養(yǎng)條件：室溫22～25 ℃，相對濕度：55%～70%。

1.3 試劑與儀器

ACQUITY UPLCBEH HILIC色譜柱(美國Waters公司)；Triple TOF 6600+四級桿高分辨飛行時間質(zhì)譜儀(美國SCIEX公司)；Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和SHZ-D (III)循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；DZKW-S-8型水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；FW100型高速萬能粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；Micro21R型臺式高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)；ZNCL-T型電熱套(上?？粕齼x器有限公司)；ABS型小動物氣體麻醉機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；色譜純甲醇和乙腈(德國Merck公司)；弗氏完全佐劑(美國Sigma-Aldrich公司)；Milli-Q 純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.4 方法

1.4.1動物給藥及樣品采集 24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組：模型組和給藥1 h組(經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選用半楓荷根正丁醇提取液給藥1 h后取血)，=12；大鼠右后足趾皮下注射0.1 mL CFA致炎造模，給藥前12 h禁食不禁水。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，半楓荷根正丁醇提取液給藥劑量按5.4 g·kg體重計(jì)算，模型組給予等體積生理鹽水；大鼠灌胃給藥1次，給藥后1 h后麻醉大鼠并經(jīng)肝門靜脈采集血樣，模型組同法操作；用抗凝管采血，4 ℃ 4 000 r·min離心15 min，收集血漿并分裝于離心管，液氮速凍后置于-80 ℃保存。

1.4.2 樣本處理 吸取血漿100 μL置于不含抗凝劑的無菌Ep管中，加適量經(jīng)預(yù)冷處理的甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1，v/v)，渦旋混勻后低溫超聲處理30 min，-20 ℃ 條件下放置10 min，4 ℃條件下以14 000離心20 min，真空干燥上清液，分析前加乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶1，v/v)100 μL復(fù)溶，4 ℃ 條件下以14 000離心 15 min，取上清液5 μL進(jìn)樣分析。質(zhì)控(quality control，QC)樣本為所有血漿樣本混合后取100 μL，同法處理。

1.4.3 數(shù)據(jù)采集 樣品采用 Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC)配合ESI源，ACQUITY UPLCBEH HILIC色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)在正負(fù)離子模式下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。柱溫 25 ℃；流速0.5 mL·min；進(jìn)樣量2 μL；流動相組成A為水+25 mmol·L乙酸銨+25 mmol·L氨水，B為乙腈。梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，B從 95%線性變化至65%；7～8 min，B從65%線性變化至40%；8～9 min，B維持在40%；9～9.1 min，B從40%線性變化至95%；9.1～12 min，B維持在95%。HILIC 色譜分離后的 ESI 源條件如下：質(zhì)譜參數(shù)為霧化氣(GS1) 60 psi，輔助加熱氣(GS2) 60 psi，氣簾氣(CUR) 30 psi，溫度(TEM) 600 ℃，毛細(xì)管電壓(IS)±5 500 V(正負(fù)兩種模式)；TOF MS 掃描范圍為60～1 000 Da，產(chǎn)物離子掃描范圍為25～1 000 Da，TOF MS 掃描累積時間為0.20 s/spectra，產(chǎn)物離子掃描累積時間為0.05 s/spectra；二級質(zhì)譜采用信息依賴型獲取模式(IDA)獲得，并且采用超高靈敏度模式，去簇電壓(DP)±60 V(正負(fù)兩種模式)，CES碰撞能力疊加(35±15) eV。IDA 設(shè)置如下：排除4 Da內(nèi)的同位素，每個循環(huán)監(jiān)測的候選離子：10。采取隨機(jī)順序進(jìn)行樣本連續(xù)分析，可以避免儀器檢測信號波動帶來的影響，取等量的各組樣品混合作為質(zhì)控樣本，每運(yùn)行6個樣本采集一次質(zhì)控樣本，以評價(jià)和監(jiān)測系統(tǒng)穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析 UPLC/QTOF-MS導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，使用Progenesis(V2.3，UK)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，去躁、基線校準(zhǔn)、峰對齊、峰識別、積分、精確保留時間、計(jì)算歸一化峰強(qiáng)度。化合物鑒定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級碎片以及同位素分布，利用 PeakView(AB SCIEX，USA)提取差異代謝物的二級碎片質(zhì)譜并借助HMDB(Human Metabolome Database)和 METLIN (metlin.scripps.edu)進(jìn)行鑒定并驗(yàn)證。所得數(shù)據(jù)矩陣作統(tǒng)計(jì)分析，利用 MarkerView(AB SCIEX，USA)進(jìn)行一級質(zhì)譜的提取，經(jīng)數(shù)據(jù)校正和歸一化后導(dǎo)入SIMCA-P(14.0)進(jìn)行PCA和OPLS-DA等多維統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)變量的VIP(variable importance in projection)>1和|Pcorr|(Pearson correlation)>0.52 為標(biāo)準(zhǔn)，挑選差異代謝物。SPSS(20.0)對篩出的變量進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，挑選<0.05的代謝物。KEGG pathway(https://www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫對血漿樣品差異代謝物作通路富集分析，用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)比較給藥前后試驗(yàn)組的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿代謝物定性分析及化學(xué)分類歸屬

用UPLC-MS技術(shù)對所有血漿樣本進(jìn)行色譜分離及質(zhì)譜分析，代謝物在正離子和負(fù)離子模式下得到很好區(qū)分。通過重疊比較質(zhì)控樣本總離子流色譜圖(total ion chromatogram，TIC)(圖1)，發(fā)現(xiàn)各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時間基本重疊，說明實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中儀器誤差引起的變異較小。經(jīng)The Human Metabolome Database、Lipidmaps(V2.3)以及METLIN數(shù)據(jù)庫定性分析，正負(fù)離子模式合并后共鑒定出321種代謝物，其中負(fù)離子模式鑒定出174種代謝物，正離子模式鑒定出192種代謝物。所有鑒定的代謝物(合并正負(fù)離子鑒定到的代謝物)根據(jù)其化學(xué)分類歸屬信息進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)歸為12種類型：有機(jī)酸及衍生物、脂類及類脂分子、有機(jī)雜環(huán)化合物、有機(jī)含氧化合物、核苷、核苷酸及類似物、苯環(huán)型化合物、有機(jī)氮化合物、有機(jī)硫化合物、苯丙烷類和聚酮酸類、未分類化合物。分類信息顯示有機(jī)酸及其衍生物和脂類及類脂分子這2類代謝物數(shù)量占比均較高，在代謝物中分別占20.87%和15.89%(圖 2)。

圖 1 正離子(A)和負(fù)離子(B)模式血漿樣本總離子流圖Fig. 1 LC-MS total ion chromatography (TIC) of plasma samples in ES+ mode (A) and ES- mode (B)

A. 未分類化合物; B. 有機(jī)酸及衍生物; C. 脂類及類脂分子; D. 有機(jī)雜環(huán)化合物; E. 有機(jī)含氧化合物; F. 核苷、核苷酸及類似物; G. 有機(jī)含氮化合物; H. 苯環(huán)型化合物; I. 苯丙烷類和聚酮酸類; J. 有機(jī)氮化合物; K. 有機(jī)硫化合物; L. 苯丙烷類和聚酮酸類/生物堿及衍生物。A. Undefiend; B. Organic acids and derivatives; C. Lipids and lipid-like molecules; D. Organic oheterocyclic compounds; E. Organic oxygen compounds; F. Nucleosides, nucleotides and analog-ues; G. Organic nitrogen compounds; H. Benzenoids; I. Phenylpropanoids and polyketides; J. Organic nonitrogen compounds; K. Organic sulfur compounds; L. Phenylpropanoids and polyketides/alkalo ids and derivatives.圖 2 鑒定的代謝物在各化學(xué)分類的數(shù)量占比Fig. 2 Percentage of identified metabolites by chemical classification

2.2 組間差異分析

2.2.1 單變量統(tǒng)計(jì)分析 分析給藥組和模型組血漿代謝物差異，主要的單變量統(tǒng)計(jì)分析方法包含變異倍數(shù)分析(Fold Change Analysis，F(xiàn)C Analysis)、檢驗(yàn)/非參檢驗(yàn)。 單變量分析法對正、負(fù)離子模式下得到的所有代謝物(含未被鑒定的代謝物)做差異性分析，采用火山圖(圖3)的形式來進(jìn)行可視化展示，玫紅色表示FC > 1.5，< 0.05 顯著差異代謝物(上調(diào))，藍(lán)色表示FC<0.67，< 0.05 顯著差異代謝物(下調(diào))。

圖 3 正離子(A)和負(fù)離子(B)模式火山圖Fig. 3 Volcanic plots of ES+ mode (A) and ES- mode (B)

2.2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析 非監(jiān)督性的主成分分析(PCA)評價(jià)儀器和方法的穩(wěn)定性，分析所有實(shí)驗(yàn)樣本和質(zhì)控樣本提取得到的峰，如圖4：A所示。在PCA圖中，為決定PCA模型質(zhì)量的主要參數(shù)，經(jīng)過7次循環(huán)交互驗(yàn)證得知(cum)=0.579>0.5，質(zhì)控樣本聚集緊密，顯示采集樣品期間儀器穩(wěn)定、方法穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較好，可進(jìn)行下一步分析。另外，PCA圖也顯示給藥組和模型組血漿分離完全，兩組間代謝輪廓間存在顯著性差異，給藥組的代謝差異明顯區(qū)別于模型組。之后建立偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型驗(yàn)證給藥組和模型組之間的代謝譜分離狀況。PLS-DA模型參數(shù)(cum)=0.997，(cum)=0.892>0.5，表明模型穩(wěn)定可靠(圖4：B)。為避免在建模過程中發(fā)生模型過擬合，對模型采用置換檢驗(yàn)以保證模型的有效性。200次檢測結(jié)果隨著置換保留度逐漸降低，隨機(jī)模型的和均逐漸下降，表明原模型不存在過擬合狀況，模型良好穩(wěn)健，可以據(jù)此結(jié)果篩選差異代謝物。借助監(jiān)督性的OPLS-DA分析，進(jìn)行潛在差異代謝物尋找，給藥組和模型組(圖4：C)分離完全，7次循環(huán)交互驗(yàn)證和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，(cum)=0.574，(cum)=0.963，=0.841，再次表明給藥前后血漿代謝物之間的差異顯著，OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠。同時，對該模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)，隨著置換保留度逐漸降低，隨機(jī)模型的和均逐漸下降，沒有過擬合(圖4：D)。以上結(jié)果說明，在PCA模型、PLS-DA模型和OPLS-DA模型中給藥組和模型組的血漿樣本均存在顯著性差異，所獲得的數(shù)據(jù)可用于差異代謝物的篩選。本試驗(yàn)以 OPLS-DA VIP>1 和<0.1為顯著差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)，最后一共篩選鑒定到12個潛在差異代謝物(表1)，如D-甘露醇、3-甲基組氨酸、二乙醇胺、D-脯氨酸、鞘氨醇、膽酸、DL-苯丙氨酸等。鑒定到的顯著性差異代謝差異倍數(shù)變化以柱狀圖直觀展示(圖5)。各代謝物在給藥組和模型組血漿中的相對水平通過熱圖分析可視化(圖 6)。

A. 總體樣本主成分分析得分圖； B. 偏最小二乘判別分析平面散點(diǎn)圖； C. 正交偏最小二乘判別分析得分圖； D. 正交偏最小二乘判別分析模型置換檢驗(yàn)結(jié)果圖。A. Score plot for PCA model; B. Score plot for PLS-DA mode; C. Score plot for OPLS-DA model; D. Validation plot of OPLS-DA model.圖 4 給藥組和模型組血漿代謝物多維統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Fig. 4 Multivariate statistical analysis of plasma metabolites in administration and model groups

表 1 正離子模式顯著性差異代謝物表Table 1 Metabolite table with significant difference in positive ion mode

A. 四氫巴豆甾酮; B. L-色氨酸; C. ?；蛆Z(去氧)膽酸; D. 1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿; E. N-二十二碳酰-4-鞘氨醇-1-O-磷酰膽堿; F. 1-棕櫚酰-2-羥基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺; G. 1-硬脂酰-2-花生四烯醇-sn-甘油; H. 1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿; I. 甜菜堿; J. 二甲基砜; K. 牛膽素; L. L-苯丙氨酸; M. 尿素; N. L-組氨酸; O. 肌酸; P. 2-乙氧基乙醇; Q. 神經(jīng)鞘氨醇; R. 3-羥基丁酸乙酯; S. 泛酸酯; T. L-纈氨酸; U. 煙酰胺; V. 甜菜醛; W. 尿嘧啶; X. 皮質(zhì)酮; Y. 二乙醇胺; Z. (3-羧基丙基)三甲基銨陽離子; a. 1-甲基煙酰胺; b. 氧化三甲胺; c. 2-甲基丁基肉堿; d. 膽酸。A. Tetrahydrocroticosterone; B. L-tryptophan; C. Taurochenodeoxycholate; D. 1-Stearoyl- 2- oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (SOPC); E. N-Docosanoyl-4-sphingenyl-1-O-phosphorylcho-line; F. 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; G. 1-Stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol; H. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine; I. Betaine; J. Dimethyl sulf one; K. Taurine; L. L-Phenylalanine; M. Urea; N. L-Histidine; O. Creatine; P. 2-Ethoxyethanol; Q. Sphingosine; R. Ethyl 3-hydroxybutyrate; S. Pantothenate; T. L-valine; U. Nicotinamide; V. Betaine aldehyde; W. Uracil; X. Corticosterone; Y. Diethanolamine; Z. (3-Carboxypropyl) trimethylammonium cation; a. 1-Methylnicotinamide; b. Trimethylamine N-oxide; c. 2-Methyl butyroyl carnitine; d. Cholic acid.圖 5 顯著性差異代謝物表達(dá)差異倍數(shù)分析Fig. 5 Difference multiple analysis of significant metabolites expression

A. 甜菜堿; B. 1-棕櫚酰-2-羥基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺; C. ?；蛆Z膽酸鹽; D. 1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿; E. L-色氨酸; F. 四氫巴豆甾酮; G. 1-硬脂酰-2-花生四烯醇-sn-甘油; H. 1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿; I. N-二十二碳酰-4-鞘氨醇-1-O-磷酰膽堿; J. L-纈氨酸; K. 牛膽素; L. 泛酸酯; M. 甜菜醛; N. 二乙醇胺; O. 2-乙氧基乙醇; P. 3-羥基丁酸乙酯; Q. L-組氨酸; R. 2-甲基丁基肉堿; S. 1-甲基煙酰胺; T. 膽酸; U. 尿嘧啶; V. 氧化三甲胺; W. 尿素; X. (3-羧基丙基)三甲基銨陽離子; Y. 肌酸; Z. 煙酰胺; a. 皮質(zhì)酮; b. L-苯丙氨酸; c. 神經(jīng)鞘氨醇; d. 二甲基砜。A. Betaine; B. 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; C. Taurochenode- oxycholate; D. 1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphocholine(SOPC); E. L-tryptophan; F. Tet-ahydrocroticosterone; G. 1-Stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol; H. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero- 3-phosphatidylcholine; I. N-docosanoyl-4-sphingenyl-1-O-phosphorylcholine; J. L-valine; K. Taurine; L. Pantothenate; M. Betaine aldehyde; N. Diethanolamine; O. 2-Ethoxyethanol; P. Ethyl 3-hydroxy- butyrate; Q. L-histidine; R. 2-Methylbutyroylcarnitine; S. 1-Methylnicotinamide; T. Cholic acid; U. Uracil; V. Trimethylamine N-oxide; W. Urea; X. (3-Carboxypropyl)trimethylammonium cation; Y. Creatine; Z. Nicotinamide; a. Corticosterone; b. L-phenylalanine; c. Sphingosine; d. Dimethyl sulfone.圖 6 大鼠模型組和給藥組血漿差異代謝物熱圖分析Fig. 6 Heat map of difference metabolites of plasma differential metabolites in model and administration groups

2.3 差異代謝物通路富集

通路富集分析得知12種差異代謝物的37個通路有顯著性差異(<0.05)。以氣泡圖形式呈現(xiàn)代謝通路富集分析結(jié)果(圖7)， 以橫坐標(biāo)和氣泡大小的形式體現(xiàn)代謝通路的影響因子大小，氣泡大小與影響因子成正比；以縱坐標(biāo)和氣泡顏色示意富集分析的值，顏色越深值越小，富集程度越顯著。通路富集表明， 氨基酸代謝通路較為豐富，分別為甘氨酸，絲氨酸與蘇氨酸代謝、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸生物合成、-丙氨酸代謝、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成。此外，蛋白質(zhì)的消化和吸收、腫瘤膽堿代謝通路和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白富集到的差異代謝物數(shù)量最多。37個通路均表現(xiàn)為顯著上調(diào)(表2)。

A. EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥; B. 癌癥膽堿代謝; C. 非洲錐蟲病; D. 脂肪細(xì)胞脂解; E. 鞘脂信號通路; F. 癌癥中樞碳代謝; G. 蛋白質(zhì)消化吸收; H. 逆行內(nèi)酰苷信號; I. 礦質(zhì)吸收; J. 泛酸和輔酶A生物合成; K. β-丙氨酸代謝; L. 醛固酮合成和分泌; M. 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝; N. 氨酰tRNA生物合成; O. 初級膽汁酸生物合成; P. 嘧啶代謝; Q. 甘油磷脂代謝; R. 脂肪酸生物合成; S. ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白; T. 膽汁分泌。A. EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance; B. Choline metabolism in cancer; C. African trypanosomiasis; D. Regulation of lipolysis in adipocytes; E. Sphingolipid signaling pathway; F. Central carbon metabolism in cancer; G. Protein digestion and absorption; H. Retrograde endocannabinoid signaling; I. Mineral absorption; J. Pantothenate and CoA biosynthesis; K. β-Alanine metabolism; L. Aldosterone synthesis and secretion; M. Glycine,serine and threonine metabolism; N. Aminoacyl-tRNA biosynthesis; O. Primary bile acid biosynthesis; P. Pyrimidine metabolism; Q. Glycerophospholipid metabolism; R. Fatty acid biosynthesis; S. ABC transporters; T. Bile secretion.圖 7 大鼠給藥組和模型組血漿差異代謝物KEGG通路富集分析Fig. 7 KEGG pathway enrichment analysis of plasma differential metabolites in administration and model groups

表 2 大鼠給藥組和模型組KEGG通路富集分析Table 2 Enrichment analysis of KEGG pathways of administration and model groups

3 討論與結(jié)論

針對鑒定得到的半楓荷活性部位調(diào)控疾病的差異代謝物及通路進(jìn)行分析，可知佐劑型關(guān)節(jié)炎代謝異?；衔锏姆N類錯綜復(fù)雜，涉及的代謝通路多且富集在脂類代謝和氨基酸代謝通路。半楓荷根正丁醇提取物主要影響氨基酸(如苯丙氨酸、脯氨酸、組氨酸和色氨酸等)、嘧啶(尿嘧啶)和脂類代謝產(chǎn)物(1-硬脂酰-2-花生四烯酰--甘油、二乙醇胺、神經(jīng)鞘氨醇、D-甘露醇、1-硬脂酰-2-烯酰--甘油3-磷酸膽堿等)等內(nèi)源性代謝物的表達(dá)水平。本研究表明，氨基酸、神經(jīng)鞘氨醇、磷脂等內(nèi)源性代謝物體內(nèi)表達(dá)量與RA疾病發(fā)展息息相關(guān)，氨基酸代謝紊亂直接影響RA疾病進(jìn)展。多種氨基酸介導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致體內(nèi)氨基酸水平甚至能夠調(diào)控疾病疼痛程度。色氨酸可反映膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的存在和嚴(yán)重程度，色氨酸代謝增加，提示其機(jī)體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)。色胺酰-tRNA合成酶 (tryptophanyl-tRNA-synthetase，TTS)能介導(dǎo)色氨酸與tRNA特異性結(jié)合，催化合成的色胺酰-tRNA復(fù)合物直接構(gòu)成了蛋白質(zhì)合成的色氨酸儲存庫，在局部組織內(nèi)激發(fā)色氨酸水平升高，進(jìn)而刺激淋巴細(xì)胞的增殖和分化。外周血微環(huán)境中的色氨酸代謝途徑失衡可通過激活RA患者自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞破壞自身組織，導(dǎo)致RA發(fā)病(Han et al., 2017)。陳雙雙等(2020)研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥方法治療前、后，RA患者血清中的游離氨基酸表達(dá)水平具有顯著性差異，治療后患者血清谷氨酸、天冬氨酸及苯丙氨酸水平降低，-氨基酸、亮氨酸、色氨酸、牛磺酸及甘氨酸的水平升高明顯，提示蛋白分解代謝增強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與這些報(bào)道一致。3-甲基組氨酸為多肽鏈上的組氨酸經(jīng)過甲基化所得的產(chǎn)物，屬于動物骨骼肌蛋白分解代謝產(chǎn)物之一(Kochlik et al., 2018)，可參與蛋白質(zhì)消化吸收代謝，組氨酸能夠治療心臟病、貧血、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，RA患者適量多食用富含組氨酸食物有益于關(guān)節(jié)健康。本研究中半楓荷根正丁醇提取物降低了大鼠血漿中的3-甲基組氨酸含量，推測其通過抑制大鼠骨骼肌蛋白分解代謝，調(diào)控能量代謝，進(jìn)而調(diào)節(jié)肌肉收縮功能障礙等原因，改善了給藥組大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀。神經(jīng)酰胺是炎癥關(guān)鍵信號分子，神經(jīng)鞘氨醇是神經(jīng)酰胺細(xì)胞內(nèi)的合成原料來源之一，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)的一個機(jī)械性途徑(mechanistic pathway)(Goins & Spassieva, 2018)。本研究表明鞘氨醇在給藥組和模型組之間存在差異，給藥組血漿內(nèi)鞘氨醇水平降低，參與蛋白質(zhì)消化吸收通路，表明鞘氨醇合成大量神經(jīng)酰胺對炎癥反應(yīng)進(jìn)行應(yīng)答。D-甘露醇和D-脯氨酸參加ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代謝通路，其作為滲透性脫水劑迅速提高血漿滲透壓并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋謝，兩者水平在給藥大鼠體內(nèi)下調(diào)，緩解了體內(nèi)血液滲透壓，從而使半楓荷根正丁醇提取物達(dá)到改善關(guān)節(jié)炎的效果。文獻(xiàn)顯示，RA發(fā)病與體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常同樣存在密切關(guān)系。日常餐飲中改變脂肪成分能夠影響機(jī)體內(nèi)細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成，包括細(xì)胞免疫系統(tǒng)，而這些變化也可以改變膜的功能，進(jìn)而影響風(fēng)濕性疾病的發(fā)生和發(fā)展。脂肪酸的免疫調(diào)節(jié)功能參與代謝和免疫之間的相關(guān)性，作為一種信號分子，通過多種方式參與炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路，誘發(fā)炎癥反應(yīng)(Tong & Zhou, 2018)。Pang等(2018)采用血漿代謝組學(xué)技術(shù)評估CIA大鼠代謝變化，同樣得出RA發(fā)病與脂質(zhì)代謝異常相關(guān)這一結(jié)論。鞘氨醇等鞘脂代謝物參與RA等疾病的發(fā)展過程，調(diào)節(jié)免疫功能和炎癥反應(yīng)，揭示了本研究結(jié)果中RA模型組和給藥組血漿內(nèi)脂質(zhì)代謝物表達(dá)差異的原因。本研究從內(nèi)源性代謝物角度科學(xué)合理地解釋半楓荷根正丁醇提取物對RA的調(diào)控方式，主要是通過調(diào)節(jié)與疾病發(fā)生密切相關(guān)的氨基酸和脂類等異常代謝物的表達(dá)水平而發(fā)揮作用。本研究結(jié)果可為半楓荷藥用資源的深入開發(fā)提供新研究策略。