叢枝菌根真菌對(duì)鹽漬土辣椒生長(zhǎng)、生理代謝及土壤無(wú)機(jī)磷組分的影響

侯殿明

(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南中牟 451450)

土壤鹽漬化已成為影響植物生長(zhǎng)發(fā)育及土壤健康的全球性問(wèn)題。鹽脅迫帶來(lái)的滲透脅迫、離子失衡和pH值脅迫等不利影響可貫穿植物幼苗到成熟各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)節(jié)。在綠色植物中，鹽堿脅迫可對(duì)光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉、細(xì)胞間CO濃度增加以及活性氧(ROS)積累等，從而嚴(yán)重破壞植株正常的生理代謝。植物擁有各種酶促和非酶促抗氧化劑，可以通過(guò)不同生化步驟緩解過(guò)量ROS累積給細(xì)胞帶來(lái)的不利影響。超氧化物歧化酶(SOD)是消除超氧自由基的初始酶，其可催化超氧陰離子歧化為HO，隨后HO被過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)轉(zhuǎn)化為HO和O，從而有效緩解環(huán)境脅迫。

磷(P)是植物生長(zhǎng)必需的礦質(zhì)元素之一，同時(shí)也是不可再生資源。盡管許多地區(qū)的土壤P存量處于高儲(chǔ)量狀態(tài)，但土壤中的P礦化受到多因素影響使得作物產(chǎn)量受到P缺乏的限制。在南方地區(qū)，土壤多呈酸性，當(dāng)土壤pH值為5.55～5.91時(shí)，人為施入土壤的可溶性磷酸鹽容易被土壤中存在的鋁離子、鐵離子和鈣離子固定形成閉蓄態(tài)P，從而進(jìn)一步降低植物的P獲取量。在鹽漬土中，因Na水平過(guò)高，土壤中磷酸鈣的固定和金屬螯合作用較強(qiáng)，使得有效P水平變化較大且可用性低。根際微生物是一類生存在植物根系微域土壤的重要功能菌，可顯著影響微鹽漬土壤中可溶性磷的存在形態(tài)，研究表明，這些根際微生物可用作生物肥料，促進(jìn)植物生長(zhǎng)和P吸收。土壤微生物可以形成復(fù)雜的生態(tài)群落，通過(guò)其代謝活動(dòng)和植物相互作用影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，包括分解、養(yǎng)分循環(huán)轉(zhuǎn)化和大部分的土壤轉(zhuǎn)化過(guò)程。

叢枝菌根真菌(AMF)是一類廣泛存在于土壤的重要功能性微生物，AMF可幫助植物吸收土壤中的礦質(zhì)養(yǎng)分、協(xié)調(diào)生理生化代謝以及促進(jìn)宿主水分利用效率等，其中對(duì)植物P營(yíng)養(yǎng)狀況的改善尤為突出。先前的研究表明，AMF可與植物根部和延伸的菌絲形成穩(wěn)定的共生關(guān)系，可以雙向提高共生系統(tǒng)的養(yǎng)分和水分利用效率。同時(shí)，這些菌絲可以調(diào)節(jié)植物代謝(如抗氧化酶和過(guò)氧化物)以減輕環(huán)境對(duì)植物的損害，從而提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性。辣椒(L.)為茄科辣椒屬一年生草本植物，具有較高的生物活性功能物質(zhì)，是我國(guó)種植最為廣泛的蔬菜作物之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值。然而，目前關(guān)于AMF對(duì)逆境脅迫下辣椒的生長(zhǎng)及P養(yǎng)分吸收知之甚少?；诖?，本研究探索AMF施入量對(duì)辣椒生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝及磷形態(tài)的影響。研究結(jié)果可為AMF應(yīng)用于辣椒的施肥措施及可持續(xù)發(fā)展提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年7—9月在河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院園藝大棚中進(jìn)行。供試?yán)苯菲贩N為艷紅323F3，種子來(lái)自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所。

AMF接種菌劑由摩西斗管囊霉()、幼套近明球囊霉()及明根孢囊霉()混合而成，這3種菌株均購(gòu)自北京農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所。

試驗(yàn)地土壤類型為中壤土，0～20 cm土層土壤理化性質(zhì)：pH值為7.64，全氮含量為1.11 g/kg，堿解氮含量為64.7 mg/kg，有效磷含量為21.42 mg/kg，速效鉀含量為124.16 mg/kg，電導(dǎo)率為216.52 μS/cm，Na含量為5.5 mg/kg，為中等土壤鹽水平。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置單因素5水平完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素為施用叢枝菌根真菌菌劑(AM)，水平分別為0、20、40、60、80 g/kg，分別記為CK、AM20、AM40、AM60、AM80。每個(gè)處理重復(fù)3次。

盆栽裝置為聚乙烯塑料桶，盆高20 cm，上口徑15 cm，底徑13 cm。每盆裝土3 kg，按各處理的AMF施用量將菌劑與土壤混合均勻。將種子在5%雙氧水中浸泡2～3 min，表面消毒3次，再用無(wú)菌蒸餾水清洗數(shù)次，每盆施用種子9粒，發(fā)芽7 d后間苗至3株。辣椒株距40 cm，此后，每2周向盆缽中加入50 mL 0.5 mol/L Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液且不定時(shí)適量加水，試驗(yàn)其他管理措施同辣椒生產(chǎn)操作規(guī)程，培養(yǎng)50 d。

1.3 樣品采集及測(cè)定分析

1.3.1 辣椒生物量及根系A(chǔ)MF侵染率、植株生物量、磷含量及農(nóng)藝性狀測(cè)定 培養(yǎng)結(jié)束后，將根系切成 1 cm 長(zhǎng)的小段，采用品紅溶液染色，光學(xué)顯微鏡下用網(wǎng)格交叉記數(shù)法計(jì)算AMF侵染率，具體方法參照Phillips描述的方法。

收獲全部盆栽中的植物，將辣椒地上部、根系分離，置于烘箱中殺青30 min，70 ℃烘干至恒質(zhì)量并稱量記錄。農(nóng)藝性狀包括株高、葉片指數(shù)，測(cè)量方法同常規(guī)農(nóng)作物農(nóng)藝性狀測(cè)量。每個(gè)處理重復(fù)3次。干物質(zhì)測(cè)定完畢后，將植株粉碎處理，采用HSO-HO消化后采用釩鉬黃比色法測(cè)定植株磷含量。

1.3.2 辣椒光合色素、抗氧化物質(zhì)含量測(cè)定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定，可溶性蛋白含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定，光合色素包含葉綠素a、葉綠素b，兩者皆采用丙酮-乙醇混合浸提法測(cè)定，具體步驟參照高俊鳳的方法。

1.3.3 土壤磷形態(tài)含量測(cè)定 培養(yǎng)結(jié)束后，從每個(gè)處理的3次重復(fù)中收集根際土壤樣品。使用鐵鍬將包含根系的辣椒植株挖出，去除距離根系過(guò)遠(yuǎn)的土壤，從根部附近(0.5～2.0 cm)收集非根際土壤。為了收集根際部分，將整個(gè)植物從土壤中取出并輕輕搖動(dòng)擺脫松散的土壤，接著進(jìn)一步加重?fù)u動(dòng)以分離附著的根際土壤。根際土壤通過(guò)0.15 mm網(wǎng)篩采用NaOH熔融后鉬銻抗比色法進(jìn)行全磷測(cè)定。通過(guò)2 mm網(wǎng)篩進(jìn)行其他磷形態(tài)分析，有效磷(A-P)、閉蓄態(tài)磷(O-P)、無(wú)機(jī)形態(tài)磷(Fe-P、Al-P、Ca-P、Ca-P、Ca-P)含量的測(cè)定參考蔡鑫淋等的方法進(jìn)行。

1.3.4 辣椒氧化酶相關(guān)基因及磷吸收基因表達(dá)水平測(cè)定 根據(jù)目前GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)公布的辣椒(L.)轉(zhuǎn)錄組序列信息得到抗氧化酶相關(guān)的酶基因(-、、)。根據(jù)以上基因的序列借助Primer Express 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1)。根據(jù)Tan等報(bào)道的AMF介導(dǎo)的主要磷吸收基因，看家基因?yàn)?，使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Toyobo，Osaka，Japan)和Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。相關(guān)的RNA抽提和cDNA擴(kuò)增、檢測(cè)及反應(yīng)體系參照董桑婕的方法。相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔ算法進(jìn)行計(jì)算。

表1 qRT-PCR 引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用DPS 14.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(=0.05)，采用Origin 9.1軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 施入?yún)仓婢鷮?duì)辣椒侵染的影響

由圖1-A可知，未接種AMF處理無(wú)侵染情況，在接種處理中(AM20、AM40、AM60、AM80)菌根侵染率為49.73%～68.55%，各處理表現(xiàn)為AM80>AM60>AM40>AM20，且與AM20處理相比，AM40、AM60、AM80處理分別增加8.15、16.63、18.82百分點(diǎn)，其中AM60、AM80處理顯著大于AM20處理。由圖1-B可知，對(duì)AMF施用量與侵染率進(jìn)行線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，二者呈顯著正相關(guān)關(guān)系(=0.975、<0.05)，即隨著AMF施用量增加，侵染率隨之提高。

2.2 施入?yún)仓婢鷮?duì)辣椒生長(zhǎng)參數(shù)的影響

由表2可知，干物質(zhì)累積量中，以AM處理(AM20、AM40、AM60、AM80)較高，但AM處理間皆無(wú)顯著差異；與CK處理相比，AM20、AM40、AM60、AM80處理的干物質(zhì)分別顯著提高31.88%、65.27%、34.01%、26.38%。農(nóng)藝性狀中，各處理株高表現(xiàn)為AM40>AM20>AM80>AM60>CK，其中AM20、AM40處理無(wú)顯著差異，且兩者皆顯著大于其他處理；葉面積仍以CK處理最低，接種AMF的處理較其增加16.97%～65.36%，其中AM40、AM60處理顯著大于CK處理；莖粗中，處理間差距較小，兩兩處理間皆未達(dá)顯著差異水平。

表2 施入?yún)仓婢鷮?duì)辣椒農(nóng)藝性狀及葉綠素含量的影響

就葉綠素含量而言，葉綠素a含量以高AMF施用量處理(AM40、AM60、AM80)較高，三者間無(wú)顯著差異，且AM40處理顯著大于CK、AM20處理。各處理葉綠素b含量以AM60處理最高，為0.89 mg/g，AM40、AM80處理其次(0.86 mg/g)，三者間無(wú)顯著差異，且皆顯著大于CK、AM20處理。葉綠素a+b含量仍以CK處理最低，各處理表現(xiàn)為AM40>AM60>AM80>AM20>CK，與CK處理相比，接種AMF處理的葉綠素a+b含量顯著提高3.94%～15.75%，且AM40、AM60、AM80處理均顯著大于AM20處理。

2.3 施入?yún)仓婢鷮?duì)辣椒抗氧化系統(tǒng)參數(shù)的影響

由圖2-A可知，丙二醛含量中，以CK處理最高，AM處理(AM20、AM40、AM60、AM80)分別較其顯著降低50.6%、56.02%、52.22%、36.76%，其中AM80處理顯著大于其他AM處理。由圖2-B可知，可溶性糖含量以CK處理最低，顯著低于其他處理，以AM60處理最高，AM80處理其次，二者無(wú)顯著差異，且皆顯著高于CK、AM20處理?？扇苄缘鞍缀恐懈魈幚眄樞虮憩F(xiàn)為AM60>CK>AM40>AM20>AM80，但處理間皆無(wú)顯著差異(圖2-C)。

抗氧化酶相關(guān)基因中，超氧化歧化酶基因(-)以AM20處理表達(dá)水平最高，但AM處理間均無(wú)顯著差異，且與CK處理相比，AM處理顯著提高100.12%～183.52%(圖2-D)。過(guò)氧化氫酶基因()相對(duì)表達(dá)豐度則以AM40處理最高，為4.85，其他處理較其顯著降低51.34%～80.21%，此外AM60處理顯著大于AM20和CK處理(圖2-E)。過(guò)氧化物酶基因()的表達(dá)水平，各處理表現(xiàn)為AM60>AM40>AM20>AM80>CK，且與CK處理相比，AM20、AM40、AM60、AM80處理分別顯著提高234.51%、280.99%、535.21%、172.54%，其中AM60處理顯著大于其他AM處理(圖2-F)。

2.4 施入?yún)仓婢鷮?duì)辣椒土壤磷組分及總磷含量的影響

根際土壤無(wú)機(jī)磷組分分為有效磷(A-P)、鈣態(tài)磷(Ca-P、Ca-P、Ca-P)、鐵磷(Fe-P)、鋁磷(Al-P)、閉蓄態(tài)磷(O-P)和總磷(TP)。由圖3-A可知，就磷組分含量來(lái)看，鈣磷(Ca-P、Ca-P、Ca-P)是鹽漬土壤中的主要P組分，其組分含量占總組分的54.89%，各組分含量表現(xiàn)為Ca-P>O-P>Ca-P>Ca-P>A-P>Al-P>Fe-P，表明Ca-P是土壤中的主要磷組分。就處理來(lái)看，不同處理在不同磷組分中的規(guī)律不盡一致。整體而言，與CK處理相比，AM處理(AM20、AM40、AM60、AM80)整體提高了Al-P、Fe-P、A-P、Ca-P、Ca-P的含量，其增幅分別為33.14%～56.34%、7.67%～35.92%、38.26%～75.84%、4.77%～44.39%、4.51%～36.22%，但在 Ca-P、Ca-P中的效果不明顯；此外，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與CK處理相比，AM處理降低了O-P和 Ca-P的含量，其降幅分別為13.79%～25.59%、3.38%～9.17%。從土壤全磷含量來(lái)看，各處理表現(xiàn)為AM80>AM60>AM40>AM20>CK，但處理間均無(wú)顯著差異(圖3-B)。

2.5 施入?yún)仓婢鷮?duì)辣椒磷吸收量及相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖4-A可知，各處理辣椒植株磷含量表現(xiàn)為AM40>AM20>AM60>AM80>CK，其中AM40、AM20處理二者間無(wú)顯著差異，其他處理較AM40、AM20處理分別顯著降低10.02%～17.88%、13.03%～20.63%；以CK、AM80處理最低，二者無(wú)顯著差異且分別比AM60處理顯著降低8.74%、7.14%。在磷吸收基因中，CK處理的相對(duì)表達(dá)豐度為1.13，AM處理下該基因的表達(dá)水平顯著增加377～1 787倍，其中AM40處理的表達(dá)水平最高，顯著大于其他處理，AM20處理其次，其大于AM60、AM80處理，其中與AM80處理達(dá)顯著差異水平。

2.6 施入?yún)仓婢鷹l件下磷指標(biāo)間的相關(guān)性分析

從辣椒植株磷指標(biāo)及土壤磷指標(biāo)間的相關(guān)性分析結(jié)果(表3)可知，Ca-P含量與土壤全磷、O-P含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；O-P含量與Ca-P、Fe-P、Al-P、A-P含量及表達(dá)水平均呈顯著負(fù)相關(guān)；Fe-P含量與Al-P含量、表達(dá)水平與植株磷含量均呈極顯著正相關(guān)；表達(dá)水平與Ca-P、Al-P、A-P含量，植物磷含量與Ca-P、A-P 含量，A-P含量與Ca-P、Ca-P含量均呈顯著正相關(guān)。

表3 施入?yún)仓婢鷹l件下磷指標(biāo)間的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

土壤鹽堿脅迫可通過(guò)抑制一系列生理生化代謝從而限制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)，植物也已經(jīng)進(jìn)化出一系列防御機(jī)制來(lái)適應(yīng)環(huán)境脅迫，這涉及酶促反應(yīng)和滲透物質(zhì)。較長(zhǎng)時(shí)間的鹽脅迫會(huì)誘導(dǎo)活性氧的過(guò)量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致脂質(zhì)、DNA、RNA和蛋白質(zhì)過(guò)氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，接種AMF有助于減緩由過(guò)氧化對(duì)植物細(xì)胞造成的損害。本研究結(jié)果表明，在鹽漬土中施用AMF菌劑使辣椒幼苗的超氧化歧化酶基因(-)、過(guò)氧化氫酶基因()和過(guò)氧化物酶基因()表達(dá)水平發(fā)生明顯上調(diào)，且增加了可溶性糖含量，減少了MDA的積累。前人研究表明，AMF可以通過(guò)調(diào)節(jié)酶基因(如、)和非酶促基因(如、)來(lái)消除活性氧。其他研究表明，接種AMF可以提高脅迫條件下核桃幼苗中滲透物質(zhì)的水平，有助于減緩環(huán)境脅迫造成的損傷。然而，對(duì)于辣椒植株，這種作用體現(xiàn)在可溶性糖含量上，但在可溶性蛋白含量上不明顯。這表明，在施用AMF后，滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)不是增強(qiáng)辣椒幼苗耐鹽性的主要途徑。

普遍認(rèn)為，與土壤微生物構(gòu)建有益的共生關(guān)系是陸生植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的較佳策略之一，然而微生物與植物在相互促進(jìn)的本質(zhì)是物質(zhì)交換，因此共生關(guān)系隨著環(huán)境條件變化以及植物生長(zhǎng)、衰老和死亡而發(fā)生變化。本研究中，施用不同用量的叢枝菌根真菌均在辣椒幼苗根系上表現(xiàn)出較高的侵染率(49.73%～68.55%)，線性相關(guān)分析結(jié)果表明，AMF施用量與侵染率呈顯著正相關(guān)，即AM80處理侵染率最高。然而在干物質(zhì)、農(nóng)藝性狀及葉綠素含量等生長(zhǎng)參數(shù)中，AM80處理沒(méi)有表現(xiàn)出最好的促進(jìn)效果，這表明侵染率與辣椒植株長(zhǎng)勢(shì)之間沒(méi)有明顯的趨同性。就試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，AM40處理在干物質(zhì)量、株高、莖粗及葉綠素總量中具有最大值，同時(shí)明顯高于AM80處理。這可能是因?yàn)檩^高密度地接種AMF可能會(huì)降低或不平衡關(guān)鍵植物激素的濃度，此外，菌根共生的主要驅(qū)動(dòng)因素是植物光合碳產(chǎn)物與菌絲礦質(zhì)養(yǎng)分的交換，較大的AMF群體也意味著植物需供給較多的碳產(chǎn)物，因而多方面影響著宿主植株的生長(zhǎng)。

土壤P素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的重要礦質(zhì)元素，土壤P組分及其含量是決定土壤P供給水平的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明，鈣磷(Ca-P、Ca-P、Ca-P)是鹽漬土壤中的主要P組分；研究結(jié)果進(jìn)一步表明，與CK處理相比，AM處理(AM20、AM40、AM60、AM80)整體提高了Al-P、Fe-P、A-P、Ca-P、Ca-P含量，降低了O-P和Ca-P含量。此外，在本研究中，磷基因()和磷吸收量在施用AMF菌劑后整體提高，且峰值皆出現(xiàn)在AM40處理。本研究中，相關(guān)性分析結(jié)果表明，A-P含量與Ca-P、Ca-P含量呈正相關(guān)，F(xiàn)e-P含量與Al-P含量呈正相關(guān)，O-P含量顯示與Ca-P、Fe-P和Al-P含量呈負(fù)相關(guān)，表達(dá)水平與Ca-P、Al-P、A-P含量，植物磷含量與Ca-P、A-P含量，A-P含量與Ca-P、Ca-P含量均呈顯著正相關(guān)。這表明施用AMF菌劑可以將不溶和難溶性P(O-P、Ca-P)活化為可用P(A-P、Ca-P、Ca-P)和緩速P(Fe-P、Al-P)，從而為植株P(guān)吸收提供來(lái)源。可能原因有：(1)AMF可以形成一個(gè)致密的菌絲網(wǎng)絡(luò)，影響植物間的養(yǎng)分流動(dòng)，且磷酸鹽離子在菌絲內(nèi)擴(kuò)散速度比在根毛中更快，加速磷在土壤中的擴(kuò)散；(2)AMF可影響呼吸或有機(jī)酸(如草酸、檸檬酸等)分泌過(guò)程中的H分泌將不溶或難溶性P轉(zhuǎn)化為可溶性P形態(tài)；(3)AMF能夠誘導(dǎo)P轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，使寄主植物產(chǎn)生更多的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

目前，AMF的接種量沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，確定接種量的一些常用方法是由接種潛力、單位體積的孢子密度或接種物的質(zhì)量決定的。然而，在實(shí)際的大規(guī)模農(nóng)業(yè)實(shí)踐中，AMF是在培養(yǎng)后使用的，不僅含有孢子，還含有菌絲、囊泡、菌根段等繁殖體，在接種時(shí)應(yīng)加以考慮。本研究中，選擇傳統(tǒng)的孢子含量作為菌劑的施用指標(biāo)，整體而言，40 g/kg 的施用量對(duì)混合菌劑的定殖率、辣椒幼苗生長(zhǎng)和磷吸收與活化取得了最佳效果。這些結(jié)果為AMF菌劑在田間的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。