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    豆類(lèi)活性肽PA1b在大腸桿菌中的多拷貝串聯(lián)表達(dá)

    2022-08-11 06:34:46黃欣媛鄒禮平范紅波
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年15期
    關(guān)鍵詞:融合

    黃欣媛,鄒禮平,范紅波

    (1.湖北工程學(xué)院湖北省植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖北孝感 432000;2.湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部,湖北孝感 432000)

    PA1b(pea albumin 1 subunit b,豌豆白蛋白1b,又名豌豆胰島素、aglycin)是在豌豆種子中分離鑒定出的一種由37個(gè)氨基酸殘基組成的小分子活性肽,在其他豆科植物中有多種同源異構(gòu)體廣泛存在。它們分子內(nèi)均含有3對(duì)二硫鍵,形成高度緊湊的空間結(jié)構(gòu),因而性質(zhì)非常穩(wěn)定,耐殺菌劑變性,也不被胃蛋白酶和胰蛋白酶降解。PA1b具有抗蟲(chóng)活性,能殺死象鼻蟲(chóng)、蚜蟲(chóng)、蚊蟲(chóng)等害蟲(chóng),而對(duì)蜜蜂等益蟲(chóng)無(wú)害,有望開(kāi)發(fā)成新型生物殺蟲(chóng)劑。PA1b還能改善糖尿病模型鼠的糖脂代謝,具有開(kāi)發(fā)成口服降糖多肽藥物的潛力。

    基于PA1b在農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害防治和糖尿病藥物開(kāi)發(fā)中的潛力,大量獲取PA1b蛋白,進(jìn)行工業(yè)規(guī)模應(yīng)用或深入研究其作用機(jī)制就顯得十分必要。雖然可通過(guò)從豆科植物種子中提取純化來(lái)制備PA1b,但需避免同源異構(gòu)體混入、操作繁瑣、成本高且產(chǎn)量低下,最理想的還是通過(guò)基因工程技術(shù)將PA1b在異源系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。目前,在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)小片段的基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá),以提高其蛋白表達(dá)量的方法已成功應(yīng)用于多種小分子肽的原核表達(dá)制備,被證實(shí)簡(jiǎn)便且有效。本研究利用同尾酶法構(gòu)建了多拷貝串聯(lián)基因,置于表達(dá)載體pET32a(+)上,在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),并用腸激酶對(duì)融合標(biāo)簽和串聯(lián)體進(jìn)行切割,獲得重組PA1b多肽,為PA1b工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    質(zhì)粒pET32a(+)、大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α,由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 主要試劑和儀器

    限制性?xún)?nèi)切酶(Ⅰ、H Ⅰ和Ⅱ)、TDNA連接酶,購(gòu)自Thermo Fisher Scientific;小量質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、SanPCR擴(kuò)增試劑盒、異丙基硫代---半乳糖苷(IPTG)、Bradford蛋白定量試劑、蛋白質(zhì)Marker、Ni-NTA瓊脂糖親和純化樹(shù)脂預(yù)裝柱、腸激酶(帶His標(biāo)簽),均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;超濾管、透析袋為Millipore產(chǎn)品;其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    PCR儀,東勝創(chuàng)新生物科技有限公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;超微量分光光度計(jì),美析(中國(guó))儀器有限公司;核酸蛋白檢測(cè)儀、核酸電泳儀、垂直電泳儀,北京六一生物科技有限公司。

    1.3 PA1b基因合成和載體設(shè)計(jì)

    由圖1可知,將PA1b的氨基酸序列(A S C N G V C S P F E M P P C G S S A C R C I P V G L V V G Y C R H P S G)按照大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化,轉(zhuǎn)變成DNA序列,同時(shí)在5′端添加“HⅠ酶切位點(diǎn)(GGATCC)+腸激酶酶切位點(diǎn)(GACGACGACGACAAG)”,3′端添加“Ⅱ酶切位點(diǎn)(AGATCT)+腸激酶酶切位點(diǎn)(GACGACGACGACAAG)+Ⅰ酶切位點(diǎn)(C T C G A G)”,交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成該基因片段并置于pUC57載體上,命名為pUC57-1PA1b。該序列中,HⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)是為了使用雙酶切將基因片段亞克隆到表達(dá)載體pET32a(+)上;HⅠ和Ⅱ酶切位點(diǎn)是為了使用同尾酶法構(gòu)建串聯(lián)重組載體;腸激酶酶切位點(diǎn)是為了在融合蛋白分離純化以后使用腸激酶進(jìn)行特異性切割,將硫氧還蛋白(Trx A)、6×His等標(biāo)簽去除,同時(shí)也將串聯(lián)的PA1b剪切成單個(gè)多肽單元。

    1.4 重組表達(dá)載體pET32a(+)-nPA1b的構(gòu)建

    首先,采用同尾酶法構(gòu)建PA1b串聯(lián)多拷貝重組質(zhì)粒pUC57-(=2,3,4),方法見(jiàn)圖2,重復(fù)該過(guò)程,可依次獲得基因串聯(lián)重復(fù)2、3、4次的重組質(zhì)粒。分別采用CaCl法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中,菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆的正確性。

    其次,將pUC57-載體上的基因片段亞克隆至表達(dá)載體pET32a(+)上。方法是將驗(yàn)證后得到的pUC57-質(zhì)粒(=1,2,3,4)采用HⅠ與Ⅰ雙酶切切下串聯(lián)基因片段,膠回收該片段,與同樣雙酶切純化后的pET32a(+)載體片段按照摩爾濃度比8∶1混合,TDNA連接酶16 ℃過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物用CaCl法轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)大腸桿菌,從含氨芐青霉素的LB平板上挑取菌落進(jìn)行培養(yǎng),小量抽提質(zhì)粒,以pET32a(+)質(zhì)粒上多克隆位點(diǎn)上游的通用引物SoTag primer(G A A C G C C A G C A C A T G G A C A G C)和下游的通用引物T7 terminator primer(G C T A G T T A T T G C T C A G C G G)進(jìn)行PCR驗(yàn)證,將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET32a(+)-(=1~4)。

    1.5 重組PA1b的誘導(dǎo)表達(dá)

    挑取含pET32a(+)-的大腸桿菌單菌落,接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,再按100倍稀釋比例轉(zhuǎn)接至新鮮含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至為0.6時(shí),加入1 mmol/L的IPTG,25 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h。同時(shí),設(shè)置1組pET32a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌作為對(duì)照組。

    1.6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)

    誘導(dǎo)結(jié)束后,4 ℃離心收集菌體,PBS洗滌2次,PBS重懸后冰浴中進(jìn)行超聲破壁(功率400 W,總時(shí)間20 min,工作2 s,間隔6 s),4 ℃下12 000 r/min離心15 min,收集上清,將沉淀用包涵體溶解液(8 mol/L 尿素,50 mmol/L Tris-HCl,300 mmol/L NaCl,0.1% Triton X-100,pH值8.0)溶解。Bradford法測(cè)定上清和包涵體溶解液的總蛋白濃度,取25 μg總蛋白上樣,進(jìn)行12%分離膠的SDS-PAGE,考馬斯亮藍(lán)染色,凝膠成像儀記錄電泳圖譜。分析PA1b融合蛋白的可溶性,采用ImageJ v1.52圖像軟件分析條帶的光密度,計(jì)算PA1b蛋白的相對(duì)含量。

    1.7 PA1b融合蛋白的親和純化

    按“1.5”節(jié)和“1.6”節(jié)方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和菌體破碎,離心收集包涵體,包涵體用柱平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,5 mmol/L咪唑,8 mol/L尿素,pH值8.0)重溶后通過(guò) Ni-NTA 瓊脂糖樹(shù)脂柱進(jìn)行親和層析純化。進(jìn)樣前,利用2倍柱體積的平衡緩沖液平衡柱子。進(jìn)樣后,采用5~10倍柱體積的平衡緩沖液清洗柱子,直至流穿液的接近基線(xiàn)。最后采用2~5倍柱體積的洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,250 mmol/L咪唑,8 mol/L尿素,pH值8.0)洗脫帶有6×His標(biāo)簽的PA1b融合蛋白。透析去除咪唑和尿素,超濾管離心濃縮獲得PA1b融合蛋白。

    1.8 融合蛋白的腸激酶酶切和純化

    將純化的PA1b融合蛋白置于腸激酶酶切緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L NaCl,2 mmol/L CaCl,pH值7.6),按照50 μg融合蛋白加1U腸激酶的用量在16 ℃酶切36 h。酶切后的混合液再次進(jìn)行Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂親和層析純化,切下的Trx-His標(biāo)簽和帶有His標(biāo)簽的腸激酶結(jié)合到鎳柱上,而PA1b多肽存在于流穿液中。收集流穿液,采用截留量10 ku超濾管純化PA1b多肽,PA1b多肽在超濾管離心后的透過(guò)液中,進(jìn)行Tricine SDS-PAGE檢測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 表達(dá)載體pET32a(+)-nPA1b的構(gòu)建

    PA1b由111 bp DNA序列編碼,在基因合成時(shí)兩端分別添加了HⅠ和Ⅱ的酶切序列,由圖2可知,采用同尾酶法構(gòu)建了串聯(lián)重復(fù)序列載體pUC57-(=2,3,4),再亞克隆至表達(dá)載體pET32a(+)上,構(gòu)建成pET32a(+)-(圖1),轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取陽(yáng)性克隆,采用SoTag和T7 terminator引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增插入片段,由圖3可知,顯示擴(kuò)增出的條帶與目標(biāo)片段預(yù)期大小(PA1b單拷貝320 bp,二拷貝452 bp,三拷貝 584 bp,四拷貝716 bp)一致。進(jìn)而進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)插入片段的插入位置正確,且序列與理論設(shè)計(jì)完全一致,說(shuō)明多拷貝PA1b基因串聯(lián)載體構(gòu)建成功。

    2.2 PA1b融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析

    IPTG誘導(dǎo)pET32a(+)-宿主菌表達(dá)后,超聲破碎菌體,SDS-PAGE分析破碎組分的上清和沉淀部分,由圖4可知,相對(duì)于空載體對(duì)照,pET32a(+)-菌體裂解液上清和沉淀部分均明顯多出1個(gè)約38 ku條帶,和4拷貝串聯(lián)PA1b融合蛋白理論分子量相符,說(shuō)明融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功,且主要表達(dá)在包涵體中。

    2.3 不同拷貝數(shù)PA1b融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

    采用IPTG分別對(duì)含1~4串聯(lián)重復(fù)基因pET32a(+)-質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物,由圖5可知,1~4拷貝數(shù)PA1b融合蛋白的理論分子量分別約為25.2、29.4、33.6、37.8 ku,研究觀(guān)察到各融合蛋白分子量與理論分子量相符,說(shuō)明pET32a(+)-(=1,2,3,4)原核表達(dá)載體均能成功誘導(dǎo)表達(dá)。采用Image J軟件對(duì)各泳道進(jìn)行光密度分析,由表1可知,發(fā)現(xiàn)各拷貝數(shù)PA1b融合蛋白在包涵體總蛋白中的相對(duì)含量有差異,換算成PA1b的相對(duì)含量也有差異。理論上,質(zhì)粒中基因拷貝數(shù)越多,與載體質(zhì)量比越大,PA1b在融合蛋白中的含量就越高。根據(jù)圖5中融合蛋白實(shí)際表達(dá)水平進(jìn)行換算,結(jié)果發(fā)現(xiàn),pET32a(+)-表達(dá)產(chǎn)物中PA1b的相對(duì)含量最高(23.3%),約為單拷貝(5.5%)的4.2倍,因此在后續(xù)的融合蛋白分離純化和酶切試驗(yàn)中均選用pET32a(+)-菌株作為誘導(dǎo)表達(dá)菌。3拷貝和4拷貝串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物中PA1b的相對(duì)含量幾乎相同,說(shuō)明蛋白表達(dá)量和拷貝數(shù)之間并非線(xiàn)性正相關(guān)。

    表1 pET32a(+)-nPA1b表達(dá)融合蛋白水平及其中PA1b相對(duì)含量

    2.4 PA1b融合蛋白的純化

    將pET32a(+)-的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Ni-NTA柱親和層析純化,SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果,由圖6可知,發(fā)現(xiàn)分離純化后的4拷貝PA1b融合蛋白具有較高純度(97.8%)。

    2.5 PA1b融合蛋白腸激酶酶切

    由圖7可知,將純化后的PA1b融合蛋白采用腸激酶酶切,完全酶切后的蛋白混合液經(jīng)過(guò)Ni親和層析純化后,流穿液中得到切開(kāi)的無(wú)TrxA標(biāo)簽、無(wú)6×His標(biāo)簽的單拷貝PA1b多肽,經(jīng)超濾管濃縮去雜后,Tricin-SDS-PAGE檢測(cè)分子量約為4.5 ku,與理論預(yù)期相符。

    3 討論與結(jié)論

    大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有高效、條件易控、成本低等優(yōu)點(diǎn),是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。因此,本研究選用大腸桿菌作為PA1b的表達(dá)宿主。PA1b是一種小分子量多肽,且富含半胱氨酸,因此在進(jìn)行原核表達(dá)時(shí),要考慮如何提高蛋白表達(dá)量、促進(jìn)分子內(nèi)二硫鍵的正確形成、保持多肽天然折疊構(gòu)象等因素。本研究采用構(gòu)建串聯(lián)多拷貝基因的策略來(lái)提升表達(dá)量,通過(guò)同尾酶法構(gòu)建了插入1~4串聯(lián)拷貝數(shù)PA1b的重組載體,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析了各融合蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在“1.5”節(jié)中所述的誘導(dǎo)條件下,PA1b融合蛋白主要存在于包涵體中,且多拷貝數(shù)PA1b的表達(dá)量高于單拷貝,4拷貝串聯(lián)PA1b蛋白含量最高,提示串聯(lián)表達(dá)是提高產(chǎn)量的有效方法。然而,拷貝數(shù)并非越多越好,最佳拷貝數(shù)仍取決于載體上串聯(lián)肽與融合標(biāo)簽的相互影響、實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)條件等多種因素。

    本研究將串聯(lián)基因插入到具有Trx A、6×His等多個(gè)融合標(biāo)簽的pET32a(+)載體上進(jìn)行融合表達(dá),Trx A能提供氧化還原動(dòng)力,促進(jìn)PA1b分子內(nèi)二硫鍵形成??紤]到pET32a(+)載體上標(biāo)簽的去除可采用腸激酶酶切法,所以在構(gòu)建串聯(lián)基因時(shí),在各拷貝間也添加了腸激酶酶切位點(diǎn)。因此,在融合蛋白親和純化后,采用腸激酶酶切,既可去掉TrxA和6×His融合標(biāo)簽,也能將串聯(lián)的PA1b切割成單體重組PA1b多肽。結(jié)果表明,pET32a(+)-的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)親和純化后可獲得高純度的4拷貝PA1b融合蛋白,再經(jīng)腸激酶酶切、親和層析去雜、超濾濃縮后獲得了不帶TrxA標(biāo)簽的重組PA1b多肽。它比天然PA1b的C末端多了7個(gè)氨基酸殘基:Arg-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,這是否會(huì)對(duì)PA1b的活性造成影響,有待后續(xù)研究。

    在PA1b的原核表達(dá)方面,國(guó)內(nèi)外也有報(bào)道。2003年,Hanada等在BL21大腸桿菌中導(dǎo)入leginsulin(PA1b在黃豆中的同源異構(gòu)體,同源性約64%)基因,表達(dá)出帶有Trx標(biāo)簽的leginsulin。2004年,杜雯等將PA1b與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)構(gòu)建成融合基因在大腸桿菌DH5α中進(jìn)行了周質(zhì)空間可溶性表達(dá),然而融合蛋白的結(jié)構(gòu)過(guò)于龐雜而無(wú)PA1b活性,表達(dá)量太低,及MBP標(biāo)簽去除需經(jīng)Factor Xa酶切成本高,因而并無(wú)后續(xù)。最近,黃敏華等利用內(nèi)含肽與自組裝肽與Aglycin(PA1b別名)連接,在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),得到目標(biāo)蛋白聚集體,再通過(guò)內(nèi)含肽介導(dǎo)的N端自剪切,去掉了融合標(biāo)簽,制備無(wú)標(biāo)簽的Aglycin多肽。

    綜上,本研究采用串聯(lián)表達(dá)的方案在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中制備了豆類(lèi)活性肽PA1b的4拷貝融合蛋白,有效提高了PA1b表達(dá)量。經(jīng)腸激酶切割后,得到了無(wú)標(biāo)簽的單拷貝PA1b重組多肽,為多拷貝法制備PA1b肽奠定了基礎(chǔ)。

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