豆類活性肽PA1b在大腸桿菌中的多拷貝串聯(lián)表達

黃欣媛，鄒禮平，范紅波

(1.湖北工程學院湖北省植物功能成分利用工程技術研究中心，湖北孝感 432000；2.湖北職業(yè)技術學院醫(yī)學基礎部，湖北孝感 432000)

PA1b(pea albumin 1 subunit b，豌豆白蛋白1b，又名豌豆胰島素、aglycin)是在豌豆種子中分離鑒定出的一種由37個氨基酸殘基組成的小分子活性肽，在其他豆科植物中有多種同源異構(gòu)體廣泛存在。它們分子內(nèi)均含有3對二硫鍵，形成高度緊湊的空間結(jié)構(gòu)，因而性質(zhì)非常穩(wěn)定，耐殺菌劑變性，也不被胃蛋白酶和胰蛋白酶降解。PA1b具有抗蟲活性，能殺死象鼻蟲、蚜蟲、蚊蟲等害蟲，而對蜜蜂等益蟲無害，有望開發(fā)成新型生物殺蟲劑。PA1b還能改善糖尿病模型鼠的糖脂代謝，具有開發(fā)成口服降糖多肽藥物的潛力。

基于PA1b在農(nóng)業(yè)病蟲害防治和糖尿病藥物開發(fā)中的潛力，大量獲取PA1b蛋白，進行工業(yè)規(guī)模應用或深入研究其作用機制就顯得十分必要。雖然可通過從豆科植物種子中提取純化來制備PA1b，但需避免同源異構(gòu)體混入、操作繁瑣、成本高且產(chǎn)量低下，最理想的還是通過基因工程技術將PA1b在異源系統(tǒng)中進行表達。目前，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中對小片段的基因進行串聯(lián)表達，以提高其蛋白表達量的方法已成功應用于多種小分子肽的原核表達制備，被證實簡便且有效。本研究利用同尾酶法構(gòu)建了多拷貝串聯(lián)基因，置于表達載體pET32a(+)上，在大腸桿菌BL21(DE3)中進行了誘導表達，并用腸激酶對融合標簽和串聯(lián)體進行切割，獲得重組PA1b多肽，為PA1b工業(yè)化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET32a(+)、大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α，由筆者所在實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶(Ⅰ、H Ⅰ和Ⅱ)、TDNA連接酶，購自Thermo Fisher Scientific；小量質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、SanPCR擴增試劑盒、異丙基硫代---半乳糖苷(IPTG)、Bradford蛋白定量試劑、蛋白質(zhì)Marker、Ni-NTA瓊脂糖親和純化樹脂預裝柱、腸激酶(帶His標簽)，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；超濾管、透析袋為Millipore產(chǎn)品；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

PCR儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；超微量分光光度計，美析(中國)儀器有限公司；核酸蛋白檢測儀、核酸電泳儀、垂直電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 PA1b基因合成和載體設計

由圖1可知，將PA1b的氨基酸序列(A S C N G V C S P F E M P P C G S S A C R C I P V G L V V G Y C R H P S G)按照大腸桿菌的密碼子偏好性進行優(yōu)化，轉(zhuǎn)變成DNA序列，同時在5′端添加“HⅠ酶切位點(GGATCC)+腸激酶酶切位點(GACGACGACGACAAG)”，3′端添加“Ⅱ酶切位點(AGATCT)+腸激酶酶切位點(GACGACGACGACAAG)+Ⅰ酶切位點(C T C G A G)”，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成該基因片段并置于pUC57載體上，命名為pUC57-1PA1b。該序列中，HⅠ和Ⅰ酶切位點是為了使用雙酶切將基因片段亞克隆到表達載體pET32a(+)上；HⅠ和Ⅱ酶切位點是為了使用同尾酶法構(gòu)建串聯(lián)重組載體；腸激酶酶切位點是為了在融合蛋白分離純化以后使用腸激酶進行特異性切割，將硫氧還蛋白(Trx A)、6×His等標簽去除，同時也將串聯(lián)的PA1b剪切成單個多肽單元。

1.4 重組表達載體pET32a(+)-nPA1b的構(gòu)建

首先，采用同尾酶法構(gòu)建PA1b串聯(lián)多拷貝重組質(zhì)粒pUC57-(=2，3，4)，方法見圖2，重復該過程，可依次獲得基因串聯(lián)重復2、3、4次的重組質(zhì)粒。分別采用CaCl法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，菌落PCR鑒定陽性克隆的正確性。

其次，將pUC57-載體上的基因片段亞克隆至表達載體pET32a(+)上。方法是將驗證后得到的pUC57-質(zhì)粒(=1，2，3，4)采用HⅠ與Ⅰ雙酶切切下串聯(lián)基因片段，膠回收該片段，與同樣雙酶切純化后的pET32a(+)載體片段按照摩爾濃度比8∶1混合，TDNA連接酶16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物用CaCl法轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)大腸桿菌，從含氨芐青霉素的LB平板上挑取菌落進行培養(yǎng)，小量抽提質(zhì)粒，以pET32a(+)質(zhì)粒上多克隆位點上游的通用引物SoTag primer(G A A C G C C A G C A C A T G G A C A G C)和下游的通用引物T7 terminator primer(G C T A G T T A T T G C T C A G C G G)進行PCR驗證，將陽性轉(zhuǎn)化子送至上海生工生物工程有限公司測序。鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET32a(+)-(=1～4)。

1.5 重組PA1b的誘導表達

挑取含pET32a(+)-的大腸桿菌單菌落，接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，再按100倍稀釋比例轉(zhuǎn)接至新鮮含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至為0.6時，加入1 mmol/L的IPTG，25 ℃下誘導培養(yǎng)8 h。同時，設置1組pET32a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌作為對照組。

1.6 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測

誘導結(jié)束后，4 ℃離心收集菌體，PBS洗滌2次，PBS重懸后冰浴中進行超聲破壁(功率400 W，總時間20 min，工作2 s，間隔6 s)，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清，將沉淀用包涵體溶解液(8 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，0.1% Triton X-100，pH值8.0)溶解。Bradford法測定上清和包涵體溶解液的總蛋白濃度，取25 μg總蛋白上樣，進行12%分離膠的SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色，凝膠成像儀記錄電泳圖譜。分析PA1b融合蛋白的可溶性，采用ImageJ v1.52圖像軟件分析條帶的光密度，計算PA1b蛋白的相對含量。

1.7 PA1b融合蛋白的親和純化

按“1.5”節(jié)和“1.6”節(jié)方法進行誘導表達和菌體破碎，離心收集包涵體，包涵體用柱平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，8 mol/L尿素，pH值8.0)重溶后通過 Ni-NTA 瓊脂糖樹脂柱進行親和層析純化。進樣前，利用2倍柱體積的平衡緩沖液平衡柱子。進樣后，采用5～10倍柱體積的平衡緩沖液清洗柱子，直至流穿液的接近基線。最后采用2～5倍柱體積的洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，8 mol/L尿素，pH值8.0)洗脫帶有6×His標簽的PA1b融合蛋白。透析去除咪唑和尿素，超濾管離心濃縮獲得PA1b融合蛋白。

1.8 融合蛋白的腸激酶酶切和純化

將純化的PA1b融合蛋白置于腸激酶酶切緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，2 mmol/L CaCl，pH值7.6)，按照50 μg融合蛋白加1U腸激酶的用量在16 ℃酶切36 h。酶切后的混合液再次進行Ni-NTA瓊脂糖樹脂親和層析純化，切下的Trx-His標簽和帶有His標簽的腸激酶結(jié)合到鎳柱上，而PA1b多肽存在于流穿液中。收集流穿液，采用截留量10 ku超濾管純化PA1b多肽，PA1b多肽在超濾管離心后的透過液中，進行Tricine SDS-PAGE檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達載體pET32a(+)-nPA1b的構(gòu)建

PA1b由111 bp DNA序列編碼，在基因合成時兩端分別添加了HⅠ和Ⅱ的酶切序列，由圖2可知，采用同尾酶法構(gòu)建了串聯(lián)重復序列載體pUC57-(=2，3，4)，再亞克隆至表達載體pET32a(+)上，構(gòu)建成pET32a(+)-(圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取陽性克隆，采用SoTag和T7 terminator引物進行PCR擴增插入片段，由圖3可知，顯示擴增出的條帶與目標片段預期大小(PA1b單拷貝320 bp，二拷貝452 bp，三拷貝 584 bp，四拷貝716 bp)一致。進而進行DNA測序驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)插入片段的插入位置正確，且序列與理論設計完全一致，說明多拷貝PA1b基因串聯(lián)載體構(gòu)建成功。

2.2 PA1b融合蛋白的誘導表達和可溶性分析

IPTG誘導pET32a(+)-宿主菌表達后，超聲破碎菌體，SDS-PAGE分析破碎組分的上清和沉淀部分，由圖4可知，相對于空載體對照，pET32a(+)-菌體裂解液上清和沉淀部分均明顯多出1個約38 ku條帶，和4拷貝串聯(lián)PA1b融合蛋白理論分子量相符，說明融合蛋白誘導表達成功，且主要表達在包涵體中。

2.3 不同拷貝數(shù)PA1b融合蛋白的SDS-PAGE檢測

采用IPTG分別對含1～4串聯(lián)重復基因pET32a(+)-質(zhì)粒的大腸桿菌進行誘導，SDS-PAGE電泳檢測表達產(chǎn)物，由圖5可知，1～4拷貝數(shù)PA1b融合蛋白的理論分子量分別約為25.2、29.4、33.6、37.8 ku，研究觀察到各融合蛋白分子量與理論分子量相符，說明pET32a(+)-(=1，2，3，4)原核表達載體均能成功誘導表達。采用Image J軟件對各泳道進行光密度分析，由表1可知，發(fā)現(xiàn)各拷貝數(shù)PA1b融合蛋白在包涵體總蛋白中的相對含量有差異，換算成PA1b的相對含量也有差異。理論上，質(zhì)粒中基因拷貝數(shù)越多，與載體質(zhì)量比越大，PA1b在融合蛋白中的含量就越高。根據(jù)圖5中融合蛋白實際表達水平進行換算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pET32a(+)-表達產(chǎn)物中PA1b的相對含量最高(23.3%)，約為單拷貝(5.5%)的4.2倍，因此在后續(xù)的融合蛋白分離純化和酶切試驗中均選用pET32a(+)-菌株作為誘導表達菌。3拷貝和4拷貝串聯(lián)表達產(chǎn)物中PA1b的相對含量幾乎相同，說明蛋白表達量和拷貝數(shù)之間并非線性正相關。

表1 pET32a(+)-nPA1b表達融合蛋白水平及其中PA1b相對含量

2.4 PA1b融合蛋白的純化

將pET32a(+)-的誘導表達產(chǎn)物進行Ni-NTA柱親和層析純化，SDS-PAGE檢測結(jié)果，由圖6可知，發(fā)現(xiàn)分離純化后的4拷貝PA1b融合蛋白具有較高純度(97.8%)。

2.5 PA1b融合蛋白腸激酶酶切

由圖7可知，將純化后的PA1b融合蛋白采用腸激酶酶切，完全酶切后的蛋白混合液經(jīng)過Ni親和層析純化后，流穿液中得到切開的無TrxA標簽、無6×His標簽的單拷貝PA1b多肽，經(jīng)超濾管濃縮去雜后，Tricin-SDS-PAGE檢測分子量約為4.5 ku，與理論預期相符。

3 討論與結(jié)論

大腸桿菌表達系統(tǒng)具有高效、條件易控、成本低等優(yōu)點，是當前應用最廣泛的蛋白表達系統(tǒng)之一。因此，本研究選用大腸桿菌作為PA1b的表達宿主。PA1b是一種小分子量多肽，且富含半胱氨酸，因此在進行原核表達時，要考慮如何提高蛋白表達量、促進分子內(nèi)二硫鍵的正確形成、保持多肽天然折疊構(gòu)象等因素。本研究采用構(gòu)建串聯(lián)多拷貝基因的策略來提升表達量，通過同尾酶法構(gòu)建了插入1～4串聯(lián)拷貝數(shù)PA1b的重組載體，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導表達，SDS-PAGE分析了各融合蛋白的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在“1.5”節(jié)中所述的誘導條件下，PA1b融合蛋白主要存在于包涵體中，且多拷貝數(shù)PA1b的表達量高于單拷貝，4拷貝串聯(lián)PA1b蛋白含量最高，提示串聯(lián)表達是提高產(chǎn)量的有效方法。然而，拷貝數(shù)并非越多越好，最佳拷貝數(shù)仍取決于載體上串聯(lián)肽與融合標簽的相互影響、實驗誘導條件等多種因素。

本研究將串聯(lián)基因插入到具有Trx A、6×His等多個融合標簽的pET32a(+)載體上進行融合表達，Trx A能提供氧化還原動力，促進PA1b分子內(nèi)二硫鍵形成?？紤]到pET32a(+)載體上標簽的去除可采用腸激酶酶切法，所以在構(gòu)建串聯(lián)基因時，在各拷貝間也添加了腸激酶酶切位點。因此，在融合蛋白親和純化后，采用腸激酶酶切，既可去掉TrxA和6×His融合標簽，也能將串聯(lián)的PA1b切割成單體重組PA1b多肽。結(jié)果表明，pET32a(+)-的誘導表達產(chǎn)物經(jīng)過親和純化后可獲得高純度的4拷貝PA1b融合蛋白，再經(jīng)腸激酶酶切、親和層析去雜、超濾濃縮后獲得了不帶TrxA標簽的重組PA1b多肽。它比天然PA1b的C末端多了7個氨基酸殘基：Arg-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，這是否會對PA1b的活性造成影響，有待后續(xù)研究。

在PA1b的原核表達方面，國內(nèi)外也有報道。2003年，Hanada等在BL21大腸桿菌中導入leginsulin(PA1b在黃豆中的同源異構(gòu)體，同源性約64%)基因，表達出帶有Trx標簽的leginsulin。2004年，杜雯等將PA1b與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)構(gòu)建成融合基因在大腸桿菌DH5α中進行了周質(zhì)空間可溶性表達，然而融合蛋白的結(jié)構(gòu)過于龐雜而無PA1b活性，表達量太低，及MBP標簽去除需經(jīng)Factor Xa酶切成本高，因而并無后續(xù)。最近，黃敏華等利用內(nèi)含肽與自組裝肽與Aglycin(PA1b別名)連接，在大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達，得到目標蛋白聚集體，再通過內(nèi)含肽介導的N端自剪切，去掉了融合標簽，制備無標簽的Aglycin多肽。

綜上，本研究采用串聯(lián)表達的方案在大腸桿菌表達系統(tǒng)中制備了豆類活性肽PA1b的4拷貝融合蛋白，有效提高了PA1b表達量。經(jīng)腸激酶切割后，得到了無標簽的單拷貝PA1b重組多肽，為多拷貝法制備PA1b肽奠定了基礎。