副溶血性弧菌外膜蛋白BamA重組表達及其免疫原性分析

劉建欣，劉 蕾，郭珊珊，袁倩云，王文彬

(1.江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港 222005；3.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇連云港 222005)

弧菌是革蘭氏陰性嗜鹽菌，在海洋環(huán)境中分布廣泛，是海產(chǎn)品中常見的食源性致病菌。食用致病性弧菌污染的食物通常會引起急性腸胃炎，重癥患者則表現(xiàn)為脫水、休克昏迷甚至死亡。最常見的致病性弧菌包括副溶血性弧菌()、創(chuàng)傷弧菌()和霍亂弧菌()，其中創(chuàng)傷性弧菌對魚類的致死率較高，副溶血性弧菌在海鮮中具有更高的流行率。此外，弧菌病是一種重要的海洋水產(chǎn)動物病害，已發(fā)現(xiàn)了50多種易感的水產(chǎn)動物，危害了海洋水產(chǎn)健康養(yǎng)殖，構成了重要的經(jīng)濟威脅。

弧菌診斷特異性抗原是建立準確、快速弧菌免疫檢測手段的基礎，也有助于弧菌病害的防控。外膜蛋白(outer membrane protein，簡稱Omp)因其基本功能、表面暴露性和在菌株中的保守性，常被用于疫苗的候選抗原。目前，已證實的弧菌屬保守性和特異性較好的外膜蛋白較少，仍然需要新的弧菌屬外膜蛋白。倫鏡盛等分別重組表達了5種弧菌的外膜蛋白U(OmpU)，來自副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬態(tài)弧菌()的OmpU的小鼠免疫血清與13種弧菌發(fā)生交叉反應，與菌屬外不發(fā)生免疫交叉反應，表明OmpU是弧菌保守的候選免疫抗原。副溶血性弧菌外膜蛋白VP1243在弧菌中廣泛分布，具有高度保守性，誘導了對副溶血弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌的交叉免疫反應和免疫保護，是預防弧菌感染的多功能疫苗候選蛋白。Li等用同源和異源細菌免疫小鼠，采用免疫蛋白組學確定了弧菌外膜蛋白的多價疫苗候選物，發(fā)現(xiàn)了30～40種弧菌外膜蛋白。其中，重組外膜蛋白A(OmpA)和肽聚糖相關脂蛋白(Pal)對溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌均有免疫保護作用。

BamA作為跨膜桶狀蛋白具有較好的表面暴露性，是β-桶狀組裝系統(tǒng)(BAM)家族的核心成分，目前在所有已測序的革蘭氏陰性菌中均有發(fā)現(xiàn)。前期我們建立了生物信息學方法對副溶血性弧菌4 831個編碼蛋白進行篩選，獲得了101個位于外膜的蛋白，并通過表面蛋白質(zhì)組檢驗篩選結果，2種方法均表明BamA是外膜蛋白，且該蛋白在弧菌屬中具有廣泛保守性，具有作為弧菌免疫檢測抗原的潛力。目前，關于弧菌BamA的重組表達及免疫原性的研究未見報道，其作為診斷抗原和疫苗抗原的價值仍不清楚。因此，本研究進一步對BamA的保守性和基本結構進行分析，并通過生物信息學方法篩選特異性多肽，采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)和免疫印跡評價其免疫BALB/c小鼠后血清與7株副溶血性弧菌、9種常見弧菌、發(fā)光桿菌等海洋細菌及其他常見細菌的交叉反應。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

本研究所用的菌株詳見表1，于2019年4月在江蘇海洋大學實驗室中培養(yǎng)。原核表達載體pET-28a(+)為筆者所在實驗室保存。副溶血性弧菌(CICC21617)用含3%NaCl的LB培養(yǎng)基(1.0%胰蛋白，0.5%酵母提取物，3.0% NaCl)在37 ℃條件下過夜培養(yǎng)。大腸桿菌DH5α和大腸桿菌BL21作為工程菌株，培養(yǎng)條件為LB培養(yǎng)基(1.0%胰蛋白，0.5%酵母提取物，1.0% NaCl)37 ℃過夜培養(yǎng)，用于重組質(zhì)粒構建和蛋白質(zhì)表達。將pET-28a(+)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 本研究所用菌株

1.2 主要試劑及儀器

限制性內(nèi)切酶HⅠ和Ⅰ，均購自寶生物工程(大連)有限公司；弗氏完全和不完全佐劑、牛血清蛋白BSA，均購自Sigma公司；沉淀型四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物緩沖液，購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、卡那霉素、異丙基--硫代半乳糖苷(IPTG)、DNA Marker、雙色預染蛋白Marker、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)所需試劑，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；羊抗鼠二抗，購自Jackson ImmunoResearch公司；4--(馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)和二甲基甲酰胺(DMF)，購自Jackson ImmunoResearch Laboratories公司；其他化學試劑均購自上海國藥集團化學試劑有限公司；96孔酶標板，購自無錫國盛生物工程股份有限公司；透析袋(截留相對分子質(zhì)量為14 000)，購自上海橋星貿(mào)易有限公司；酶標儀為Infinite F50；半干式轉(zhuǎn)膜儀型號為AmershamTE 70。

1.3 副溶血性弧菌BamA蛋白拓撲結構分析及多肽的篩選

副溶血性弧菌的外膜蛋白BamA的氨基酸序列(GI：28899084)從美國國家生物技術信息中心的蛋白數(shù)據(jù)庫(NCBI)中獲得，并采用搜索比對工具BLAST分析其與其他弧菌屬弧菌序列的同源性水平。為了直觀分析BamA蛋白在弧菌屬及革蘭氏陰性菌株蛋白之間的關系，用ClustalX分析蛋白質(zhì)序列的多重比對，并使用MEGA 7.0中的鄰接(neighbor-joining，簡稱NJ)法構建系統(tǒng)進化樹。設置了10 000次重復的Bootstrap測試，以檢查分支拓撲的有效性。BamA蛋白質(zhì)三維結構使用SWISS-MODEL同源建模法在線生物信息學軟件進行模擬，將候選蛋白質(zhì)的序列輸入至序列框中，SWISS-MODEL同源建模法可自動找到與目標序列同源的已知結構作為模板，為目標序列與模板序列創(chuàng)建序列比對，根據(jù)序列比對，用同源建模軟件預測結構模型，評估模型質(zhì)量。模擬結構同時通過I-TASSER和TrRosetta進行了驗證。利用Pymol軟件分析最佳蛋白模型的結構。結合SnapGene和Proten軟件對副溶血性弧菌外膜蛋白BamA的保守區(qū)域進行分析，篩選出保守且對弧菌屬物種具有特異性的多肽序列。利用Pymol軟件分析蛋白結構，將在弧菌屬中具高保守性的多肽定位到蛋白結構，找到其中的暴露性表位氨基酸序列。

1.4 BamA重組質(zhì)粒的構建和表達

利用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，簡稱CTAB)法提取DNA，副溶血性弧菌外膜蛋白BamA基因(登錄號為BA000031.2和BA000032.2)，通過PCR進行擴增。上游引物：5′-C A C G G A T C C A T G G C G A T T A A G C G A A T T C T-3′，下游引物：5′-C C G C T C G A G G A A A G T T C T A C C G A T A G T G A A T-3′。PCR程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，目的基因和pET-28a(+)質(zhì)粒均用HⅠ和Ⅰ進行雙酶切，并用TDNA連接酶進行連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，用含有50 μg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板，選擇5個單菌落進行PCR擴增目的基因，并通過測序驗證。將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，并保存在加入15%甘油的LB培養(yǎng)基中，-80 ℃ 凍存。

用含有卡那霉素(50 μg/mL)抗性的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)陽性重組菌株，以1∶100(體積比)加入到LB培養(yǎng)液中，在37 ℃搖床中孵育至為0.5～0.8時，加入誘導劑IPTG。通過單因素試驗優(yōu)化培養(yǎng)溫度、IPTG濃度(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L)和IPTG誘導時間。最終培養(yǎng)條件為誘導時間16 h，溫度16 ℃，誘導劑濃度0.4 mmol/L。4 ℃，5 000 r/min 離心 30 min 收集菌體，用含有2 mol/L尿素和1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，在冰浴中260 W超聲破碎 30 min，超聲開3 s，超聲關7 s。4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，收集上清液和沉淀，然后將沉淀溶于含有8 mol/L尿素的50 mmol/L PBS緩沖液(pH 值為8.0)中。通過10% SDS-PAGE分離膠，用5%濃縮膠研究目標蛋白的表達形式(可溶性表達或包涵體)。

將8 mol/L尿素溶解后的溶液12 000、4 ℃離心10 min，取上清液。將上清液通過裝有鎳離子親和層析柱(Ni-NTA)進行純化，通過優(yōu)化含咪唑的尿素緩沖液梯度純化蛋白，并采用200 mmol/L咪唑洗脫，得到單一條帶。純化后的BamA蛋白，濃度稀釋到0.5 mg/mL，裝入透析袋(截斷分子量為 14 000)中，低溫梯度透析，用磁力攪拌器低速攪拌，透析緩沖液(0.05 mol/L PBS，8 mol/L尿素)濃度從8 mol/L尿素梯度降低至不含尿素的0.01 mol/L PBS緩沖液。蛋白濃度通過Bradford方法確定。蛋白質(zhì)的表達和純化通過10% SDS-PAGE分離膠進行驗證，并通過考馬斯亮藍R-250染色顯示蛋白質(zhì)條帶，制備的重組BamA蛋白在-80 ℃保存，待用。

1.5 多肽偶聯(lián)

采用Sulfo-SMCC作為偶聯(lián)劑，在0.1 mol/L PBS緩沖液中，7 mg 載體蛋白BSA與2.3 mg Sulfo-SMCC 偶聯(lián)，將反應的溶液移至10 ku超濾管中，反復超濾3次以去除多余的Sulfo-SMCC。稱取7 mg多肽于BSA-SMCC體系中，室溫磁力攪拌12 h，將偶聯(lián)完成的溶液裝入透析袋，并通過蛋白電泳表征。

1.6 動物免疫

6～8周齡的雄性BALB/c小鼠購自揚州大學獸醫(yī)學院。將純化的BamA可溶蛋白與弗氏完全佐劑等體積乳化后免疫小鼠。小鼠第1次免疫使用的乳化劑為弗氏完全佐劑，之后的加強免疫使用的乳化劑為弗氏不完全佐劑。共免疫4次，首次和第2次免疫劑量為80 μg/只，第3、第4次免疫劑量減半。免疫間隔時間為3周，免疫方式為小鼠背部皮下多點注射。第3、第4次免疫后1周小鼠尾部采血，獲得血清并于-20 ℃ 保存。

1.7 間接ELISA和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測定血清效價及交叉反應

表1中的菌株過夜培養(yǎng)并計數(shù)后，在100 ℃煮沸15 min滅活并冷卻至室溫。用碳酸鹽緩沖液(pH值為9.6)將菌體濃度稀釋到10CFU/mL，每孔 100 μL 加入到96孔酶標板中，37 ℃包被2 h；用含0.05%吐溫-20的磷酸緩沖液(PBST)洗滌3次后，每孔加200 μL含0.2%明膠的碳酸鹽緩沖液封閉酶標板，37 ℃封閉 2 h；小鼠血清用抗體稀釋液(PBS緩沖液，0.1%明膠，0.05% Tween-20)稀釋500倍，并以3倍梯度稀釋6個梯度，并用稀釋液作陰性對照，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；用PBST洗板3次；加入用抗稀稀釋4 000倍的辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG(0.5 μg/mL)，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；用PBST洗板4次；加入100 μL顯色液，37 ℃孵育10～15 min；50 μL 2 mol/L硫酸溶液終止反應，用酶標儀測定450 nm處吸光度。當最高稀釋度的陽性血清的與空白對照的之比(P/N)≥2.1時，該稀釋度即為血清效價。

免疫印跡方法參考文獻[15-16]。簡要步驟為將過夜培養(yǎng)的50 mL菌液離心，棄上清，用15 mL PBS緩沖液將沉淀重懸；采用“1.2.4”節(jié)中的方法冰浴破碎；離心取上清，將細菌蛋白上樣10 μL至SDS-PAGE電泳儀，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%；電泳完成后用半干轉(zhuǎn)膜儀TE 70將蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，電流為 30 mA，轉(zhuǎn)膜 30 min；用50 mL含5%脫脂奶粉的(PBS緩沖液)封閉PVDF膜上的多余位點，37 ℃輕輕振蕩2 h；加入20 mL血清稀釋液(稀釋1 000倍數(shù))，室溫孵育1 h；用PBST洗滌3次，每次在搖床輕輕振蕩5 min，加入20 mL抗稀稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG(0.5 μg/mL)，室溫避光孵育1 h；洗滌5次，TMB顯色劑顯色5～10 min，有清晰條帶出現(xiàn)后洗滌拍照。

2 結果與分析

2.1 BamA蛋白保守性及多肽分析

BamA是外膜蛋白組裝復合體的一部分，它參與β-桶蛋白的組裝及其插入外膜。BamA是Omp85超級家族的成員，Omp85超級家族是一組16鏈β-桶狀蛋白，參與細菌和細胞器中的膜蛋白插入和蛋白分泌反應。圖1-a為大腸桿菌BamA蛋白的結構圖(PDB：5D0O)，圖1-b是以大腸桿菌K12的BamA為模板模擬的副溶血性弧菌BamA蛋白的結構圖，從圖中可知BamA蛋白結構具有β-桶狀結構，具有細胞外的無規(guī)則卷曲環(huán)區(qū)(由上至下第1條虛線的上方為膜外部分)，說明蛋白具有一定的暴露性。為了進一步了解BamA的保守性，選取了具有代表性的弧菌屬蛋白序列與副溶血性弧菌BamA蛋白序列進行比對。同源性分析結果表明，BamA蛋白在所有弧菌中廣泛分布，較保守，序列一致性在83%以上，與其他革蘭氏陰性細菌的蛋白序列相似性較低，最高相似度在50%以下，說明BamA蛋白屬內(nèi)保守性較高，具有一定的特異性。

通過NCBI中BLAST與副溶血性弧菌BamA蛋白序列進行比對，結合SnapGene軟件進行分析(圖2)，最終選取出相似性在80%以上的連續(xù)氨基酸序列。利用Pymol軟件，將找出的氨基酸序列在模擬蛋白結構中標記出來，得到4條保守性較高且位于膜外的表位氨基酸，分別為BamA-1(P1)Y Y Y D Y S D P T N Y R S S、BamA-3(P2)N G Y G Q T D G N D N L F、BamA-4(P3)VYRDYSGSN、BamA-5(P4)QADNIDSSGALNT，位置見圖1-b，這些序列都是 8～13 aa的短肽，分子量為1 163～1 896 u，這些表位具有較高的保守性及較好的暴露性，使得BamA蛋白具有潛在的檢測價值及疫苗價值。

2.2 副溶血性弧菌BamA蛋白的表達及多肽偶聯(lián)

采用CTAB法從副溶血性弧菌(CICC 21617)中提取DNA，并以此為模板擴增出分子量為2 000～3 000 bp 的基因片段(圖3-a)，與BamA基因片段長度(2 415 bp)一致。將其插入pET-28a(+)中，構建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙向測序后與BamA符合度為100%，確認構建成功。

采用不同濃度IPTG及誘導時間誘導BamA蛋白表達，培養(yǎng)溫度為16 ℃，將超聲破碎后的上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE分析。結果如圖3-b所示，在70～100 ku出現(xiàn)過表達的蛋白條帶，重組質(zhì)粒帶有6個組氨酸標簽，BamA理論分子量為89 ku，表達的蛋白位置與理論值較為吻合。IPTG濃度為 0.4 mmol/L、誘導時間為6 h時，可溶性蛋白表達量較高，但后期純化時回收率較低，蛋白BamA最終以包涵體形式制備，誘導條件為16 ℃培養(yǎng)，IPTG濃度為 0.4 mmol/L，誘導時間為16 h。

為了將多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成完全抗原，所有多肽的N端均用半胱氨酸修飾。通過SDS-PAGE表征偶聯(lián)情況，如圖4-a所示，BSA蛋白條帶在與Sulfo-SMCC連接后移至更高的位置(泳道2)，與多肽反應后蛋白條帶進一步上移，說明分子量進一步增加(泳道3至泳道6)，多肽偶聯(lián)成功。

采用Ni-NTA親和層析柱純化包涵體蛋白，對柱子的洗脫采用濃度為8 mol/L的尿素緩沖液，其所含咪唑濃度分別是5、10、200、300 mmol/L。如圖4-b所示，在咪唑濃度為200 mmol/L時可以在90 ku左右得到清晰的單一蛋白條帶?？扇苄缘鞍着c包涵體蛋白相比具有正確的折疊結構，存在著較好的功能性。因此，對BamA包涵體蛋白進行純化和尿素梯度透析復性，透析復性設置的尿素濃度梯度分別為8.0、6.0、4.0、3.0、2.0、1.5、1.0、0.5 mol/L，隨后又進行了0.05 mol/L PBS和 0.01 mol/L PBS的透析，透析袋中無可見沉淀，提示復性成功。

2.3 免疫血清評價

蛋白抗原在第3次免疫后，用間接ELISA方法檢測小鼠血清對免疫抗原的效價，結果見圖5?？v軸表示450 nm處吸光度，橫軸表示測試菌株，血清稀釋500倍。BamA免疫血清對BamA重組蛋白的平均吸光度為2.121，與副溶血性弧菌CICC10552等包板時的平均吸光度為0.428，與哈維氏弧菌等弧菌屬包板的平均吸光度為0.345；對美人魚發(fā)光桿菌等弧菌屬外細菌的平均吸光度為0.155。BamA蛋白免疫血清對弧菌及其他細菌菌體效價大多僅為0.5 K，而對BamA重組蛋白的效價高達121.5 K。說明免疫過程誘導產(chǎn)生了BamA重組蛋白的抗體，但血清與菌體的識別性較弱。BamA蛋白多肽P1、P2、P3、P4免疫血清對BamA重組蛋白的平均吸光度為2.058、0.625、1.222、1.184，與副溶血性弧菌包板的平均吸光度分別為0.344、0.478、0.243、0.278，對哈維氏弧菌等弧菌屬包板的平均吸光度分別為0.302、0.361、0.213、0.232，對美人魚發(fā)光桿菌等弧菌屬外包板平均吸光度為0.173，結果表明免疫血清與菌屬外幾乎無交叉反應。BamA多肽免疫血清對BamA蛋白的效價為13.5 K，而對弧菌及其他細菌菌體的效價大多為 0.5 K，表明選取的多肽位于BamA蛋白表面，受空間結構影響并不大，但免疫血清與菌體的識別性同樣較弱。

為驗證血清的結合蛋白和交叉反應，采用免疫印跡進行進一步分析。由圖6可知，BamA蛋白血清與7株副溶血性弧菌以及9株其他弧菌的全菌蛋白在70～100 ku出現(xiàn)顯色條帶，其中對副溶血性弧菌CICC 21618及非O1型霍亂弧菌反應較弱，識別位置與副溶血性弧菌外膜蛋白BamA(89 ku)分子量大小一致，對弧菌屬外的全菌蛋白多數(shù)不反應，只對霍氏格里蒙特氏菌有反應，但在全菌ELISA中未觀察到與霍氏格里蒙特氏菌有交叉反應的。免疫印跡結果說明BamA重組蛋白免疫血清能與大部分弧菌的BamA蛋白產(chǎn)生特異性反應，BamA蛋白在弧菌屬具有較高的保守性和特異性。

3 討論與結論

弧菌是一種水產(chǎn)動物和人類共患的條件致病菌，其引起的細菌性病害給我國南美白對蝦、海產(chǎn)魚類等水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失。細菌外膜蛋白的序列部分暴露于細胞外環(huán)境，這些膜外多肽結構不僅使外膜蛋白質(zhì)具有基本的生理或病理功能，也可以誘導特定的免疫反應。

外膜蛋白是否可用作潛在的檢測抗原和疫苗抗原應考慮多種因素，包括表面暴露、菌株間的保守性和誘導免疫反應的能力。β-桶狀外膜蛋白通常是跨膜或是嵌入細胞膜內(nèi)，在細胞質(zhì)中合成后，通過分泌系統(tǒng)運輸?shù)郊毎ど系摩?桶狀組裝系統(tǒng)(BAM)上，并完成組裝和在細胞膜上的定位。在革蘭氏陰性細菌中，BAM復合物參與細胞外膜蛋白運送和安裝過程，負責將合成的外膜蛋白插入并折疊到細菌胞膜。BAM家族蛋白具有較好的保守性，其中BamA是該系統(tǒng)的核心并且在細胞外膜具有較好的暴露性，其他BamB、BamC、BamD均位于細胞外膜的膜內(nèi)，BamA由嵌入外膜的C末端β-桶和周質(zhì)N末端區(qū)域組成，該區(qū)域包含多個與轉(zhuǎn)運相關的表位。對副溶血性弧菌BamA蛋白進行基于弧菌菌株之間的保守性分析結果表明該蛋白具有較高保守性，與常見弧菌序列一致性達到83%，與屬外常見菌序列一致性低于50%。

通過小鼠模型研究了弧菌副溶血性弧菌BamA重組蛋白及多肽抗原的免疫原性。BamA重組蛋白經(jīng)純化獲得包涵體蛋白并成功復性，制備的BamA重組蛋白與天然蛋白具有更為接近的結構。免疫血清測試結果表明，BamA重組蛋白的抗體可與常見弧菌及其全菌蛋白發(fā)生特異性反應。免疫印跡中，重組BamA蛋白和弧菌超聲破碎裂解物出現(xiàn)的目的條帶位置相同，說明菌體與血清的抗原結合位點也為BamA蛋白。免疫血清與7種副溶血性弧菌和9種測試弧菌全菌蛋白發(fā)生不同程度的特異性結合，而與美人魚發(fā)光桿菌、費氏另類弧菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、無丙二酸檸檬酸桿菌沒有交叉反應，僅與霍氏格里蒙特氏菌出現(xiàn)特異性反應條帶。霍氏格里蒙特氏菌是弧菌科中的一種致病菌，2003年前分類屬于弧菌屬，名為霍利斯弧菌()，可引起人類腸胃炎。因此，與該菌蛋白的反應主要由于較近的親緣關系。值得一提的是，本試驗采用的弧菌屬菌株較為廣泛，且具有代表性，包含了對人類具有致病性的霍亂弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌，及對水生物具有致病性的鰻弧菌和哈維氏弧菌。

ELISA和免疫印跡的結果表明，BamA蛋白和多肽免疫血清對BamA蛋白具有較強的結合，但與不同副溶血性弧菌菌體的結合均較弱。免疫印跡是菌體破碎后的蛋白與免疫血清直接反應，而ELISA則是用菌體包板，ELISA中菌體與外膜蛋白BamA免疫血清結合較差提示抗原抗體的結合可能受到了菌體表面其他抗原的影響。革蘭氏陰性菌表面存在有莢膜和脂多糖(LPS)等抗原，其中莢膜是副溶血性弧菌等弧菌主要的表面抗原，細菌莢膜長度為0.2～0.5 μm，可以掩蓋抗體與菌體外膜蛋白的結合，抵抗宿主免疫系統(tǒng)的殺傷。Vij等研究發(fā)現(xiàn)，采用菌體免疫結合重組BamA蛋白加強免疫的方法制備了81個大腸桿菌BamA單克隆抗體，其中7個抗體可以對大腸桿菌K12(缺失核心多糖)和LPS核心多糖突變株(ΔwaaD)有90%以上的抑制生長率，證明了BamA為大腸桿菌的外膜蛋白并具有中和性抗原表位，但正常大腸桿菌完整的LPS結構限制了抗體與BamA的接觸而不被BamA抗體識別。后續(xù)研究可通過設計突變菌株研究免疫血清與副溶血性弧菌的結合，驗證是否存在莢膜、脂多糖等表面抗原的影響。這也提示篩選外膜蛋白作為診斷抗原和疫苗抗原，除了應位于外膜，具有一定保守性、特異性，還應該考慮其在其他抗原影響下的表面暴露性。

綜上，本研究首次報道了副溶血性弧菌外膜蛋白BamA重組質(zhì)粒的構建、重組蛋白的表達純化、多肽的篩選和偶聯(lián)，以及BamA抗原在小鼠中的免疫原性。ELISA和免疫印跡的結果表明，免疫血清與弧菌屬菌體蛋白存在交叉反應，與遲緩愛德華氏菌等弧菌屬外細菌蛋白無交叉反應，血清與弧菌菌體的結合效價較低，可能與弧菌表面莢膜等其他表面抗原的影響有關。該研究證明了弧菌BamA具有弧菌屬保守性和良好的特異性，但表面可暴露性可能較為有限，這為后續(xù)驗證研究指明了方向，也為弧菌屬免疫檢測抗原和疫苗抗原開發(fā)提供了新的影響因素和研究思路。