在線固相萃取UHPLC-MS/MS法測定水中15種抗生素

吳 斌，蘇宇亮，胡克武，郝怡菲，袁漢鴻，吳 杰

(珠海水務(wù)環(huán)境控股集團有限公司，廣東珠海 519020)

近年來，抗生素在水源水中的頻繁檢出及其對飲用水生物安全的潛在風(fēng)險備受關(guān)注?？股?antibiotics)指由細菌、霉菌或其他微生物在生活過程中所產(chǎn)生，具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾或抑制致病微生物的生存，廣泛地應(yīng)用于人類及動物的疾病防治、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域。抗生素的大量使用必然會導(dǎo)致過多的殘留物進入到環(huán)境中，目前抗生素產(chǎn)生的環(huán)境危害愈發(fā)突出。因此，抗生素的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)日益受到廣大環(huán)境領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注[1-2]。研究指出，中國地表水環(huán)境中能檢測到6類共68種抗生素[3]。很多國家和地區(qū)如美國、法國、日本[4-6]，以及國內(nèi)的珠江水系、北京的清河水等都有抗生素檢出[7-8]。

抗生素污染對飲用水水源安全造成了嚴重的威脅，在飲用水處理工藝中對抗生素的去除研究越來越受關(guān)注。張靜等[9]從水廠常規(guī)處理工藝、深度處理工藝兩部分介紹近幾年國內(nèi)外水廠處理含抗生素原水的方法及效果，此外，還從活性炭池中微生物的抗藥性與耐氯性、消毒副產(chǎn)物以及給水管網(wǎng)3方面來論述處理含抗生素水體對給水廠的影響。結(jié)果表明，在傳統(tǒng)工藝中，混凝沉淀是去除抗生素的主要工藝，對喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類抗生素去除率可達到50%～60%，且可通過調(diào)節(jié)混凝劑投加量、添加助凝劑PAM等方式增強混凝效果；紫外與氯消毒聯(lián)合使用時對易光解抗生素的去除效率可達到30%～50%。臭氧氧化和活性炭池等深度處理工藝亦會促進抗生素的去除，但受臭氧投加量、接觸時間等因素影響顯著，且抗生素會增強炭濾池和管網(wǎng)中微生物的抗藥性及耐氯性；在采用NaClO作為消毒劑時可能會促進毒性較高的氯代/溴代消毒副產(chǎn)物生成。此外，殘留抗生素會消耗管網(wǎng)中的余氯，還會促進機會病原體的出現(xiàn)，增加飲用水安全風(fēng)險[9]。張國芳[10]對比分析了新型處理技術(shù)對抗性基因的去除現(xiàn)狀，研究總結(jié)出超濾膜技術(shù)對病原體的去除率高達90%～100%，多用于取代傳統(tǒng)的去除工藝，缺點是不能完全去除游離的抗生素抗性基因(ARGs)，且膜結(jié)垢和更換需要的成本較高。光(UV、日光)催化技術(shù)對抗生素抗性菌(ARB)和ARGs在較短時間內(nèi)的去除效率也較高，可降低ARB的抗生素耐受性，缺點是會引入新的污染物，如較難去除的納米材料等。聯(lián)合技術(shù)可有效滅活A(yù)RB和去除ARGs，可完全去除ARGs，有效控制水平基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險，缺點是需較高的消毒劑投加量，UV燈管的更換帶來高額成本。

抗生素濫用會帶來極大的危害[11]，且水中目標化合物濃度通常為痕量級，因此，迫切要求開發(fā)一種快速準確的抗生素檢測技術(shù)來監(jiān)測環(huán)境水中的抗生素含量。水中抗生素的傳統(tǒng)檢測方式是微生物法[12]，而目前測定抗生素常用的方法主要有液相色譜法[13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]。液相色譜法測定易受雜質(zhì)干擾，靈敏度低；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高效分離、靈敏度高、檢測快速、定性與定量檢測于一體等優(yōu)點，已成為近年來痕量殘留檢測技術(shù)的主流方向。由于抗生素在地表水中的含量為痕量級別，富集方法也尤為重要，但是一般文獻中水樣富集使用的固相萃取技術(shù)操作比較復(fù)雜，需要使用獨立的固相萃取儀，萃取后再轉(zhuǎn)移至液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測[16-17]，這種固相萃取具有耗時長、操作復(fù)雜、溶劑浪費等缺點。本研究使用在線固相萃取技術(shù)，自動進樣器取5 mL水樣在線固相萃取、凈化、洗脫后直接進入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，無需二次轉(zhuǎn)移，具有操作簡便、回收率高、分析時間短、節(jié)約溶劑的優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；甲酸：質(zhì)譜純；脫溶劑氣：高純氮(99.999%)；碰撞氣：高純氬(99.999%)。

抗生素標準品：6類15種抗生素標準樣購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度要求大于97%。分別為磺胺類(磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪)、大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、羅紅霉素)、四環(huán)素類(四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素)、β-內(nèi)酰胺類(青霉素 G)、喹諾酮類(氧氟沙星、恩諾沙星)、氯霉素類(氯霉素)。

1.1.2 儀器

液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(Waters公司Xevo TQ-S Micro)。離子源：電噴霧離子源(ESI)；色譜柱：ACQUITY HSS T3柱，2.1 mm×50 mm，顆粒粒徑為1.8 μm；針式過濾器：聚偏氟乙烯(PVDF)，孔徑為0.22 μm。

1.2 液相色譜條件

色譜流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈/甲醇=90/10；柱溫為35 ℃；進樣體積為5 mL。色譜流動相梯度設(shè)置如表1所示。

表1 色譜流動相梯度設(shè)置Tab.1 Gradient Setting for Chromatographic Flow Phase

1.3 質(zhì)譜條件

電離源：電噴霧正離子模式；毛細管電壓：1.5 kV；源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：550 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h。采用質(zhì)譜多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，質(zhì)譜質(zhì)量條件參數(shù)如表2所示。

表2 抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Mass Spectrum Parameters for Antibiotics

1.4 標準系列的配制

標準儲備溶液：分別稱取每種待測組分標準品約0.010 0 g(精確至0.000 1 g)，用甲醇溶液定容至10 mL棕色容量瓶中，此標準溶液質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL，置于-18 ℃冰箱避光保存。分別吸取15種抗生素的標準儲備液100 μL，用甲醇定容至100 mL容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標準儲備液。吸取1 μg/mL的混合標準儲備液100 μL，用甲醇定容至10 mL容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/L的混合標準工作液，在4 ℃冰箱中保存。

分別取10 μg/L的混合標準工作液25、50、100、250、500、1 000 μL，加純水20 mL后加甲酸50 μL調(diào)節(jié)pH，再用純水定容到50 mL的容量瓶，得到15種抗生素質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200 ng/L的標準系列。

1.5 樣品處理

1.5.1 樣品采集

用清洗干凈并干燥的棕色玻璃瓶或聚四氟乙烯(全氟丙烯)瓶采集水樣。采集時應(yīng)注滿容器，上部不留空間。樣品在4 ℃避光冷藏保存，12 h內(nèi)測定。

1.5.2 樣品前處理

用玻璃注射器抽取水樣，經(jīng)PVDF濾膜過濾，用甲酸調(diào)節(jié)pH值為2～3。

1.5.3 在線固相萃取

利用在線固相萃取HLB小柱富集前處理后的樣品，在線固相萃取流動相A為2% NH4OH溶液；流動相B為0.5%甲酸溶液；流動相C為乙腈/甲醇=90/10；流動相D為甲醇/乙腈/丙酮=1/1/1。在線固相萃取流動相梯度設(shè)置如表3所示。

表3 在線固相萃取流動相梯度設(shè)置Tab.3 Gradient Setting for Online Solid-Phase Extraction Flow Phase

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品測定及結(jié)果

將預(yù)處理后的樣品采用在線固相萃取，進樣量為5 mL，按照儀器分析條件進行測定，質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式采集。進樣質(zhì)量濃度為50 ng/L時的色譜圖檢測結(jié)果圖1所示。

圖1 15種抗生素(50 ng/L)100%歸一化色譜圖Fig.1 100% Normalized Standard Ion Chromatogram of 15 Antibiotics (50 ng/L)

2.2 標準曲線和檢測限

取6個20 mL進樣瓶分別取1.4小節(jié)中的標準系列，然后在線固相萃取后進樣測定，以色譜峰面積進行定量，得到該檢測方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限(以3倍信噪比計算)等參數(shù)(表4)。

表4 檢測標準曲線和檢測限Tab.4 Detection Standard Curve and Detection Limit

2.3 精密度、實際水樣和水樣加標回收率的檢測

以某地區(qū)出廠水、管網(wǎng)水、地表水為實際水樣，50 ng/L的抗生素混標進行加標回收分析，測定該方法的精密度和加標回收率(重復(fù)7次)，結(jié)果如表5所示。

表5 實際水樣加標回收率和相對標準偏差(n=7)Tab.5 Recovery Rate and Relative Standard Deviation of Real Samples (n=7)

2.4 實際水樣檢測

對某地區(qū)的出廠水、管網(wǎng)水、地表水進行檢測。飲用水中檢出金霉素、磺胺二甲嘧啶、強力霉素、四環(huán)素，質(zhì)量濃度為0.94～2.49 ng/L，對人群健康基本沒有風(fēng)險；地表水中檢測出磺胺類(磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪)、四環(huán)素類(強力霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素)及紅霉素，質(zhì)量濃度為2～27 ng/L，其中河水中檢測抗生素的情況顯著多于水庫。

3 結(jié)論

(1)本文采用在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對水中15種抗生素進行痕量分析，15種抗生素在5～200 ng/L或5～50 ng/L時具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.990 0，方法的檢出限(3倍信噪比)為0.74～3.28 ng/L，加標回收率在49.6%～130.2%。

(2)該方法具有操作簡便、靈敏度高、回收率高、分析時間短、節(jié)約溶劑等特點，能夠滿足水中抗生素的監(jiān)測需要。

(3)本研究采集南方某地區(qū)生活飲用水及水源水進行了15種抗生素的檢測，發(fā)現(xiàn)抗生素偶有檢出但含量極低，對人群健康基本沒有風(fēng)險。