微納米氣泡對(duì)池塘微生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用

鄭 晉，王亞迪，周潤(rùn)龍，李雪玲，呂軍鴻，胡 鈞

(1.中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所，上海 201800；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049;3.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東煙臺(tái) 264003；4.納米技術(shù)及應(yīng)用國(guó)家工程研究中心，上海 201318；5.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院，上海 201203)

近年來(lái)微納米氣泡被應(yīng)用在水體消毒、有機(jī)污染物降解和固體表面凈化等多個(gè)領(lǐng)域[1-2]。微納米氣泡處理水體后具有副產(chǎn)物更少、安全性更高等特性，因此，在污水處理方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[3]。微納米氣泡的水體凈化能力通常是因?yàn)樽陨肀罎a(chǎn)生自由基或者是增加氣體傳輸[3-5]，但其作用機(jī)制尚未完全清楚。

微生物在水生生態(tài)系統(tǒng)的化學(xué)循環(huán)中起著重要的作用，它可以分解并轉(zhuǎn)化水體中的有機(jī)物或無(wú)機(jī)物[6]。此外，隨著水質(zhì)的變動(dòng)和環(huán)境的影響，微生物群落的結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生顯著變化[7]。因此，微生物可以用來(lái)監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)水體污染[8]。最近，有許多研究發(fā)現(xiàn)了微納米氣泡對(duì)水系統(tǒng)中微生物群落的調(diào)節(jié)能力。例如，Nghia等[9]發(fā)現(xiàn)微納米氣泡處理可以通過(guò)控制副溶血性弧菌的水平來(lái)改善水質(zhì)；Zhang等[10]以枯草芽孢桿菌為模型微生物研究了臭氧微米氣泡技術(shù)的消毒性能；Wu等[11]研究表明微納米氣泡可以影響污染水中的微生物群落，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)水的理化特性并持續(xù)減輕水污染。盡管人們認(rèn)識(shí)到微納米氣泡能夠影響微生物的活性，但是對(duì)微納米氣泡處理對(duì)水體微生態(tài)(微生物群體的結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用關(guān)系)的調(diào)節(jié)作用的了解仍然有限。而近年來(lái)宏基因組學(xué)的發(fā)展，使得其成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的重要工具。

宏基因組學(xué)是指利用基因組學(xué)策略研究特定環(huán)境樣品中所含所有微生物的遺傳組成和群落功能的方法[12]。這種方法可以避免微生物的分離和培養(yǎng)、進(jìn)行微生物組成和微生物種群的相互作用研究，并在分子水平上研究其代謝途徑和基因功能[13]。因此，為了進(jìn)一步探究微納米氣泡凈化水體的作用機(jī)制，本研究采用宏基因組學(xué)方法研究了微納米氣泡處理前后對(duì)池塘水體中微生物群落的組成和功能基因表達(dá)的影響。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 水域的微納米氣泡處理及水體樣品采集

試驗(yàn)于2018年秋季(8月28日—9月6日)在中國(guó)上海應(yīng)用物理所內(nèi)池塘進(jìn)行，水溫測(cè)量為29.8～30.5 ℃，同期平均氣溫為28.0～34.0 ℃。利用微納米氣泡曝氣系統(tǒng)(圖1)向池塘水體中通入微納米氣泡，微納米氣泡曝氣系統(tǒng)由水箱、離心泵、控制閥、壓力計(jì)、空氣流量計(jì)和連接管道組成。在連續(xù)通過(guò)微納米氣泡18 d后(水質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示有明顯改善)，分別在曝氣點(diǎn)附近的3個(gè)位置取樣，共取9個(gè)水體樣本，以遠(yuǎn)離曝氣點(diǎn)的池塘邊緣樣品做對(duì)照。采樣瓶浸入水面下20～50 cm，每次取水樣1 L，及時(shí)使用水體抽濾機(jī)抽濾，回收濾膜上的覆蓋物抽提其總DNA，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)評(píng)估。DNA樣本檢測(cè)合格后，將其隨機(jī)片段化并篩選合適大小的插入片段進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫(kù)質(zhì)檢合格并精確定量后，上機(jī)進(jìn)行Illumina HiSeq宏基因組測(cè)序。

圖1 微納米氣泡調(diào)節(jié)池塘水體中微生物群落示意圖Fig.1 Scheme of Micro-Nano Bubbles for Effecting the Microbiome in Pond Water

1.2 數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)進(jìn)行過(guò)濾處理，去除污染及低質(zhì)量數(shù)據(jù)、清除污染序列等，得到有效數(shù)據(jù)(clean data)，以保證后續(xù)信息分析結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。從各樣本質(zhì)控后的有效數(shù)據(jù)出發(fā)，進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接組裝，并統(tǒng)計(jì)組裝結(jié)果。對(duì)重疊群(contigs)進(jìn)行基因預(yù)測(cè)并去冗余，構(gòu)建基因目錄(gene catalogue)，然后獲得各基因在各樣本中的豐度信息。隨后和MicroNR庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得物種注釋信息，并結(jié)合基因豐度表，獲得不同分類層級(jí)的物種豐度表。最后進(jìn)行代謝通路(KEGG)和同源基因簇(eggNOG)的功能注釋和豐度分析，獲得不同層級(jí)的功能豐度表。

2 結(jié)果和討論

2.1 測(cè)序結(jié)果和處理

樣品測(cè)序后的原始數(shù)據(jù)中重復(fù)序列比例、GC含量(DNA雙鏈中GC堿基對(duì)所占的數(shù)量百分比)、讀長(zhǎng)(reads)平均長(zhǎng)度以及讀長(zhǎng)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。為確保所有樣品的測(cè)序質(zhì)量，本研究去除了模糊堿基(N)數(shù)超過(guò)閾值的讀長(zhǎng)。由于樣本來(lái)源于自然界水體，不需要去除宿主序列。測(cè)序采用的是雙端測(cè)序，每個(gè)樣品得到2組讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)，經(jīng)篩選后第1 d采集的水體樣品(D1)的2個(gè)方向均保留了32 013 061個(gè)高質(zhì)量的讀長(zhǎng)，平均長(zhǎng)度分別為147 bp和138 bp；第18 d采集的水體樣品(D18)的2個(gè)方向均保留了35 873 340個(gè)高質(zhì)量的讀長(zhǎng)，平均長(zhǎng)度均為146 bp(表2)。通過(guò)過(guò)濾后的序列質(zhì)量分布圖可以看出，絕大多數(shù)的序列堿基質(zhì)量都屬于高質(zhì)量部分。將通過(guò)質(zhì)控的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行宏基因組組裝以及開(kāi)放閱讀框架(ORF)預(yù)測(cè)操作，樣品D1、D18分別共得到716 311、386 383個(gè)基因數(shù)目。將所有樣品中預(yù)測(cè)出來(lái)的基因進(jìn)行聚類(95%一致性、90%覆蓋度)，每個(gè)類取最長(zhǎng)的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因集，所有的樣品共得到962 170個(gè)非冗余基因。使用各樣本有效數(shù)據(jù)比對(duì)到微生物參照標(biāo)記基因(reference marker gene)數(shù)據(jù)庫(kù)并利用mataphlan2獲得各個(gè)樣本在不同分類水平物種豐度信息。由于遠(yuǎn)離曝氣點(diǎn)的對(duì)照點(diǎn)處理前后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯變化，下文只報(bào)告曝氣點(diǎn)附近的樣品在處理后微生態(tài)的變化情況。

表1 不同樣品中測(cè)序結(jié)果Tab.1 Sequencing Results in Different Samples

表2 質(zhì)檢后宏基因組組裝以及開(kāi)放閱讀框架預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.2 Metagenomic Assembly and ORFs Prediction after Sequencing Data Filtering

2.2 水體中微生物群落的組成與多樣性

為了剖析樣品中微生物群落的組成的變化，繪制了Venn圖[圖2(a)]，結(jié)果顯示在種水平上由第1 d的46種減少到第18 d的30種，其中22種沒(méi)有發(fā)生改變。此外，對(duì)門(mén)水平上相對(duì)豐度變化分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)樣品的前3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均是藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)[圖2(b)]。然而，第一優(yōu)勢(shì)門(mén)在第1 d為藍(lán)藻門(mén)(其豐度為72.8%)，在第18 d則變?yōu)榉啪€菌門(mén)。經(jīng)過(guò)微納米氣泡處理后，藍(lán)藻門(mén)和變形菌門(mén)豐度均有顯著下降，其降低率在50%左右；而放線菌門(mén)豐度(phylum abundance)則顯著提高，由14.84%(第1 d)提高到57.61%(第18 d)[圖2(b)～圖2(c)]。

為了反映各樣本物種多樣性差異，計(jì)算了各樣本中基于物種的香農(nóng)(Shannon)指數(shù)。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)微納米氣泡處理后，水體中的香農(nóng)指數(shù)由第1 d的3.24下降到第18 d的3.07，而對(duì)照點(diǎn)樣品沒(méi)有變化。這也表明經(jīng)過(guò)微納米氣泡處理會(huì)在一定程度上降低水體中微生物群落的物種多樣性。

研究發(fā)現(xiàn)微納米氣泡的氣穴現(xiàn)象能夠使得大腸桿菌增殖效率在3 min內(nèi)降低75%[14]。此外，也有幾項(xiàng)研究報(bào)道了類似的微納米氣泡技術(shù)產(chǎn)生的水動(dòng)力空化效應(yīng)對(duì)水消毒的有效性[14-15]，其中破潰的微納米氣泡引起的沖擊波被認(rèn)為是大腸桿菌失活的主要原因。藍(lán)藻和變形菌均是革蘭氏染色陰性菌，細(xì)胞壁較為脆弱；而放線菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁較為堅(jiān)韌。因此，推測(cè)微納米氣泡破裂產(chǎn)生的氣穴效應(yīng)使得藍(lán)藻和變形菌相較于放線菌更容易失活消亡，從而造成微納米氣泡處理前后水中菌落的組成差異，造成水體中菌體群落多樣性的降低。

藍(lán)藻群落的多樣性和豐度會(huì)對(duì)淡水水質(zhì)的變化做出反應(yīng)，并可在環(huán)境研究中用于河流系統(tǒng)的水體質(zhì)量評(píng)估[16]。此外，由于藍(lán)藻會(huì)產(chǎn)生有腥臭味的“水華”(又稱“藻華”)現(xiàn)象，還會(huì)分泌毒素令飲用水源的安全性受到威脅，也會(huì)蓋住水池令魚(yú)類缺氧死亡，進(jìn)一步造成水體污染[17-19]。在本研究中，藍(lán)藻豐度的降低也證明了微納米氣泡有助于水質(zhì)的恢復(fù)[圖2(b)～圖2(c)]。據(jù)報(bào)道，變形菌具有巨大的代謝多樣性和硫氧化、硝酸鹽還原和反硝化的能力，因此，在水生生態(tài)系統(tǒng)中的氮、硫代謝中起著重要作用[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，微納米氣泡處理后變形菌的豐度顯著降低，可能意味著池塘水體系統(tǒng)的氮硫循環(huán)水平降低?？傊?，微納米氣泡通過(guò)影響池塘水中微生物群落的組成和多樣性來(lái)調(diào)節(jié)水體生態(tài)系統(tǒng)。

注：X軸代表門(mén)水平的相對(duì)豐度變化，右側(cè)顯示增加的微生物，左側(cè)顯示減少的微生物；門(mén)豐度變化率=[(A18-A1)/A1]×100%，“A1”指第1 d微生物的門(mén)豐度，“A18”指第18 d微生物的門(mén)豐度圖2 微納米氣泡處理后池塘水體微生物群落的組成演變Fig.2 Composition Evolution of Microbial Communities in Pond Water Body after Micro-Nano Bubble Treatment

2.3 功能基因及代謝通路豐度差異

使用BlastX軟件，將拼接得到的所有核苷酸序列分別與String、Swissprot和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得相應(yīng)的注釋信息。GO二級(jí)注釋結(jié)果(圖3)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)微納米氣泡處理后微生物群落中運(yùn)貨受體活性(cargo receptor activity)基因占比明顯降低，營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性(nutrient reservoir activity)基因活性幾乎消失，而其他的功能基因占比沒(méi)有明顯差異。此外，還選取了KEGG注釋中包含基因或轉(zhuǎn)錄本數(shù)目最多的前20個(gè)通路進(jìn)行分析(圖4)，可以看出ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器(ABC transporters)通路和雙組分系統(tǒng)(two-component system)通路在D18樣品中相較于D1樣品中活躍度明顯降低，而嘌呤代謝(Purine metabolism)通路在D18樣品中更為活躍。

注：橫坐標(biāo)表示GO的二級(jí)分類術(shù)語(yǔ)，左邊縱坐標(biāo)表示包含在該二級(jí)分類中的基因占總數(shù)的百分比，依據(jù)不同功能將基因分為3組：生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成及分子功能圖3 微納米氣泡處理前后池塘水體中微生物基因功能的GO注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.3 Gene Abundance of Microbial Communities in Pond Water before and after Micro-Nano Bubble Treatment Based on GO Annotation

注：其中包含基因數(shù)目最多的前20個(gè)通路；從左至右按照所包含的基因數(shù)目從高到低依次排列，柱子越高表明該生物學(xué)通路在樣本中越活躍圖4 微納米氣泡處理前后池塘水體中微生物基因功能的KEGG注釋結(jié)果Fig.4 Gene Abundance of Microbial Communities in Pond Water before and after Micro-Nano Bubble Treatment Based on KEGG Annotation

運(yùn)貨受體活性基因具有與貨物(cargo)特異性結(jié)合以將其遞送至運(yùn)輸囊泡的功能。營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性基因水平下降意味著儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)功能降低，反映了水體中有機(jī)成分的減少。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器是一類在原核及真核生物中都廣泛分布的膜蛋白超家族，其利用ATP水解產(chǎn)生的能量將底物進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，從而參與營(yíng)養(yǎng)攝入、細(xì)胞解毒、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種重要的生理過(guò)程。雙組分系統(tǒng)是存在于細(xì)菌內(nèi)的一種信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，是細(xì)菌適應(yīng)選擇壓力的一種機(jī)制。嘌呤在生物體的能量供應(yīng)、代謝調(diào)節(jié)及組成輔酶等方面起著十分重要的作用。上述功能基因及代謝通路豐度變化結(jié)果顯示，微細(xì)氣泡處理影響細(xì)胞跨膜運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)及嘌呤代謝等功能。

3 結(jié)論

(1)在本研究中，利用宏基因組學(xué)方法分析了微納米氣泡在池塘水處理過(guò)程中對(duì)微生物群落的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，納米氣泡處理可以降低變形菌和藍(lán)藻等微生物的相對(duì)豐度，并促進(jìn)放線菌門(mén)等微生物的生長(zhǎng)，改變了水體微生物種群的多樣性，進(jìn)而調(diào)節(jié)了池塘水體微生物菌落的平衡。

(2)變形菌門(mén)微生物對(duì)于水體的氮、硫代謝發(fā)揮重要作用，而放線菌門(mén)微生物在富含有機(jī)質(zhì)的水體中比較活躍，因此，微納米氣泡處理后，水體中變形菌門(mén)和放線菌門(mén)微生物豐度的演變可能意味著水體從氮、硫循環(huán)旺盛的體系演化為有機(jī)質(zhì)代謝旺盛的體系。此外，水體中藍(lán)藻豐度的降低進(jìn)一步表明微納米氣泡促進(jìn)了水體的修復(fù)。

(3)納米氣泡處理可以調(diào)節(jié)池塘水體中微生物運(yùn)貨受體活性基因和營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性基因占比以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器、雙組分系統(tǒng)和嘌呤代謝等代謝通路，進(jìn)而調(diào)整池塘微生物群落的生物學(xué)功能，最終有利于水質(zhì)的優(yōu)化。

(4)本研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)水體中微生物群落結(jié)構(gòu)及基因功能的平衡、維持其穩(wěn)定性可能是微納米氣泡在水處理中的潛在作用機(jī)制，為理解微納米氣泡效應(yīng)提供了新的視角。