去腎交感神經(jīng)對(duì)2型糖尿病大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬及NLRP3活化的影響

王勇，牛偉華，盧成志△，許夢(mèng)萍，徐建強(qiáng)，何強(qiáng)，許學(xué)升

2020年中國(guó)2型糖尿?。═2DM）防治指南指出，我國(guó)糖尿病患病率仍在上升，2015—2017 年達(dá)到11.2%，其中90%以上為T2DM。糖尿病常導(dǎo)致血液流變學(xué)、微循環(huán)和細(xì)胞代謝的紊亂，進(jìn)而引起心、腦、腎和視網(wǎng)膜等重要靶器官的損害，其中以血管病變最為嚴(yán)重，可加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，且心血管事件是糖尿病患者死亡的主要原因［1］。血管內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損，是動(dòng)脈粥樣硬化的早期標(biāo)志之一［2］。近期研究表明，去腎交感神經(jīng)（renal denervation，RDN）能有效治療高血壓［3-4］，同時(shí)改善血管內(nèi)皮功能障礙［5］，但具體機(jī)制尚未闡明。本研究通過觀察RDN對(duì)T2DM大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體表達(dá)的影響，初步了解RDN改善T2DM 大鼠血管內(nèi)皮功能的機(jī)制，為RDN 治療T2DM 引起的血管內(nèi)皮功能障礙提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康雄性SD 大鼠30 只，6周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXX（京）2019-0002］，于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所飼養(yǎng)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，采用隨機(jī)數(shù)字表法分組：（1）對(duì)照組（CON組，n=6），給予普通飼料喂養(yǎng)。（2）高脂組（HFD 組，n=24），給予高脂飲食喂養(yǎng)12 周后，采用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射30 mg/kg 的方法制備T2DM大鼠模型，1周后剪尾取血，空腹血糖≥11.1 mmol/L 為造模成功［6］。隨機(jī)抽取18只建模成功的大鼠，再次采用隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病對(duì)照組（T2DM 組，n=6），雙側(cè)假手術(shù)組（Sham組，n=6），雙側(cè)手術(shù)組（RDN組，n=6）。

1.1.2 主要藥品、試劑及儀器 STZ（美國(guó)Sigma 公司），苯酚（濟(jì)南米樂化工有限公司），無水乙醇（濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司）。10%苯酚無水乙醇溶液：苯酚溶液置于水浴箱加熱2 h，取10 mL 苯酚，再取90 mL 無水乙醇，充分混勻后裝于200 mL的瓶中。戊巴比妥鈉（北京華業(yè)寰宇化工有限公司），Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），血糖試劑盒、胰島素試劑盒（上海哈靈生物技術(shù)有限公司），去甲腎上腺素（NE）試劑盒、血管性血友病因子（vWF）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Pierce公司），乙酰膽堿（Ach）、硝普鈉（SNP）、NE（美國(guó)Sigma公司），酪氨酸羥化酶（TH）抗體（武漢博士德生物工程有限公司），通用二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（PV-9000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），抗Beclin1、LC3、p62 抗體（美國(guó)CST 公司），抗NLRP3、胱天蛋白酶（Caspase）-1、活化的Caspase 3（cleaved Caspase-3）、白細(xì)胞介素（IL）-1β抗體（北京博奧森生物有限公司），抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體（英國(guó)EterLife公司），抗β-actin抗體（美國(guó)Abbkine公司），羊抗兔二抗（碧云天公司）；TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，無創(chuàng)血壓計(jì)BP-98A（日本Softron），血糖測(cè)試儀（強(qiáng)生穩(wěn)豪），620M離體微血管張力測(cè)定系統(tǒng)（丹麥ADInstrument），PowerLab多導(dǎo)生理記錄儀（澳大利亞AD），H-7650透射電鏡（日本日立），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 血壓和心率的測(cè)量 采用尾套法測(cè)量基線狀態(tài)、RDN術(shù)前及術(shù)后4周大鼠的血壓及心率。

1.2.2 RDN模型的建立［7］大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，腹腔注射戊巴比妥鈉100 mg/kg 麻醉，腹部正中切口，暴露腎臟，用彎頭無齒鑷分離出腎動(dòng)脈，在解剖顯微鏡（×25）下找出腎動(dòng)脈所有可見的腎神經(jīng)，RDN組用細(xì)頭棉簽蘸取溶于10%苯酚無水乙醇溶液抹雙側(cè)腎動(dòng)脈周圍2 min達(dá)到充分去神經(jīng)效果，Sham組予以生理鹽水涂抹2 min，不破壞腎神經(jīng)。術(shù)后前3 d腹腔內(nèi)注射慶大霉素8萬U/d預(yù)防感染，常規(guī)進(jìn)食水。

1.2.3 血液標(biāo)本采集及保存 分別于基線狀態(tài)、RDN術(shù)前及術(shù)后4周，禁食12 h清晨眼內(nèi)眥靜脈取血2 mL，3 000 r/min離心10 min，取出上清液于-80 ℃保存，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)大鼠血清空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、NE、vWF、NO水平及腎臟組織中NE的水平，具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.4 標(biāo)本取材、腎動(dòng)脈HE 染色以及TH 陽性神經(jīng)纖維檢測(cè) RDN 術(shù)后4 周處死大鼠，剪取整段腎動(dòng)脈及周圍組織。生理鹽水漂洗后，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片（范圍包括近、中、遠(yuǎn)段），HE 染色觀察腎動(dòng)脈周圍組織，免疫組化分析腎動(dòng)脈中TH 陽性神經(jīng)纖維，具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。所得圖像經(jīng)Image Pro Plus軟件進(jìn)行定量分析，每張切片在高倍鏡下觀察，陽性表達(dá)為棕黃色，以積分光密度（IOD）為指標(biāo)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算5個(gè)高倍顯微鏡下的平均IOD值。

1.2.5 透射電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞中的自噬結(jié)構(gòu) 取各組大鼠胸主動(dòng)脈切成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm 大小，2.5%戊二醛固定后再經(jīng)鋨酸固定，乙醇丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片后醋酸鈉、檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并攝片，分析主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬體的變化情況。

1.2.6 血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn) 處死大鼠后，迅速切取4 mm 左右的胸主動(dòng)脈，保存于生理鹽溶液（PSS），仔細(xì)剔除周圍脂肪和結(jié)締組織，懸吊于盛有10 mL，37 ℃PSS液的離體血管恒溫浴槽中，持續(xù)95%O2和5%CO2混合氣體；通過PowerLab 多導(dǎo)生理記錄儀分析血管張力的變化，浴槽內(nèi)基礎(chǔ)張力調(diào)至1.0 g，并設(shè)定為基線值。當(dāng)動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定于基線水平時(shí)，向水浴槽中加入1 μmol/L 的NE，使動(dòng)脈環(huán)收縮達(dá)到最大反應(yīng)后，穩(wěn)定15 min，加入10 μmol/L 的Ach 觀察預(yù)收縮血管舒張程度，如果預(yù)收縮血管舒張可達(dá)到60%～90%，可以認(rèn)為內(nèi)皮完整，反之則認(rèn)為內(nèi)皮受損。給予NE收縮血管達(dá)到最大反應(yīng)后穩(wěn)定30 min，加入內(nèi)皮非依賴性血管舒張劑SNP（1×10-6mol/L），檢測(cè)血管舒張功能。將Ach濃度梯度設(shè)為1×10-9～1×10-4mol/L，SNP濃度梯度為1×10-10～1×10-5mol/L，對(duì)比4組大鼠的Ach和SNP濃度-舒張效應(yīng)曲線。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3 mRNA 表達(dá) RDN 術(shù)后4 周，用Trizol 提取組織樣本中總RNA，取5 μL RNA 用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性。用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

Tab.1 Primer sequences for PCR analyses表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.8 Western blot 法檢測(cè)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞蛋白表達(dá) 取適量主動(dòng)脈加蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔加蛋白質(zhì)約30 μg 行SDS-PAGE 電泳，電泳后再將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上（濕轉(zhuǎn)），脫脂牛奶封閉。一抗Beclin1、LC3、p62、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、cleaved Caspase-3、β-actin 抗體（均為1∶1 000），eNOS 抗體（1∶800）4 ℃孵育過夜。洗膜孵二抗（1∶5 000），室溫下放置2 h，洗膜，曝光顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。β-actin作為內(nèi)參，采用Quantity One軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。在滿足方差齊性的條件下，組間多個(gè)均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線狀態(tài)及RDN 術(shù)前各組大鼠資料比較 高脂喂養(yǎng)前4組大鼠的收縮壓（SBP）、心率（HR）、FPG、FINS、NE、vWF、NO 水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。RDN 術(shù)前，與CON 組比較，T2DM 組、Sham 組、RDN組大鼠SBP、HR、FPG，F(xiàn)INS、NE、vWF水平明顯升高，NO 水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；T2DM組、Sham組、RDN組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

2.2 RDN 術(shù)后4 周各組大鼠SBP、HR、FPG 等指標(biāo)及腎臟NE 水平比較 與T2DM 組和Sham 組比較，RDN 組SBP、HR、FPG、FINS、NE、vWF 及腎臟NE 水平明顯降低，NO 水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），T2DM組與Sham組間各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

2.3 RDN 術(shù)后4 周腎動(dòng)脈HE 染色及TH 陽性表達(dá)情況 HE 染色顯示，正常腎動(dòng)脈血管外膜結(jié)構(gòu)完整，血管周圍可見大量神經(jīng)纖維，RDN 組腎動(dòng)脈血管外膜局部缺失，結(jié)構(gòu)不完整，血管周圍未見明顯神經(jīng)纖維，見圖1。RDN術(shù)后4周，免疫組化結(jié)果顯示，CON 組、T2DM 組、Sham 組和RDN 組的IOD 值分別為0.295±0.019、0.447±0.035、0.445±0.028、0.310±0.011;與T2DM 組和Sham 組比較，RDN 組腎動(dòng)脈TH表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=60.724，P＜0.01），見圖2。

Tab.2 Comparison of baseline parameters between the four groups表2 各組大鼠基線狀態(tài)指標(biāo)比較 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of baseline parameters between the four groups表2 各組大鼠基線狀態(tài)指標(biāo)比較 （n=6，±s）

均P＞0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

Tab.3 Comparison of parameters before RDN between the four groups表3 RDN術(shù)前各組大鼠指標(biāo)比較 （n=6，±s）

Tab.3 Comparison of parameters before RDN between the four groups表3 RDN術(shù)前各組大鼠指標(biāo)比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與CON組比較，P＜0.05。

2.4 RDN 對(duì)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中自噬體的影響 RDN 術(shù)后4 周，透射電子顯微鏡下可見CON 組內(nèi)皮細(xì)胞各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，僅有少量自噬體，自噬體與溶酶體融合形成較大的自噬溶酶體，自噬溶酶體內(nèi)可見正在降解的受損的線粒體，見圖3A、B；T2DM 組和Sham 組可見線粒體嵴裂溶解消失，靠近線粒體雙層膜部位殘留少量線粒體嵴結(jié)構(gòu)，未見明顯自噬體，見圖3C、D；RDN 組可見線粒體嵴排列紊亂，線粒體基質(zhì)區(qū)域部分蛋白降解形成空泡化，自噬小體為雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)含被吞噬的細(xì)胞器，見圖3E、F。

2.5 RDN 對(duì)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能的影響 RDN術(shù)后4 周，與CON 組比較，T2DM 組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能明顯降低；與T2DM 組和Sham 組比較，RDN 組的主動(dòng)脈對(duì)SNP 和Ach 舒張率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5、6。

2.6 RDN 對(duì)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白和cleaved Caspase-3、eNOS 蛋白的影響 RDN 術(shù)后4周，與CON組比較，T2DM組、Sham組和RDN組大鼠自噬蛋白Beclin1、LC3 水平明顯降低，p62 水平明顯升高，凋亡蛋白cleaved Caspase-3 水平升高，eNOS水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與T2DM 組和Sham 組比較，RDN 組Beclin1、LC3、eNOS水平明顯升高，p62、cleaved Caspase-3 水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），T2DM組和Sham組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表7，圖4。

2.7 RDN 對(duì)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3 mRNA 及NLRP3 炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 RDN 術(shù)后4 周，與CON 組比較，T2DM 組、Sham 組和RDN 組大鼠NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)，Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與T2DM組和Sham組比較，RDN組NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)，Caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），T2DM組和Sham組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表8、圖5。

Tab.4 Comparison of parameters after RDN between the four groups表4 RDN術(shù)后4周各組大鼠指標(biāo)比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of parameters after RDN between the four groups表4 RDN術(shù)后4周各組大鼠指標(biāo)比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與CON組比較，b與T2DM組比較，c與Sham組比較，P＜0.05。

Fig.1 Comparison of histological characteristics between chemical ablated renal nerves and normal renal nerves (HE staining,×400)圖1 正常腎動(dòng)脈與RDN后腎動(dòng)脈周圍神經(jīng)組織染色比較（HE染色，×400）

Fig.2 The expression of tyrosine hydroxylase(TH)staining in the renal artery at the end of 4 weeks after RND(Immunohistochemical staining,×400)圖2 RDN術(shù)后4周腎動(dòng)脈TH表達(dá)（免疫組化染色，×400）

Fig.3 Changes of autophagosome in rat aortic endothelial cells observed by transmission electron microscope (×5 000)圖3 透視電子顯微鏡觀察胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬體的變化（×5 000）

Tab.5 Effects of SNP on the endothelial relaxation function of aorta at the end of 4 weeks after RND in the four groups表5 RDN術(shù)后4周各組間SNP對(duì)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能的影響 （n=6，%，±s）

Tab.5 Effects of SNP on the endothelial relaxation function of aorta at the end of 4 weeks after RND in the four groups表5 RDN術(shù)后4周各組間SNP對(duì)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能的影響 （n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與CON組比較，b與T2DM組比較，c與Sham組比較，P＜0.05；lg（SNP）為SNP濃度取常用對(duì)數(shù)值。

Tab.6 Effects of SNP on aortic relaxation to acetylcholine(Ach)at the end of 4 weeks after RND in the four groups表6 RDN術(shù)后4周各組間Ach對(duì)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能的影響 （n=6，%，±s）

Tab.6 Effects of SNP on aortic relaxation to acetylcholine(Ach)at the end of 4 weeks after RND in the four groups表6 RDN術(shù)后4周各組間Ach對(duì)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能的影響 （n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與CON組比較，b與T2DM組比較，c與Sham組比較，P＜0.05；lg（Ach）為Ach濃度取常用對(duì)數(shù)值。

Tab.7 Comparison of Beclin1,LC3,p62,cleaved Caspase-3 and eNOS protein levels in the thoracic aorta at the end of 4 weeks after RND between the four groups表7 RDN術(shù)后4周各組間胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Beclin1、LC3、p62、cleaved Caspase-3、eNOS蛋白水平比較 （n=6，±s）

Tab.7 Comparison of Beclin1,LC3,p62,cleaved Caspase-3 and eNOS protein levels in the thoracic aorta at the end of 4 weeks after RND between the four groups表7 RDN術(shù)后4周各組間胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Beclin1、LC3、p62、cleaved Caspase-3、eNOS蛋白水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與CON 組比較，b與T2DM 組比較，c與Sham 組比較，P＜0.05。

3 討論

Fig.4 Beclin1,LC3,p62,cleaved Caspase-3 and eNOS protein levels at the end of 4 weeks after RND圖4 RDN術(shù)后4周各組Beclin1、LC3、p62、cleaved Caspase-3、eNOS蛋白表達(dá)

Tab.8 Comparison of expression levels of NLRP3 mRNA and other inflammatory proteins in the thoracic aorta at the end of 4 weeks after RND between the four groups表8 RDN術(shù)后4周各組胸主動(dòng)脈NLRP3 mRNA、蛋白及炎癥蛋白表達(dá)水平比較 （n=6，±s）

Tab.8 Comparison of expression levels of NLRP3 mRNA and other inflammatory proteins in the thoracic aorta at the end of 4 weeks after RND between the four groups表8 RDN術(shù)后4周各組胸主動(dòng)脈NLRP3 mRNA、蛋白及炎癥蛋白表達(dá)水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與CON 組比較，b與T2DM 組比較，c與Sham 組比較，P＜0.05。

Fig.5 NLRP3,Caspase-1 and IL-1β protein levels at the end of 4 weeks after RND圖5 RDN術(shù)后4周胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)

T2DM 引起的大血管病變嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，是致死、致殘的主要原因。高血糖導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能障礙是心血管疾病的基礎(chǔ)。交感神經(jīng)興奮可促進(jìn)葡萄糖的利用，增加脂肪分解和糖異生，并減少胰島素分泌，然而胰島素抵抗可使腎上腺素分泌增多，導(dǎo)致交感神經(jīng)過度興奮，兩者之間形成惡性循環(huán)［8］。大量臨床研究及流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)T2DM 患者交感神經(jīng)活性升高［9-10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CON 組相比，給予高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型HR增快、全身及腎臟NE水平和腎動(dòng)脈周圍神經(jīng)TH陽性表達(dá)水平升高，表明交感神經(jīng)活性升高；RDN 治療后，與T2DM 和Sham 組相比，HR降低、全身及腎臟NE水平和腎動(dòng)脈周圍神經(jīng)TH陽性表達(dá)水平降低，表明RDN可以降低全身及局部交感神經(jīng)活性。

自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)的循環(huán)利用機(jī)制，通過形成自噬體結(jié)構(gòu)，可降解或清除細(xì)胞中受損或多余的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等成分，維持細(xì)胞的平衡。相反，自噬不足或過度會(huì)使毒性或受損分子在細(xì)胞中積聚，導(dǎo)致與血管內(nèi)皮功能紊亂相關(guān)的疾病。研究表明，糖尿病引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與自噬不足密切相關(guān)［11］。本研究結(jié)果顯示，通過高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型血管內(nèi)皮功能指標(biāo)vWF 升高，NO 水平降低，表明內(nèi)皮功能受損嚴(yán)重；血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 蛋白表達(dá)降低，自噬蛋白Beclin1和LC3表達(dá)降低，p62表達(dá)增加，提示糖尿病大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙可能與自噬水平受到抑制有關(guān)。RDN 干預(yù)后能夠提高自噬水平并顯著改善受損的主動(dòng)脈內(nèi)皮功能，表明RDN可能通過激活自噬對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮功能發(fā)揮保護(hù)作用。

NLRP3炎癥小體是模式識(shí)別受體的一種大分子蛋白復(fù)合體，主要由NLRP3 蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白（ASC）和無活性的Caspase-1前體組成，可通過活化Caspase-1調(diào)控IL-1β和IL-18等炎性因子的成熟和釋放，在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體在糖尿病及其所導(dǎo)致的慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用［12］。李紅霞等［13］研究發(fā)現(xiàn)NLRP3 炎癥小體在糖尿病前期高表達(dá)，對(duì)糖尿病的早期診斷有潛在的價(jià)值。另外，活性氧在NLRP3 炎癥小體的激活過程中的重要作用受到越來越多關(guān)注。Lian 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，降低活性氧水平可以抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá)，改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，RDN 可能通過降低活性氧及心肌氧化應(yīng)激水平改善心肌梗死犬的心臟結(jié)構(gòu)和功能［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，通過高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型血管內(nèi)皮NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)增高，Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)升高，表明NLRP3炎癥復(fù)合體在內(nèi)皮損傷的發(fā)生過程中起著重要作用；RDN干預(yù)后NLRP3炎癥小體水平降低并且受損的主動(dòng)脈內(nèi)皮功能明顯改善，表明RDN可能通過抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá)對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮功能發(fā)揮保護(hù)作用，分析可能原因是RDN通過降低交感神經(jīng)活性，降低氧化應(yīng)激水平，抑制NLRP3炎癥復(fù)合體的表達(dá)。

自噬可以負(fù)向調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活，從而抑制機(jī)體產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，減輕疾病中產(chǎn)生的炎性損傷。近期Qiao 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，分子伴侶介導(dǎo)的自噬負(fù)向調(diào)控NLRP3 炎癥小體的活化在動(dòng)脈粥樣硬化抗炎治療中發(fā)揮重要作用。王明霞等［17］研究發(fā)現(xiàn)，胡黃連苷Ⅱ可能通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬，抑制NLRP3炎癥小體的激活，抑制炎癥反應(yīng)。此外，Zhou等［18］發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的自噬進(jìn)而抑制NLRP3 炎癥小體活化，以抑制其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)RDN術(shù)后自噬水平升高，同時(shí)NLRP3 炎癥小體表達(dá)水平降低，自噬水平的升高亦有可能負(fù)向調(diào)控NLRP3 炎癥小體的活化。

綜上所述，RDN 可以改善T2DM 大鼠的內(nèi)皮功能障礙，其機(jī)制可能與增強(qiáng)血管內(nèi)皮自噬水平、降低NLPR3炎癥小體的表達(dá)有關(guān)。但由于本研究樣本量小，觀察時(shí)間短，仍需要更多關(guān)于RDN、自噬及NLRP3炎癥復(fù)合體對(duì)T2DM血管內(nèi)皮功能影響的相關(guān)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。