FUNDC1通過調(diào)控線粒體分裂影響高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

鄭君毅，張瑩瑩，劉園園，陳孟英，郭緒昆

糖尿病性心臟病是糖尿病患者的嚴(yán)重并發(fā)癥，高血糖引起心肌細(xì)胞線粒體功能障礙，從而引發(fā)心力衰竭甚至死亡［1］。線粒體供給心臟能量，處于代謝和細(xì)胞凋亡的中心地位［2］。因此維持線粒體功能和結(jié)構(gòu)的完整性對心肌細(xì)胞非常重要。線粒體是一個(gè)動態(tài)變化的細(xì)胞器，經(jīng)歷持續(xù)的融合和分裂過程，以維持其形態(tài)和生物學(xué)功能［3-5］。線粒體融合主要由視神經(jīng)萎縮1（OPA1）和融合蛋白（MFN）調(diào)節(jié)。線粒體分裂由動力相關(guān)蛋白1（DRP1）觸發(fā)，并與線粒體分裂蛋白1（FIS1）相互作用、共同調(diào)控。線粒體過度分裂和融合減少與線粒體功能降低有關(guān)［6-7］。DRP1 和FIS1 不僅是調(diào)控線粒體分裂的2 個(gè)關(guān)鍵蛋白，而且是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的必需蛋白。FUNDC1 是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)位于線粒體外膜的受體蛋白，具有高度的保守性［8］。其在高糖環(huán)境損傷的原代心肌細(xì)胞中呈高表達(dá)，并通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的相互作用，促進(jìn)線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAM）的形成，引起線粒體功能障礙［1］。但是，F(xiàn)UNDC1能否調(diào)節(jié)高糖損傷的心肌細(xì)胞線粒體分裂和細(xì)胞凋亡，目前尚不清楚。本研究嘗試通過建立H9c2 心肌細(xì)胞高糖損傷模型來觀察FUNDC1 表達(dá)變化，及其與線粒體分裂和凋亡的關(guān)系，闡明其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 H9c2 心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)液、減血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青鏈霉素、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、線粒體提取試劑盒、蛋白Marker 和ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自Thermo Fisher 公司。MTT、葡萄糖和二甲基亞砜（DMSO）購自Merck公司。乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。兔源FUNDC1一抗購自Abgent公司。兔源FIS1、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）一抗，小鼠源GAPDH一抗，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗均購自Proteintech 公司。兔源DRP1 和活化的胱天蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）一抗購自CST 公司。線粒體紅色熒光探針（DsRed-Mito）、FUNDC1 干擾質(zhì)粒（shRNA-FUNDC1）和對照質(zhì)粒（shRNA-NC）購自漢恒生物有限公司。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）激活劑5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核苷（AICAR）購自Selleck 公司。RIPA 蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒、含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片劑和蛋白上樣緩沖液購自索萊寶公司。

1.2 H9c2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)和高糖損傷模型建立 H9c2 心肌細(xì)胞接種于含有10%FBS、1%青鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次。為建立高糖損傷的細(xì)胞模型，在完全培養(yǎng)液（含5.5 mmol/L葡萄糖）中加入葡萄糖至終濃度33 mmol/L，培養(yǎng)細(xì)胞48 h。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照試劑盒說明書，在轉(zhuǎn)染前將各組生長狀態(tài)良好的細(xì)胞鋪于6 孔板中，按照Lipofectamin 3000 的說明書將Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋后的shRNA-FUNDC1或shRNANC 分別與Lipofectamine 3000 混合，將混合液室溫孵育10～15 min 后加入各組細(xì)胞培養(yǎng)液中，混勻后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，然后更換為完全培養(yǎng)液，加高糖刺激48 h后收集各組細(xì)胞。細(xì)胞分為正常對照組（CTRL 組）、高糖組（HG 組）、HG+shRNA-NC 組（轉(zhuǎn)染shRNA-NC 的HG 組細(xì)胞）、HG+shRNA-FUNDC1組（轉(zhuǎn)染shRNA-FUNDC1的HG組細(xì)胞）和HG+AICAR 組（HG 組細(xì)胞使用AMPK 激活劑AICAR，1 mmol/L）。

1.4 MTT法檢測各組心肌細(xì)胞的存活率 模型建立完成后，向各組細(xì)胞中加入20 μL MTT（5 g/L），37 ℃孵育4 h。輕輕吸凈各孔液體，加入150 μL DMSO，置于水平搖床上使結(jié)晶充分溶解。待結(jié)晶完全溶解后，于490 nm波長下測定各孔吸光度（A）值。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組A值/CTRL組A值×100%。

1.5 細(xì)胞LDH 釋放量檢測 吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按照LDH檢測試劑盒說明書加入檢測液后室溫孵育30 min，在酶標(biāo)儀上測定各組490 nm波長處的A值，計(jì)算LDH的釋放量。

1.6 共聚焦顯微鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu) 細(xì)胞接種在含細(xì)胞爬片的24孔板中，用DsRed-Mito特異性標(biāo)記線粒體48 h后，吸干細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 漂洗3 次，4%多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞15 min。PBS 漂洗3 次后加入含有DAPI 的封片劑進(jìn)行封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體的結(jié)構(gòu)。

1.7 Western blot 法檢測蛋白的表達(dá) 按照線粒體提取試劑盒說明書操作，分離得到各組細(xì)胞線粒體沉淀和上清液，用RIPA裂解后提取各組線粒體蛋白、胞漿蛋白和細(xì)胞總蛋白。BCA 法進(jìn)行蛋白定量。檢測線粒體DRP1（DRP1-mito）和胞漿DRP1（DRP1-cyto）蛋白表達(dá)水平時(shí)，分別將線粒體蛋白和胞漿蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。檢測其他蛋白表達(dá)水平，將總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。根據(jù)蛋白Marker的分子質(zhì)量大小，切取包含目的蛋白條帶的凝膠，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為：4 ℃，110 V，90 min。將PVDF 膜放入5%BSA 中室溫封閉2 h 后，分別加入抗FUNDC1、FIS1、DRP1、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育過夜。TBST 洗3次后，加入HRP標(biāo)記二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h。再次用TBST 洗3 次，按照ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書操作，用凝膠成像系統(tǒng)掃描后分析蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 Comparison of cell viability and LDH release between the four groups表1 各組細(xì)胞存活率和LDH釋放量對比 （±s）

Tab.1 Comparison of cell viability and LDH release between the four groups表1 各組細(xì)胞存活率和LDH釋放量對比 （±s）

＊P＜0.05；a與CTRL組比較，b與HG組比較，P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率和LDH 釋放量的比較 與CTRL 組比較，HG 組細(xì)胞存活率降低，LDH 釋放量升高（P＜0.05）。與HG組比較，HG+shRNAFUNDC1 組細(xì)胞存活率升高，LDH 釋放量降低（P＜0.05）；HG+shRNA-NC 組細(xì)胞存活率和LDH 釋放量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化 CTRL組細(xì)胞線粒體呈線狀結(jié)構(gòu)，HG組和HG+shRNA-NC組細(xì)胞線粒體多呈點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)；與HG 組比較，HG+shRNAFUNDC1 組線粒體線狀結(jié)構(gòu)增多，點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)減少。見圖1。

2.3 各組蛋白表達(dá)水平比較 與CTRL組比較，HG組DRP1-mito、FIS1、Bax 和Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平升高，DRP1-cyto和Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與HG 組比較，HG+shRNA-FUNDC1組DRP1-mito、FIS1、Bax 和Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低，DRP1-cyto和Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；HG+shRNA-NC 組細(xì)胞各蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表2。

2.4 AICAR 激活A(yù)MPK 后各組FUNDC1 蛋白表達(dá)水平比較 CTRL組、HG 組 和HG+AICAR 組FUNDC1 蛋白表達(dá)水平分別為0.34±0.07、1.25±0.15和0.66±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=46.199，P＜0.05）。與CTRL組比較，HG組FUNDC1蛋白表達(dá)水平升高，與HG 組比較，HG+AICAR 組FUNDC1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖3。

Fig.1 Laser confocal microscope assay of mitochondrial structure(Immunofluorescence staining)圖1 激光共聚焦顯微鏡檢測各組線粒體結(jié)構(gòu)（免疫熒光染色）

Fig.2 Western blot assay of mitochondrial fission and apoptosis proteins圖2 Western blot檢測線粒體分裂和凋亡相關(guān)蛋白

Tab.2 Comparison of fission and apoptosis proteins between the four groups表2 各組細(xì)胞線粒體分裂和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of fission and apoptosis proteins between the four groups表2 各組細(xì)胞線粒體分裂和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與CTRL組比較，b與HG組比較，P＜0.05。

Fig.3 Western blot assay of AICAR on FUNDC1 protein圖3 Western blot檢測AICAR對FUNDC1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

線粒體融合和分裂的平衡是線粒體生命周期中的重要過程，是不斷變化、持續(xù)進(jìn)行的生理進(jìn)程［9］。在高糖損傷導(dǎo)致的多種疾病中，都伴隨著線粒體的過度分裂。Shenouda等［10］發(fā)現(xiàn)在糖尿病患者新鮮分離的靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，線粒體出現(xiàn)明顯的片段化，F(xiàn)IS1 含量顯著升高；隨后研究了體外培養(yǎng)的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞在高糖損傷時(shí)線粒體動力學(xué)的改變情況，結(jié)果顯示，調(diào)控線粒體分裂的DRP1 和FIS1 在高糖損傷下表達(dá)水平均升高，而調(diào)控線粒體融合的主要蛋白OPA1 和MFNs 均沒有明顯的改變；利用siRNA技術(shù)敲低FIS1或者DRP1均可以明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，降低線粒體的分裂和片段化。Kim等［11］報(bào)道，在高糖損傷的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中，線粒體分裂增多，DRP1和FIS1表達(dá)水平明顯升高，敲低FIS1 或DRP1 均能夠提高線粒體功能，減少細(xì)胞凋亡。雖然兩者在機(jī)制上的研究并不相同，但是均觀察到了高糖損傷對于線粒體分裂的影響。這與本研究結(jié)果一致，說明線粒體的過度分裂廣泛地參與了高糖損傷的病理過程。

線粒體的分裂與細(xì)胞凋亡之間關(guān)系密切。DRP1 是具有鳥苷三磷酸（GTP）酶活性的線粒體蛋白，其介導(dǎo)的線粒體分裂不僅調(diào)控細(xì)胞凋亡，而且是各類型哺乳動物的細(xì)胞凋亡過程所必需的［12］。在細(xì)胞凋亡早期，DRP1 從胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體外膜，并定位于線粒體的分裂位點(diǎn)，介導(dǎo)Bax的寡聚化，促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放以啟動細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡的過程中引起線粒體的片段化［13］。FIS1在調(diào)節(jié)線粒體分裂中，主要作為DRP1 募集到線粒體外膜上相互作用的受體，與DRP1 共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Joshi 等［14］在肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）患者的成纖維細(xì)胞和表達(dá)SOD1 突變體的運(yùn)動神經(jīng)元中觀察到線粒體過度斷裂和功能障礙。在這兩種細(xì)胞模型中，選擇性肽抑制劑P110 對DRP1/FIS1 相互作用的抑制導(dǎo)致活性氧水平顯著降低，并改善線粒體結(jié)構(gòu)和功能，減少細(xì)胞色素C的釋放和Bax蛋白的表達(dá)，提高Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。FIS1還能通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白相互作用，激活Caspase酶，從而促進(jìn)線粒體凋亡，并將線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡連接起來［15］。筆者觀察到，隨著線粒體分裂蛋白FIS1的降低和DRP1向線粒體募集的減少，促凋亡蛋白Bax 表達(dá)水平降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平升高，體現(xiàn)了線粒體分裂和細(xì)胞凋亡之間的一致性。

在心肌細(xì)胞，F(xiàn)UNDC1 參與形成線粒體相關(guān)的MAM結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+向線粒體和胞質(zhì)的釋放，通過cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白信號通路調(diào)節(jié)FIS1的表達(dá)，在維持線粒體功能、促進(jìn)心肌重塑中具有重要的作用［16］。細(xì)胞損傷時(shí)，F(xiàn)UNDC1 可以直接作用于DRP1，也可以通過對線粒體融合和分裂的雙向調(diào)控，促進(jìn)線粒體分裂。Chen 等［17］用亞硒酸鹽或FCCP引起Hela細(xì)胞線粒體應(yīng)激，研究了FUNDC1對線粒體自噬和線粒體分裂或融合的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)引起FUNDC1-OPA1 復(fù)合體解偶聯(lián)，同時(shí)增強(qiáng)了DRP1 向線粒體的募集，并與DRP1 偶聯(lián)，形成FUNDC1-DRP1 復(fù)合體，引起線粒體片段化和線粒體自噬。線粒體自噬和細(xì)胞凋亡之間存在密切的關(guān)系。Cai 等［18］發(fā)現(xiàn)FUNDC1 能夠通過調(diào)控缺血再灌注損傷小鼠神經(jīng)元細(xì)胞的線粒體自噬來降低線粒體損傷和細(xì)胞凋亡，在這一過程中AMPK 信號通路發(fā)揮調(diào)控作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，AMPK 廣泛地參與了FUNDC1 依賴的線粒體自噬［19］。本研究結(jié)果顯示，敲低FUNDC1表達(dá)能夠降低高糖損傷引起的細(xì)胞凋亡，AMPK 信號通路也參與了FUNDC1 對細(xì)胞凋亡的調(diào)控，這與Cai等［18］的研究結(jié)果一致。但是，本研究并沒有探討FUNDC1 對線粒體自噬的作用，而是探究了FUNDC1通過線粒體分裂調(diào)控細(xì)胞凋亡。雖然在機(jī)制上，本文與Cai等［18］的研究并不相同，但是均觀察到了線粒體的損傷和片段化以及FUNDC1對細(xì)胞凋亡的調(diào)控，說明在不同的損傷模型中，同樣的蛋白可能通過不同的調(diào)節(jié)機(jī)制對細(xì)胞產(chǎn)生同樣的保護(hù)作用。

綜上所述，高糖引起的細(xì)胞凋亡與線粒體分裂密切相關(guān)，F(xiàn)UNDC1 通過調(diào)節(jié)線粒體分裂影響高糖損傷的心肌細(xì)胞凋亡，這為闡明糖尿病性心臟病的機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，也為新型的治療方案提供了新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)，具有積極的作用。