Notch3調(diào)控Hes2逆轉(zhuǎn)三陰性乳腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究

田園，牟雅君，楊文秀，豆曉偉

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是最具侵襲性的乳腺癌亞型［1］。由于TNBC缺乏特異性治療靶點，目前尚無分子靶向藥物用于治 療 TNBC。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，TNBC 具有較強的EMT 特征［2-3］。有研究報道，Notch3 缺失是TNBC 的一個重要特征，Notch3 可通過激活乳腺癌上皮細胞中Hippo/Yes 相關(guān)蛋白（YAP）通路來抑制EMT［4］。另有研究表明，過表達Notch3可抑制TNBC細胞增殖［5］；高表達Notch3可以增加TNBC 細胞MDA-MB-231 對順鉑的敏感性，且高表達Notch3 的乳腺癌患者總生存期高于Notch3低表達患者［6］。因此，Notch3可視為TNBC的抑制因子，但其作用機制尚未明確。作為Notch信號通路的下游靶基因，Hes 家族基因在癌癥發(fā)生過程中起著重要作用［7-8］。Hes 家族包括Hes1～7 共7 個蛋白。據(jù)報道，Hes1在TNBC 中過度表達并促進了侵襲［9］；降低Notch1 的激活和下游靶蛋白Hes1 的表達可抑制TNBC 干細胞增殖［10］。本課題組前期研究顯示，上調(diào)TNBC 細胞MDA-MB-231 中Notch3 后，Hes1 表達并未增高，而Hes2 表達明顯升高。因此，筆者擬通過本研究驗證Notch3能否逆轉(zhuǎn)TNBC的EMT及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，以及此過程是否與上調(diào)Hes2 表達有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 TNBC 細胞系MDA-MB-231（貨號SCDP-197）購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（貨號11965092）、胎牛血清（貨號10099141C）、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（貨號L3000-015）、Trizol試劑（貨號15596018）、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（貨號361977）均購自美國Invitrogen 公司；Notch3 過表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-Notch3-GFP）及其陰性對照質(zhì)粒（pcDNA3.1-NC-GFP）、Hes2 敲低的小分子干擾質(zhì)粒（si-Hes2-GFP）及其陰性對照質(zhì)粒（si-NC-GFP）均由深圳華大基因有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號RL019A）、PCR試劑盒（貨號RR820A）、細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8，貨號RK035L）均購自日本TaKaRa 公司；Transwell 小室（貨號3422）購自美國Corning 公司；鼠抗人Notch3（貨號sc-515825）、Hes2（貨號sc-166705）單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；鼠抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin，貨號A3044）、波形蛋白（Vimentin，貨號A19607）、β-肌動蛋白（β-actin，貨 號A10752）單克隆抗體及鼠抗人二抗（貨號A06631）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；CO2細胞培養(yǎng)箱（型號HERAcell 240i）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；實時熒光定量PCR（qPCR）儀（型號7500）、凝膠成像系統(tǒng)（型號Healthcare）均購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；多功能酶標(biāo)儀（型號iMark680）購自美國Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡（型號IX73）購自日本Olympus公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231 細胞培養(yǎng)使用DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清以及100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素），在37 ℃和5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞融合度為80%～90%時進行傳代。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細胞（5×104個/mL）接種于6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)過夜；待細胞融合度為60%～80%時，采用Lipofectamine 3000試劑進行轉(zhuǎn)染實驗，細胞分為：對照組（不進行任何轉(zhuǎn)染）、pc-NC 組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC-GFP）、Notch3 過表達組（pc-Notch3 組，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Notch3-GFP）、Notch3 過表達+si-NC 組（pc-Notch3+si-NC 組，共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Notch3-GFP 和si-NCGFP）、Notch3過表達+Hes2敲低組（pc-Notch3+si-Hes2組，共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Notch3-GFP 和si-Hes2-GFP）。收集轉(zhuǎn)染細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 qPCR 檢 測MDA-MB-231細胞中Notch3、Hes2 的mRNA 表達 轉(zhuǎn)染后48 h，用Trizol 試劑從MDA-MB-231 細胞提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA（1 μg）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，采用qPCR 擴增目的基因Notch3、Hes2。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法評估目的基因的相對表達水平。β-actin作為內(nèi)參基因。引物序列見表1。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖活性 將轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細胞以1 000個/孔接種于96孔板，根據(jù)CCK-8試劑盒說明書評估細胞增殖活性。在轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h時每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h 后，在450 nm波長處定量吸光度（A450）值。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 將轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細胞以2×105個/孔的密度接種在6孔板中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育細胞。當(dāng)細胞密度達到90%～95%時使用移液器吸頭進行劃痕，用PBS洗滌細胞，并用含有2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。于0 h、48 h 后用光學(xué)顯微鏡觀察劃痕愈合情況。通過測量細胞劃痕寬度計算細胞遷移率，遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-48 h細胞劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復(fù)3次。

Tab.1 The primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.6 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 將5×104個轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231 細胞接種于Transwell 上室，無血清培養(yǎng)基孵育，同時將600 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基加到下室。培養(yǎng)48 h 后，將移至Transwell 下室的細胞用4%多聚甲醛固定，0.05%結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下收集代表性圖像，并計數(shù)穿膜細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot 檢測細胞Notch3、Hes2 和EMT 相關(guān)蛋白表達 將轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231 細胞以2×105個/孔的密度接種在6孔板中，實驗設(shè)置3個復(fù)孔，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育細胞。當(dāng)細胞密度達到80%時，用RIPA 裂解緩沖液提取MDA-MB-231 細胞中的總蛋白質(zhì)，并通過BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒測量濃度。將30 μg 總蛋白質(zhì)進行凝膠電泳分離，并將凝膠中分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。轉(zhuǎn)移后，將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，與鼠抗人Notch3（1∶500）、Hes2（1∶500）、E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）一抗在4 ℃下孵育過夜。然后將膜洗滌后與鼠抗人二抗（1∶4 000）在室溫下孵育1 h。增強化學(xué)發(fā)光底物顯色，用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析膜上蛋白質(zhì)條帶灰度，并以β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗；不同時間點多組間比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MDA-MB-231 細胞Notch3、Hes2 mRNA和蛋白表達水平比較 對照組和pc-NC 組Notch3、Hes2 的mRNA 和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組和pc-NC 組比較，pc-Notch3組、pc-Notch3+si-NC組和pc-Notch3+si-Hes2 組Notch3 的mRNA 和蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC 組Hes2 的mRNA 和蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與pc-Notch3組和pc-Notch3+si-NC 組比較，pc-Notch3+si-Hes2 組Hes2 的mRNA 和蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。pc-Notch3 組、pc-Notch3+si-NC 組、pc-Notch3+si-Hes2組Notch3的mRNA 和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。pc-Notch3 組、pc-Notch3+si-NC 組Hes2 的mRNA 和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

Fig.1 Western blot assay of Notch3 and Hes2 of MDA-MB-231 cells in each group圖1 各組MDA-MB-231細胞Notch3、Hes2蛋白印跡圖

Tab.2 Comparison of Notch3,Hes2 mRNA and protein levels of MDA-MB-231 cells between the five groups表2 各組MDA-MB-231細胞Notch3、Hes2的mRNA和蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of Notch3,Hes2 mRNA and protein levels of MDA-MB-231 cells between the five groups表2 各組MDA-MB-231細胞Notch3、Hes2的mRNA和蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與pc-NC組比較，c與pc-Notch3組比較，d與pc-Notch3+si-NC組比較，P＜0.05。

2.2 各組MDA-MB-231細胞增殖活性比較 在0～72 h 時，各組細胞增殖活性隨時間的增加而升高（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染0 h、24 h 時，各組間細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染48 h、72 h 時，對照組和pc-NC 組細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與對照組和pc-NC組比較，pc-Notch3組和pc-Notch3+si-NC 組細胞增殖活性顯著降低（P＜0.05）；與pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC 組比較，pc-Notch3+si-Hes2 組細胞增殖活性顯著升高（P＜0.05）。pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC 組細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 各組MDA-MB-231 細胞遷移能力比較 對照組和pc-NC 組細胞遷移率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組和pc-NC 組比較，pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC 組細胞遷移率顯著降低（P＜0.05）；與pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC 組比較，pc-Notch3+si-Hes2 組細胞遷移率顯著升高（P＜0.05）。pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC 組細胞遷移率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表4。

2.4 各組MDA-MB-231 細胞侵襲能力比較 對照組和pc-NC 組穿膜細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組和pc-NC 組比較，pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC 組穿膜細胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC 組比較，pc-Notch3+si-Hes2 組穿膜細胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）。pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC 組穿膜細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表4。

2.5 各組MDA-MB-231細胞EMT 相關(guān)蛋白表達水平比較 對照組和pc-NC組E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組和pc-NC 組比較，pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC 組E-cadherin 蛋白表達水平顯著升高，Vimentin蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC 組比較，pc-Notch3+si-Hes2 組E-cadherin蛋白表達水平顯著降低，Vimentin蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。pc-Notch3 組和pc-Notch3+si-NC組E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4、表5。

3 討論

TNBC 的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移潛力均高于其他乳腺癌亞型［11］。由于TNBC 的內(nèi)在復(fù)雜性，以及缺乏特異性的治療靶點和預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)，往往預(yù)后較差［12］。因此，有必要尋找新的治療靶點。

Tab.3 Comparison of proliferative activity of MDA-MB-231 cells between the five groups表3 各組MDA-MB-231細胞增殖活性比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of proliferative activity of MDA-MB-231 cells between the five groups表3 各組MDA-MB-231細胞增殖活性比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；組間比較：a與對照組比較，b與pc-NC組比較，c與pc-Notch3組比較，d與pc-Notch3+si-NC組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與0 h比較，B與24 h比較，C與48 h比較，P＜0.05。

Fig.2 Changes of migration ability of MDA-MB-231 cells in each group(×100)圖2 各組MDA-MB-231細胞遷移能力變化（×100）

Fig.3 Comparison of invasive ability of MDA-MB-231 cells between the five groups(Crystal violet staining,×200)圖3 各組MDA-MB-231細胞侵襲能力比較（結(jié)晶紫染色，×200）

Tab.4 Comparison of MDA-MB-231 cell migration rate and number of transmembrane cells between the five groups表4 各組MDA-MB-231細胞遷移率和穿膜細胞數(shù)比較 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of MDA-MB-231 cell migration rate and number of transmembrane cells between the five groups表4 各組MDA-MB-231細胞遷移率和穿膜細胞數(shù)比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與pc-NC組比較，c與pc-Notch3組比較，d與pc-Notch3+si-NC組比較，P＜0.05。

Fig.4 Western blot assay of E-cadherin and Vimentin of MDA-MB-231 cells in each group圖4 各組MDA-MB-231細胞E-cadherin、Vimentin蛋白印跡圖

Tab.5 Comparison of E-cadherin and Vimentin protein levels of MDA-MB-231 cells between the five groups表5 各組MDA-MB-231細胞E-cadherin、Vimentin蛋白水平比較 （n=3，±s）

Tab.5 Comparison of E-cadherin and Vimentin protein levels of MDA-MB-231 cells between the five groups表5 各組MDA-MB-231細胞E-cadherin、Vimentin蛋白水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與pc-NC組比較，c與pc-Notch3組比較，d與pc-Notch3+si-NC組比較，P＜0.05。

Notch 家族包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，在腫瘤發(fā)生過程中，其具有不同的活性和生物學(xué)功能；其中Notch3 在乳腺癌（如TNBC）轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13］。EMT 是上皮細胞的一種特征性轉(zhuǎn)化，被認為是癌癥轉(zhuǎn)移的驅(qū)動力，其特征是上皮標(biāo)志物Ecadherin 的丟失和間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin 的過表達［14］。目前，關(guān)于Notch3在乳腺癌EMT中的作用存在爭議［15］。第1 種觀點認為，Notch3 通過誘導(dǎo)EMT促進腫瘤侵襲性，乳腺癌細胞中Notch3 表達下調(diào)可顯著抑制EMT，降低乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的風(fēng)險［16］。第2種觀點認為，在乳腺癌患者中，Notch3表達上調(diào)與低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率相關(guān)，Notch3 可通過激活GATA結(jié)合蛋白3轉(zhuǎn)錄抑制EMT及乳腺癌轉(zhuǎn)移［17］；且Notch3 在體外可通過腎臟腦蛋白介導(dǎo)的Hippo/YAP信號通路負調(diào)節(jié)EMT［4］。本研究結(jié)果支持第2 種觀點，Notch3 誘導(dǎo)EMT 促進腫瘤侵襲的研究結(jié)論不一，推測可能與Notch3下游基因的激活有關(guān)，不同下游基因的激活可能導(dǎo)致Notch3在乳腺癌中發(fā)揮不同作用。這些研究表明Notch3信號通過激活新的下游基因來抑制乳腺癌細胞發(fā)生EMT。因此，探究Notch3 抑制TNBC 轉(zhuǎn)移的分子機制有助于尋找TNBC治療新靶點。

Hes 家族基因是公認的Notch 信號通路的下游靶基因［18］。研究顯示，Hes2在卵巢癌中表達水平升高與卵巢癌細胞的增殖活力和遷移能力有關(guān)［19］，且參與食管癌［20］等侵襲性腫瘤的進展。但已有的研究并未發(fā)現(xiàn)Hes2 的相關(guān)機制，且關(guān)于Hes2 對乳腺癌的影響罕見報道。本研究結(jié)果顯示，過表達Notch3后，MDA-MB-231細胞中Hes2的mRNA和蛋白水平顯著高于對照組，且MDA-MB-231 細胞的增殖活性、遷移與侵襲能力均降低，同時E-cadherin蛋白表達水平升高，Vimentin蛋白表達水平降低，提示EMT受到抑制，Notch3 可能通過Hes2 在逆轉(zhuǎn)MDA-MB-231細胞EMT中發(fā)揮作用。

為驗證以上推測，本研究在過表達Notch3 的MDA-MB-231 細胞中，采用小分子干擾技術(shù)敲低Hes2 表達，進行CCK-8 測定、劃痕愈合測定和Transwell 小室測定以探索表型變化。結(jié)果顯示，在TNBC 細胞系MDA-MB-231 中，Vimentin 蛋白表達水平升高，E-cadherin 蛋白表達水平降低，并導(dǎo)致Notch3 過表達對細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用被顯著減弱，提示敲低Hes2 表達可促進EMT，過表達Notch3 可能通過上調(diào)Hes2 來逆轉(zhuǎn)TNBC 的EMT，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

綜上所述，Notch3 對TNBC 轉(zhuǎn)移和EMT 的抑制作用可能與Hes2 表達水平升高有關(guān)。本研究為TNBC 提供了一個潛在的治療靶標(biāo)，但目前Notch-Hes 信號通路對乳腺癌影響的研究尚不全面，其在腫瘤中的功能和調(diào)控機制仍需進一步明確。此外，Notch3 在TNBC 中的作用還需通過體內(nèi)研究進一步驗證，這也將是今后的研究重點。