巴戟天寡糖對(duì)去卵巢大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌能量代謝障礙和細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷的預(yù)防作用

王志紅，程亮星，黃冬梅，鄧克紅，趙 虎，魯笑欽，王武亮，胡 濱，劉 海，崔金全

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院《腫瘤基礎(chǔ)與臨床》編輯部 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心外科 鄭州 450052

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是大多數(shù)心血管疾病和心臟手術(shù)過(guò)程中常見(jiàn)的病理生理性損傷。巴戟天寡糖(morinda officinalis oligose，MOO)提取自中藥巴戟天。課題組前期研究[1]證實(shí)，其對(duì)去卵巢大鼠心肌IRI有保護(hù)作用，保護(hù)機(jī)制主要與其抗氧化和抗凋亡作用有關(guān)。課題組前期研究[2]還證實(shí)，MOO能夠通過(guò)改善子宮組織的能量代謝和抗氧化能力保護(hù)大鼠子宮組織免于IRI。圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后激素水平異?？蓪?dǎo)致女性出現(xiàn)圍絕經(jīng)期綜合征，心血管疾病等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[3-4]。因此，無(wú)論是基礎(chǔ)研究還是臨床研究，針對(duì)圍絕經(jīng)期女性這一心血管疾病高發(fā)群體進(jìn)行心肌IRI干預(yù)研究、尋找可行的保護(hù)措施，都具有重大意義。本研究觀察了MOO對(duì)去卵巢大鼠心肌IRI后心肌組織高能磷酸化合物(high energy phosphate compounds,HEP)水平以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料75只健康雌性SD大鼠，體重290～315(298±12) g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(豫)2005-0001]。MOO提取由河南大學(xué)藥學(xué)院完成，具體方法參考文獻(xiàn)[5]。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)(美國(guó)Amresco公司)，日本島津LC-6A型高效液相色譜儀、SPD-6A型紫外檢測(cè)器(日本Shimadzu公司)，Scienhome C18色譜柱(250 nm×4.6 nm,5 μm)(江蘇淮安市恒天公貿(mào)有限公司)，H-7500透射電鏡(日本Hitachi公司)。

1.2 大鼠分組及給藥方法75只大鼠經(jīng)7 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組(每組15只)：對(duì)照組、假IRI組、IRI組、高劑量MOO組、低劑量MOO組。腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(4 μL/g)麻醉后，取腹部正中切口，對(duì)照組僅游離卵巢，余4組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，術(shù)后常規(guī)縫合和預(yù)防性抗感染處理。術(shù)后低、高劑量MOO組大鼠按體重分別給予含0.07、0.21 g/mL MOO藥液10 mL/kg灌胃，其余3組給予雙蒸水10 mL/kg灌胃，1次/d，連用7 d。

1.3 去卵巢大鼠心肌IRI模型制備假IRI組、IRI組、高劑量MOO組、低劑量MOO組大鼠末次灌胃1 h后，腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉麻醉，術(shù)前行氣管插管，開(kāi)胸，上動(dòng)物呼吸機(jī)，并經(jīng)左下肢股靜脈按0.05 U/g推注肝素鈉，充分暴露心臟。假IRI組大鼠僅游離心臟；余3組大鼠均用5號(hào)絲線于左冠狀動(dòng)脈前降支中上1/3處結(jié)扎血管，結(jié)扎成功標(biāo)志為缺血區(qū)域變紫且心電圖示ST段抬高，結(jié)扎30 min后解除結(jié)扎線再灌注60 min，取出心臟，其中10只置于-80 ℃冰箱待測(cè)HEP，5只放入預(yù)冷(0～4 ℃)體積分?jǐn)?shù)4%戊二醛-磷酸緩沖液以備超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.4 高效液相色譜法檢測(cè)心肌組織中HEP水平取100 mg于-80 ℃冰箱保存的左心室組織，置入預(yù)冷0.42 mol/L高氯酸中，制成組織勻漿；加入1.00 mol/L氫氧化鉀中和；超聲波細(xì)胞粉碎器將線粒體膜粉碎，使得能量物質(zhì)完全釋放。將組織勻漿于4 ℃條件下15 000 r/min離心15 min。取上清液用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾。取20 μL濾液上柱分析，檢測(cè)ATP、ADP和AMP水平。色譜條件：流動(dòng)相為215 mmol/L磷酸二氫鉀與體積分?jǐn)?shù)3.5%乙腈組成，三乙胺調(diào)pH值至6.1，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫30 ℃。按照公式計(jì)算心肌總腺嘌呤核苷酸(total adenine nucleotide，TAN)和心肌細(xì)胞能荷(energy charge，EC)：TAN=ATP+ADP+AMP；EC=(ATP+0.5×ADP)/TAN。

1.5 電鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化取以預(yù)冷的戊二醛-磷酸緩沖液保存的大鼠心臟，從左心室游離壁處剪取1 mm×1 mm×3 mm的組織塊，4 ℃固定8 h，經(jīng)脫水、包埋、超薄切片、染色等步驟處理后，在電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0處理數(shù)據(jù)。用單因素方差分析比較5組大鼠心肌組織中ATP、ADP、AMP、TAN和EC水平的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織中ATP、ADP、AMP、TAN和EC的比較與假IRI組和對(duì)照組比較，IRI組心肌組織中ATP、ADP、AMP、TAN和EC降低(P<0.05)。與IRI組比較，低、高劑量MOO組ATP、ADP、AMP、TAN和EC升高，高劑量MOO組以上指標(biāo)高于低劑量MOO組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心肌組織中ATP、ADP、AMP、TAN和EC比較(n=10)

2.2 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的變化比較對(duì)照組和假IRI組：心肌超微結(jié)構(gòu)基本正常，心肌肌原纖維排列基本整齊，Z線清晰，部分肌節(jié)排列異常緊密，肌節(jié)間距出現(xiàn)少量不均勻現(xiàn)象，細(xì)胞核膜和線粒體膜基本完整，染色質(zhì)均勻、細(xì)密，基質(zhì)致密，嵴排列緊密且清晰，線粒體和糖原顆粒豐富，未發(fā)現(xiàn)間質(zhì)水腫。IRI組：心肌細(xì)胞壞死明顯，心肌肌原纖維排列紊亂、斷裂或消失，Z線模糊或消失，線粒體大多或全部的嵴和膜融合或消失，糖原顆粒稀少或消失，間質(zhì)明顯水腫。高劑量MOO組：可見(jiàn)輕微的心肌細(xì)胞基質(zhì)或線粒體腫脹、部分線粒體的嵴和膜融合等輕微損傷，較IRI組明顯改善。低劑量MOO組：心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷較IRI組有所改善，但較高劑量MOO組嚴(yán)重，心肌細(xì)胞壞死較為明顯，肌節(jié)排列紊亂，Z線模糊，線粒體的少部分嵴和膜融合或消失，糖原顆粒較少，基質(zhì)水腫。見(jiàn)圖1。

1～5：分別為對(duì)照組、假IRI組、IRI組、高劑量MOO組與低劑量MOO組；A1～A5：放大倍數(shù)分別為5 000、4 000、6 000、4 000、5 000；B1～B5：放大倍數(shù)分別為20 000、10 000、20 000、20 000、20 000

3 討論

雌激素與雌激素受體結(jié)合可以通過(guò)ATP敏感性鉀離子通道相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等發(fā)揮保護(hù)心腦血管、改善子宮腺肌病癥狀等作用[6-7]。圍絕經(jīng)期女性由于雌激素水平迅速下降而失去了雌激素對(duì)心血管的保護(hù)作用，從而導(dǎo)致更高的心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。謝慧慧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，二仙湯改善圍絕經(jīng)期大鼠心臟電生理變化可能與其提高大鼠體內(nèi)雌激素活性和增加其受體表達(dá)有關(guān)。研究[11-12]證實(shí)，一方面MOO具有類雌激素作用，可以緩解去卵巢大鼠的圍絕經(jīng)期癥狀；另一方面MOO具有抗氧化、抗凋亡作用，可以減輕圍絕經(jīng)期或衰老造成的機(jī)體慢性損傷。

本研究通過(guò)去卵巢的方式建立圍絕經(jīng)期大鼠模型；謝慧慧等[10]研究以及課題組前期研究[1]也已經(jīng)證實(shí)了這一模型的可行性。另外，本課題選擇的ATP、ADP、AMP、TAN、EC等指標(biāo)可以直接反映心肌細(xì)胞能量代謝的變化，其水平高低隨心肌IRI程度的高低而改變[4,13]；電鏡下觀察心肌細(xì)胞線粒體等超微結(jié)構(gòu)的變化，可以直接評(píng)估心肌細(xì)胞的損傷程度，其中線粒體作為能量代謝的重要細(xì)胞器，其損傷程度與心肌細(xì)胞能量代謝的變化有著直接關(guān)系[14-15]。

IRI這一病理生理學(xué)過(guò)程中涉及能量代謝的變化。課題組前期研究[2]發(fā)現(xiàn)，MOO能夠通過(guò)改善IRI大鼠子宮ATP、ADP、AMP和TAN的代謝水平，減輕子宮組織的損傷。研究[14-15]還發(fā)現(xiàn)，線粒體作為能量代謝的重要細(xì)胞器，其損傷是機(jī)體能量代謝障礙的病理學(xué)基礎(chǔ)。董雪佳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀通過(guò)減輕腦IRI過(guò)程中線粒體損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損害。本研究發(fā)現(xiàn)，與假IRI組比較，IRI組心肌組織中ATP、ADP、AMP、TAN和EC降低，而高、低劑量MOO組以上指標(biāo)較IRI組升高，且心肌細(xì)胞損傷較IRI組明顯減輕，高劑量MOO組改善作用更顯著。這提示IRI心肌出現(xiàn)了能量代謝障礙，其原因可能是心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，特別是線粒體結(jié)構(gòu)的破壞影響了線粒體的正常功能，而MOO可能通過(guò)減輕線粒體損傷來(lái)改善其能量代謝，從而對(duì)IRI心肌起到保護(hù)作用。

總之，MOO預(yù)防性給藥能夠改善去卵巢大鼠IRI后心肌細(xì)胞能量代謝，從而減輕心肌IRI。