酵母糖蛋白工程的研究進展

李婉情，張 蕾

（天津大學生命科學學院，天津 300072）

使用生物系統(tǒng)生產(chǎn)生物藥物這一理念于1982年提出［1］，幾十年來，大量生物藥物的出現(xiàn)改變了許多疾病的治療方法。在生物藥物中，70%以上的是糖蛋白，這顯示了生物表達系統(tǒng)對蛋白進行糖基化修飾的重要性，常見的糖基化修飾類型有N-糖基化和O-糖基化。能夠進行糖基化修飾的生物系統(tǒng)有酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞和轉(zhuǎn)基因動物等。其中酵母表達系統(tǒng)中，常用的生產(chǎn)重組蛋白的菌株有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母（Pi?chia pastoris），約有20%的生物藥物是由釀酒酵母生產(chǎn)的。

酵母作為一種真核單細胞微生物，其培養(yǎng)方式簡單、生長速度快，可在60 h 內(nèi)到達平臺期，與哺乳動物細胞培養(yǎng)相比，縮減了生產(chǎn)目的產(chǎn)品的時間和成本。1996、2009 年分別完成了釀酒酵母和畢赤酵母的基因組測序［2，3］。除作為第一個完成測序的真核生物之外，酵母也存在完整的單基因缺失文庫［4］，這進一步推進了對酵母基因功能的研究［5-7］，目前，已經(jīng)對約5 800 種蛋白質(zhì)的生物學功能有基礎的了解，約占總量的85%，這一比例遠遠高于其他真核生物。在酵母中可使用多種基因編輯系統(tǒng)，如同源重組，釀酒酵母擁有極強的同源重組能力，40 bp 的同源序列即可完成重組，但該系統(tǒng)無法回收篩選標記。Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng)［8］和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在酵母中成功構建并解決了這個問題，實現(xiàn)了篩選標記的回收與利用。Dicarlo 等［9］首次在酵母中以90 bp 的雙鏈DNA 作為供體，使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進行基因的破壞和插入，均可達到近100%的效率。為了進一步提高基因編輯的效率，衍生出CRISPR/Cas9 多基因編輯系統(tǒng)，Shi 等［10］使用CRISPR/Cas9 開發(fā)了1個Di-CRISPR平臺，該平臺實現(xiàn)了總長為24 kb的（R，R）-2，3-丁二醇途徑的DNA 大片段的整合。這些高效的基因編輯系統(tǒng)的構建也進一步推動了酵母工程菌株的研究進程。

酵母能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進行翻譯后修飾，如二硫鍵形成、亞基組裝、乙?；吞腔龋?1］，但對外源蛋白獨特的N-高甘露糖基化修飾方式可能會引起免疫反應，并導致血液中治療性蛋白質(zhì)被快速清除［12，13］等影響，限制了酵母系統(tǒng)的應用范圍。為了進一步發(fā)揮酵母的應用價值，需要在酵母中引入人源糖蛋白修飾途徑，改變糖蛋白的修飾類型。本研究介紹了酵母在蛋白生產(chǎn)方面的應用、N-糖基化修飾過程以及人源化改造的研究進展。

1 酵母在蛋白生產(chǎn)方面的應用

許多細菌和真核細胞被用作生產(chǎn)藥物蛋白的平臺，其中原核生物大腸桿菌是最常用的系統(tǒng)之一，1982 年使用該系統(tǒng)生產(chǎn)的第一個重組胰島素的批準［1］開啟生物藥物研究的大門，目前使用該系統(tǒng)產(chǎn)生的重組蛋白占總產(chǎn)量的30%以上［14］。但由于原核系統(tǒng)無翻譯后修飾進程，不能正確形成二硫鍵的局限性，使其只能生產(chǎn)無需修飾的小型重組蛋白。而真核表達系統(tǒng)可以突破這種限制，常用的真核系統(tǒng)包括倉鼠卵巢細胞［15］、昆蟲細胞［16］和酵母［17］等。與其他的哺乳動物表達系統(tǒng)相比，酵母系統(tǒng)不僅培養(yǎng)成本低，而且酵母細胞壁的存在也增加了細胞的耐受性，使其不容易受到溫度、pH 以及環(huán)境中其他物質(zhì)的影響。除此之外，酵母中各種成熟高效基因編輯系統(tǒng)的使用，簡化了基因編輯的過程，縮減了工程化酵母構建的時間，例如Horwitz 等［18］運用酵母天然的間隙修復能力［19］，將具有同源序列的gRNA 片段在菌體內(nèi)修復成完整質(zhì)粒，進行正常CRISPR/Cas9 基因編輯進程，敲除3 個基因，效率可達到64%，且省去了體外構建gRNA 質(zhì)粒的時間。這一系列優(yōu)勢使酵母成為熱門的細胞工廠。

1987 年釀酒酵母生產(chǎn)的重組胰島素被正式批準［1］，此后以酵母為表達系統(tǒng)產(chǎn)生的一系列藥物蛋白陸續(xù)投入使用。如表1 所示，使用酵母系統(tǒng)產(chǎn)生的藥物蛋白主要包括激素（如胰島素類似物和生長激素）、疫苗（如人乳頭瘤病毒疫苗和乙肝疫苗）以及血液相關因子物質(zhì)等［20］。然而，由于釀酒酵母本身特有的對蛋白的N-高甘露糖基化修飾［21］可能會減弱糖蛋白的活性、改變免疫原性并減少其半衰期。與釀酒酵母相比，畢赤酵母糖基化修飾程度和糖基化位點占有率有所減少，通常釀酒酵母中產(chǎn)生約50個甘露糖殘基，而畢赤酵母中產(chǎn)生約30 個甘露糖殘基。并且畢赤酵母可以進行高密度細胞培養(yǎng)的特性能夠進一步提高產(chǎn)品產(chǎn)量。為了減少酵母的甘露糖基化修飾程度，敲除酵母中α-1，6 甘露糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因OCH1，負責添加α-1，6 甘露糖主鏈的的第一個α-1，6-Man，起始甘露糖主鏈的形成［22］（圖1）。在釀酒酵母中OCH1和MNN9基因的敲除使其細胞壁的完整性遭到破壞，進而造成缺失株嚴重的生長缺陷［23］。但將畢赤酵母中OCH1基因敲除之后，缺失株的生長狀況沒受到顯著影響［24］，并且在該菌株中引入哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶基因，成功產(chǎn)生復雜的唾液酸化糖蛋白［25，26］，這使其在生產(chǎn)生物藥物方面擁有更加廣闊的前景。

表1 使用釀酒酵母和畢赤酵母生產(chǎn)的蛋白產(chǎn)品

2 酵母的N-糖基化過程

在酵母中，蛋白的糖基化修飾分為2 種類型：N-糖基化和O-糖基化，其中N-糖基化修飾對蛋白活性的維持，促進蛋白分泌以及維持蛋白熱穩(wěn)定性具有重要作用［26，27］。如圖1 所示，釀酒酵母的N-糖基化修飾進程可以分為2 部分，前半部分進程發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，以磷酸多萜醇（Dol-P）為載體，在糖基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖苷酶和寡糖基轉(zhuǎn)移酶等的作用下，最終形成結構為Man8GlcNAc2寡糖鏈，并連接在蛋白質(zhì)的天冬氨酸殘基上，這一進程在真核生物中較為保守［21］。之后該寡糖肽進入高爾基體中，在糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶等的作用下形成高甘露糖基化的糖鏈。這一進程與哺乳動物相比，產(chǎn)生了明顯的差異。在哺乳動物中，該寡糖肽經(jīng)過甘露糖苷酶修飾，形成糖鏈結構為Man5GlcNAc2寡糖肽，之后在巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶等酶作用下，形成雜合性或者復雜型聚糖結構［28，29］。

圖1 酵母與人源化畢赤酵母的N-糖基化途徑

2.1 酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中寡糖結構的組裝

在Alg7 的作用下，將GlcNAc-1-P 轉(zhuǎn)移Dol-P 載體 上 形 成Dol-PP-GlcNAc［30］；在Alg13/Alg14、Alg1的作用下依次添加β-1，4-GlcNAc、β-1，4-Man 形成Dol-PP-GlcNAc2Man5；在Alg2 2 次連續(xù)作用下添加α-1，3-Man、α-1，6-Man，之后在Alg11 的作用下添加α-1，3-Man 形成Dol-PP-GlcNAc2Man5，完成寡糖鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞質(zhì)一側(cè)的組裝。在翻轉(zhuǎn)酶的作用下將與磷酸多萜醇連接的寡糖翻轉(zhuǎn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)部［31］，按照Alg3、Alg9、Alg12、Alg9、Alg6、Alg8、Alg10的順序在寡糖上依次添加α-1，3-Man、α-1，2-Man、

α-1，6-Man、α-1，6-Man、α-1，3-Glc、α-1，3-Glc、α-1，2 -Glc，形成Dol-PP-Man9GlcNAc2Glc3。之后磷酸多萜醇上的寡糖鏈在寡糖基轉(zhuǎn)移酶復合物的作用下（Oligosaccharyltransferase Complex，OST）與蛋白質(zhì)上特定的天冬氨酸殘基連接形成寡糖肽［32］。接下來，在葡糖苷酶（Gls2、Gls2/Gtb1）、甘露糖苷酶（Mns1）作用下依次去除3 個α-Glc 和1 個α-1，2-Man，形成糖鏈結構為Man8GlcNAc2的寡糖肽，并轉(zhuǎn)移到高爾基體中［33］。

2.2 酵母高爾基體中寡糖結構的組裝

寡糖肽進入高爾基體之后，甘露糖基轉(zhuǎn)移酶（Och1）將α-1，6-Man 添加到寡糖的α-1，3-Man 上，啟動甘露糖外鏈的延伸進程［21］。OCH1基因的敲除會導致酵母細胞壁的完整性被破壞，生長速度降低，代謝進程異常等影響［34］。寡糖肽在蛋白復合物Man-Pol I 和Man-Pol II 的依次作用下，在釀酒酵母中將糖鏈延伸至50 個甘露糖左右，在畢赤酵母中延伸至約30 個甘露糖殘基形成甘露糖主鏈；由Mnn2添加主鏈上第一層α-1，2-Man 側(cè)鏈，Mnn5 添加第二層α-1，2-Man，Mnn4 負責Mnn-P 結構的添加，最后Mnn1 可以在寡糖鏈的Mnn-P 上添加α-1，3-Man［35］。敲除MNN1未對酵母生長產(chǎn)生顯著影響，也未顯著降低蛋白的糖基化修飾程度［36］。

3 酵母糖基化修飾的人源化改造

酵母的糖基化修飾可以幫助蛋白折疊，但是酵母中這種獨特的N-糖基化對蛋白具有負面影響，比如抑制蛋白酶的活性或改變蛋白免疫原性等［37］，因此希望構建能夠去除酵母糖特異性糖基化修飾并生成復合型糖基化的工程酵母菌株。近些年來，在酵母中進行人源糖基化改造，基本遵循2 種主要策略，一種是消除酵母糖基轉(zhuǎn)移酶，另一種是干擾脂連接寡糖（Lipid-linked oligosaccharide，LLO）的組裝降低蛋白的糖基化修飾程度，之后引入哺乳動物中的糖基轉(zhuǎn)移酶實現(xiàn)人源化糖鏈的合成。

近些年對酵母進行改造及產(chǎn)生的糖鏈類型見表2。在酵母中進行人源化改造的第一步，需要通過敲除酵母中在N-高甘露糖鏈合成中的關鍵基因，來降低酵母中的糖基化修飾程度，如圖1 所示，酵母中OCH1基因編碼α-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，是甘露糖外鏈形成的關鍵基因。在釀酒酵母中敲除OCH1基因 后，可 以 檢 測 到 糖 鏈 結 構Man9-10GlcNAc2［36］。Mnn4 和Mnn1 分別負責Mnn-P 和最后1 個α-1，3-Man 的添加。在三重缺失釀酒酵母菌株Δoch1 Δmnn1 Δmnn4中引入來自海棗曲霉的α-1，3-甘露糖苷酶后，酵母中檢測到更接近哺乳動物的糖鏈結構Man5GlcNAc2［38］。但是，由于酵母細胞壁中甘露糖殘基約占細胞壁的10%~20%，該工程酵母菌株中甘露糖外鏈的缺失，導致酵母細胞壁完整性缺失，造成嚴重的生長缺陷。研究發(fā)現(xiàn)，酵母中BEM4和BEM4下游基因RHO1過表達可以在一定程度上恢復Δoch1缺失株的生長缺陷［39］。其中Bem4 蛋白可能與細胞信號轉(zhuǎn)導途徑相關，Rho1 蛋白調(diào)節(jié)蛋白激酶C（Pkc1p）和細胞壁合成酶（β-1，3-葡聚糖合酶）。推測由于BEM4和RHO1的過表達增加了β-葡聚糖的合成，修復OCH1缺失造成的細胞壁合成缺陷。因此，通過表達酵母中細胞壁合成相關的基因或與β-1，3-葡聚糖合成的相關基因，在一定程度上能夠彌補菌株由于OCH1缺失造成的甘露糖鏈合成缺陷的問題。在畢赤酵母中破壞OCH1表達后，檢測到酵母細胞中主要糖鏈類型為Man8-12GlcNAc2，并且該基因的敲除未對酵母生長產(chǎn)生顯著影響［40］。造成這一差異的主要原因有2 點，一是由于與釀酒酵母相比，畢赤酵母中N-糖基化修飾位點減少，糖基化程度減弱，細胞壁中甘露糖含量低［11］，所以糖蛋白中甘露糖含量的減少對畢赤酵母細胞壁完整性的影響較小，二是由于在Δoch1缺失菌株中檢測到截短的Och1 蛋白活性，或許該蛋白的存在維持了缺失菌株正常生命活動［41］。之后，在該菌株中引入哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶基因，成功產(chǎn)生了復雜的唾液酸化糖蛋白［25］，這使畢赤酵母菌株在生產(chǎn)生物藥物方面擁有更大的潛力。

表2 有關酵母改造及產(chǎn)生的糖鏈類型

另外，也可以通過干擾LLO 的組裝來影響高甘露糖鏈的形成，LLO 的組裝在ER 中完成。如圖1 所示，ALG3基因編碼α-1，3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，負責在Dol-PP-GlcNAc2Man5的支鏈上添加1個α-1，3-Man，在酵母中該基因的敲除可以阻止PP-GlcNAc2Man6的合成，進而影響糖基轉(zhuǎn)移酶對底物的識別。在Δoch1缺失菌株中敲除ALG3基因后，在雙缺菌株中檢測到Man5GlcNAc2糖鏈結構［42］。另外在多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）中，同樣ALG11和ALG3敲除后檢測到糖鏈結構主要為Man3GlcNAc2。這說明通過干擾LLO 組裝的方法實現(xiàn)去糖基化具有可行性。

4 展望

1982 年，生物藥物這一概念被正式提出［1］，之后大量生物藥物的出現(xiàn)改變了許多疾病的治療方法。在眾多原核和真核細胞表達系統(tǒng)中，由于對酵母的基因組有深入的了解，酵母中簡便高效的基因編輯系統(tǒng)的構建［8］以及酵母可修飾蛋白質(zhì)等優(yōu)勢的存在，促使工程化酵母研究進程加速前進。為了消除酵母對蛋白獨特的N-高甘露糖修飾途徑，引入人源化的N-糖基化修飾途徑，已有學者展開了相關研究。目前，在畢赤酵母中已經(jīng)可以表達唾液酸化的糖蛋白［48］，這一成果使在酵母表達系統(tǒng)中產(chǎn)生人源化蛋白成為了現(xiàn)實。但是，在酵母中實現(xiàn)人源化類型的糖基化修飾仍然面臨著許多問題：①酵母中糖蛋白也參與細胞壁的合成和酵母生長代謝進程，酵母中糖基轉(zhuǎn)移酶的敲除破壞酵母細胞壁的完整性，影響酵母本身的正常生長發(fā)育，即難以平衡酵母生長狀況和人源糖基化修飾之間的關系；②工程酵母中改變糖鏈結構，造成后續(xù)糖基轉(zhuǎn)移酶、翻轉(zhuǎn)酶或糖苷酶等對底物識別能力降低，造成目的糖蛋白產(chǎn)生效率低下；③釀酒酵母作為最常用的一種酵母，仍然不能產(chǎn)生含有半乳糖或者唾液酸殘基的糖蛋白，限制了酵母表達系統(tǒng)的進一步發(fā)展。對酵母糖基化修飾進行人源化改造，使其產(chǎn)生更接近哺乳動物糖基化修飾結構，有望進一步提高酵母表達系統(tǒng)在生產(chǎn)治療蛋白方面的價值，拓展酵母作為細胞工廠的應用范圍。