黃精凍干片質量標準的建立及其提取物薯蕷皂苷元抗腫瘤活性研究

徐雨生，高明菊，趙寧東，黃再強，田迎秋，胡展育，余正勇

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，長沙 410128；2.湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國家重點實驗室，長沙 410125；3.文山學院三七醫(yī)藥學院，云南 文山 663000）

黃精（Polygonatum sibiricumDelar. ex Redoute）為百合科黃精屬多年生的草本植物，其根莖是藥用成分最多的部位，主要分布在中國南部熱帶以外的地方［1］。黃精的藥用歷史已有2 000 多年，是目前中國常用的中藥材之一。研究表明，黃精中含有很多對人體有利的成分，如薯蕷皂苷元、黃精多糖、強心苷、生物堿、氨基酸等［2，3］，薯蕷皂苷元有抗炎和抗病毒的藥理作用，黃精多糖有降血脂和血糖、抗動脈粥樣硬化的藥理作用，還有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用［4-6］。

目前黃精的開發(fā)利用現(xiàn)狀存在諸多問題［7］：野生資源枯竭并且質量不穩(wěn)定；人工栽培歷史悠久但技術落后；對黃精的采收和加工等缺少科學依據(jù)?；瘜W成分研究進展較明顯，但是藥效物質基礎不明確；藥品與保健品開發(fā)較少；行業(yè)規(guī)模與藥材價格走勢不明朗等問題［8］。薯蕷皂苷元和黃精多糖可能是黃精的質量標志性成分［9］，但這些成分的有效性還需要進一步探究。

中國歷代中醫(yī)藥典籍都有關于黃精及其炮制方法的記載，隨著現(xiàn)代技術的發(fā)展，許多優(yōu)良的炮制加工方法相繼產(chǎn)生，如壓力蒸氣消毒干燥法、微波干燥法、綜合評分干燥法等［10，11］。不同區(qū)域的黃精炮制加工各有其特點，在繼承黃精傳統(tǒng)加工工藝的同時，更需要不斷創(chuàng)新和研究，為推行黃精飲片“安全、穩(wěn)定、有效、可控”的質量生產(chǎn)管理規(guī)范化奠定基礎。隨著世界經(jīng)濟水平及人們生活水平的提高，消費者對冷凍干燥物資的需求量增大。近年來，電子計算機和傳感測量技術使冷凍干燥技術的發(fā)展進入新時期，冷凍干燥中藥飲片具有明顯的市場優(yōu)勢［12］。

目前，建立中藥材質量標準的方法主要有兩種：采用分析儀器建立質量標準，能夠相對較少地受個人主觀因素的干擾；傳統(tǒng)的人工經(jīng)驗判別法的優(yōu)點是能夠比較全面地反映與藥物療效相關中藥材的質量，缺點是易受個人主觀因素的干擾。中國雖然已經(jīng)在中藥質量控制和中藥質量評價等方面取得較大的進步，定量控制藥材的水平也在不斷提高［13］，但是總體水平還相對較低，與現(xiàn)代化還存在較大距離，需要進一步深入探究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所有樣品均為黃精凍干片的粉末，分別來自云南省文山壯族苗族自治州文山市（簡稱云南文山）、云南省麗江市（簡稱云南麗江）、安徽省六安市（簡稱安徽六安）、廣西省百色市（簡稱廣西百色）；氫氧化鈉、丙三醇（天津市風船化學試劑科技有限公司）；碘（成都市科隆化學品有限公司）；碘化鉀（上海市四赫維化工有限公司）；酚酞（上海市四赫維化工有限公司）；無水葡萄糖（北京世紀奧科生物技術有限公司）；蒽酮（上海申博化工有限公司）；濃硫酸（上海展云化工有限公司）；3，5 二硝基水楊酸（成都市科隆化學品有限公司）；甲醇、乙腈（均為色譜純，天津市大茂化學試劑廠）。

1.2 性狀鑒別

本試驗參照《中華人民共和國藥典》（2020 年版）（下文簡稱《中國藥典》），根據(jù)3 批樣品的形態(tài)、色澤、氣、味、質地考察。

1.3 薄層色譜鑒別

稱取黃精凍干片粉末1.0 g，放入錐形瓶內(nèi)，加入20 mL 70%的甲醇溶液，再加熱回流1 h，將處理好的樣品抽濾，濾液需蒸干；待完全蒸干后再用去離子水10 mL 沖洗剩余的殘渣，使殘渣完全溶解，在錐形瓶內(nèi)加入20 mL 正丁醇溶液，振蕩3 min，重復提取1 次，合并正丁醇液，蒸干后剩余的殘渣中加入1 mL 的甲醇溶液，使其溶解，待測。另外取凍干后的黃精對照藥材1.0 g，同法制成對照品溶液。再用薄層色譜法進行試驗，取供試品液和對照品液各10 μL，將其分別點在同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60~90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（5.0∶2.0∶0.1）作為展開劑，放入展開缸中展開，取出后晾干，用5%香草醛硫酸溶液噴在薄層板上，把薄層板放在烘箱中，溫度調(diào)到105 ℃，待薄層板有清晰的斑點顯示后，對其進行視檢即可。

1.4 顯微鑒別法

通過顯微鏡（尼康E400 型）對樣品進行照片采集。

1.5 水分檢測

將樣品盤放入水分測定儀內(nèi)，置零，在樣品盤中放入凍干后的黃精粉末5 g，記錄數(shù)據(jù)。計算出供試品的含水量（%）。

1.6 總灰分測定

按照《中國藥典》中有關總灰分的測定方法，取粉碎至細的黃精凍干片粉末2.0 g，放在灼燒到恒定重量的坩堝內(nèi)，稱量其重（要求準確至0.01 g），慢慢熾灼，隨時觀察。灼燒至完全炭化后，慢慢升高溫度到600 ℃左右，使灼燒后的黃精凍干粉末完全灰化到恒定的重量。最后根據(jù)殘渣重量，計算出供試品內(nèi)總灰分的含量。

1.7 醇溶性浸出物測定

按照《中國藥典》（通則2201 熱浸法）浸出物測定法進行測定。稱取黃精凍干片粉末2 g，置250 mL的錐形瓶中，加50%乙醇50 mL，密塞，稱重后靜置1 h，連接回流冷凝管微沸1 h，放冷取下錐形管，稱重后密塞，50%乙醇補足減重，搖勻，過濾，量取濾液25 mL 置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，105 ℃下干燥3 h 后，干燥器中冷卻30 min，精密稱重后計算即可。

1.8 總多糖含量的測定

1.8.1 對照品溶液的制備 105 ℃下干燥至恒重的無水葡萄糖對照品33 mg，置100 mL 容量瓶中，加水溶解并定容至刻度線，搖勻，即得。

1.8.2 標準曲線的繪制 量取葡萄糖標準品配制的溶液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL）至10 mL 具塞刻度試管，加去離子水至2.0 mL，搖勻，加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度線并混勻，冰水浴至冷，取出即可。按照紫外-可見分光光度法（通則0401），計算繪制標準曲線。

1.8.3 供試品溶液的制備 稱取4 個不同產(chǎn)地黃精凍干片粉末0.25 g，至圓底燒瓶中（60 ℃干燥至恒重），加80%乙醇150 mL 后加熱回流1 h（水浴），趁熱過濾，殘渣用80%熱乙醇洗滌3 次（每次10 mL），合并濾液，放冷后轉移至250 mL，加水至刻度線搖勻。精確量取上述混合溶液1 mL，置10 mL 具塞干燥試管，加去離子水至2.0 mL 后，再加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度線并混勻（以去離子水代替供試品為空白），于582 nm 波長下測定吸光度，計算黃精凍干片的總多糖。

1.9 薯蕷皂苷元含量的測定

1.9.1 波長的選擇 色譜柱：Hypersil ODSC-18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-超純水（75∶25，V/V）進行梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長是190~440 nm；檢測波長的選擇：將各對照品溶液進行高效液相掃描，測出對照品溶液的最大吸收值。

1.9.2 對照品溶液制備 稱取薯蕷皂苷元（批號為JS90124）1.08 mg，用50%乙醇溶液溶解、超聲處理至溶解，然后定容到2 mL，作為對照品，最后用0.45 μm 微孔濾膜過濾后備用，待HPLC 測定。

1.9.3 供試品溶液制備 稱取云南文山黃精凍干粉末1.000 g 于150 mL 具塞錐形瓶中，加50%乙醇溶液50 mL，密封，50 Hz 超聲儀中超聲處理30 min 后取出，放冷，用50%乙醇補足失重，振搖后過濾，濾液保留，通過0.45 μm 微孔濾膜即得供試品溶液。

1.9.4 樣品含量測定 稱取4 個不同產(chǎn)地的凍干黃精飲片粉末2 g，按照“1.9.3”的制備方法進行制備，依據(jù)上文所述的色譜條件進樣測定并計算薯蕷皂苷元的含量。

1.10 薯蕷皂苷元對3 種癌細胞的影響

以阿霉素為對照品，采用噻唑藍（MTT）法考察了黃精薯蕷皂苷元對A431（人表皮癌細胞）、H1975（人肺腺癌細胞）和Ramos（人B 淋巴細胞瘤細胞）的抗腫瘤活性。3 種細胞培養(yǎng)成熟后用酶聯(lián)檢測儀測定各孔吸光度，選擇570 nm 波長，以RPMI-1640 培養(yǎng)液做空白對照，測各孔的吸光度。細胞生長抑制率＝（對照組吸光度－試驗組吸光度）/對照組吸光度×100%。

2 結果與分析

2.1 性狀鑒別

由于4 個樣品中有2 個樣品來自同一省份，故選擇3 個來自不同省份的樣品。黃精凍干片性狀鑒別結果（圖1）顯示，本品的性狀為淡黃色至黃色的中空泡沫狀薄片，切片后切面為角質樣，有很多淡黃色的筋脈小點；氣微，味苦但是略回甜，嚼之具有黏性；質脆，易折斷。

圖1 3 批樣品的切片

2.2 薄層色譜鑒別

薄層色譜鑒別結果（圖2）顯示，在與黃精對照藥材色譜圖相對應的位置上，4 個產(chǎn)地的黃精凍干片均能顯示出相同顏色的斑點，重現(xiàn)性良好。

圖2 黃精凍干片薄層色譜圖

2.3 顯微鑒別

本品粉末為淡黃色至黃色。顯微鑒別結果（圖3）顯示，表皮細胞的外壁較厚，薄壁組織散有大量的黏液細胞，內(nèi)含的草酸鈣針晶束散在，針晶長18~88 μm。有很多的維管束散列，大多數(shù)為周木型。

圖3 黃精凍干粉末

2.4 含水量的測定

測定了4 個不同產(chǎn)地的黃精凍干片含水量（表1），其含水量均值為2.8%~4.7%，均沒有超過5.0%。根據(jù)試驗結果，可將本品含水量限度定為不得超過5.0%納入標準。

表1 不同產(chǎn)地黃精凍干片含水量 （單位：%）

2.5 總灰分含量的測定

根據(jù)測定所得殘渣重量，計算出本試驗中4 個不同產(chǎn)地的黃精凍干片的總灰分。結果（表2）顯示，4 個不同產(chǎn)地的黃精凍干片總灰分范圍為1.9%~3.4%（均沒有超過4.0%）。根據(jù)測定結果，可將本品總灰分限度不得超過4.0%納入標準。

表2 不同產(chǎn)地黃精凍干片總灰分含量 （單位：%）

2.6 醇溶性浸出物的測定

根據(jù)相關數(shù)據(jù)計算乙醇浸出物含量，結果（表3）顯示，4 個不同產(chǎn)地的黃精凍干片的醇溶性浸出物在72.19%~78.99%（均未低于70.0%）。根據(jù)測定結果，可將乙醇浸出物限度定為不低于70.0%納入標準。

表3 不同產(chǎn)地黃精凍干片乙醇浸出物含量（單位：%）

2.7 總多糖含量的測定

2.7.1 標準儲備液標準曲線的繪制 結果（圖4）顯示，線性方程為y=5.732 3x-0.033 3，r=0.998，結果表明無水葡萄糖在0.033~0.198 mg 范圍內(nèi)，線性關系良好。

圖4 標準儲備液的標準曲線

2.7.2 樣品含量的測定 測定了4 個不同產(chǎn)地的黃精凍干片中總糖的含量，結果（表4）顯示，其總糖都不低于7.0%。根據(jù)測定結果，可將本品總糖的限度定為不得少于7.0%納入標準。

表4 不同產(chǎn)地的黃精凍干片總多糖含量（單位：%）

2.8 薯蕷皂苷元含量的測定

2.8.1 波長的選擇 在最大吸收波長440 nm 處響應值較強，因此選擇測定波長為440 nm。

2.8.2 黃精薯蕷皂苷元對照品HPLC 色譜圖 用HPLC 檢測已制備好的對照品溶液，得到含有明顯薯蕷皂苷元主峰的色譜圖（圖5），圖5 中的峰1 為薯蕷皂苷元色譜。

圖5 黃精薯蕷皂苷元對照品HPLC 色譜圖

2.8.3 黃精薯蕷皂苷元供試品HPLC 色譜圖 用HPLC 檢測已制備供試品溶液，得到含有多條明顯鋒的高效液相色譜圖（圖6），其中含有對應對照品溶液的明顯薯蕷皂苷元峰，峰1 為薯蕷皂苷元。

圖6 黃精薯蕷皂苷元供試品HPLC 色譜圖

2.8.4 樣品含量測定 測定了4 個不同產(chǎn)地的黃精凍干片中薯蕷皂苷元的含量，結果（表5、表6）顯示，r=0.999 2，線性范圍為1.08~10.80 mg/mL，4 個不同產(chǎn)地的黃精經(jīng)該法凍干后薯蕷皂苷元都不低于0.18%。根據(jù)測定結果，可將本品薯蕷皂苷元的限度定為不得少于0.18%納入標準。

表5 不同產(chǎn)地黃精薯蕷皂苷元方程及其范圍

表6 不同產(chǎn)地黃精的薯蕷皂苷元含量

2.9 黃精提取物薯蕷皂苷元對3 種癌細胞的影響

試驗結果（表7）顯示，薯蕷皂苷元對A431（人表皮癌細胞）細胞抑制活性與阿霉素相當，即抗A431腫瘤活性較佳，但是對H1975（人肺腺癌細胞）、Ra?mos（人B 淋巴細胞瘤細胞）均無抗腫瘤活性，為后期開發(fā)純天然抗人表皮癌細胞新藥提供一定的試驗數(shù)據(jù)。

表7 薯蕷皂苷元的抗腫瘤活性（單位：L/（mol·cm））

3 討論

本試驗結果中4 個不同產(chǎn)地的黃精凍干片各種化學成分數(shù)值均在《中國藥典》規(guī)定范圍內(nèi)，說明此項研究可為后續(xù)研究凍干黃精的藥理活性、臨床應用優(yōu)勢等提供理論依據(jù)，同時也可為后續(xù)普通炮制黃精提供借鑒。

試驗發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黃精凍干片的水分、總灰分、醇溶性浸出物、總糖、薯蕷皂苷元含量存在一定差異，但測定結果在《中國藥典》規(guī)定范圍內(nèi)。4 個產(chǎn)地的凍干黃精的含水量平均值為3.80%，總灰分平均值為2.70%，醇溶性浸出物平均值為75.78%，總糖平均值為8.95%，薯蕷皂苷元含量不低于0.18%。與《中國藥典》要求相比，水分測定值雖然偏低，但在要求范圍內(nèi)，說明凍干后的黃精有一般凍干產(chǎn)品延長保存時間的優(yōu)點。前期較少文獻報道黃精凍干飲片的質量標準草案，因此，在撰寫黃精凍干片的質量標準草案中，建議黃精凍干片含水量不超過5.0%，總灰分不超過4.0%，醇溶性浸出物含量不少于70.0%，總糖不少于7.0%，薯蕷皂苷元含量不低于0.18%。黃精凍干飲片中薯蕷皂苷元含量差異不大，但是相較其他炮制方法，凍干黃精飲片粉末的薯蕷皂苷元含量較高，且薯蕷皂苷元抗A431 腫瘤活性較佳，為后期凍干黃精質量標準的研究及補充提供了一定的試驗依據(jù)。