液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜和水果中的赤霉素及高效氯氰菊酯

秦安麗，章程輝，王明月，張 群

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心/海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；2.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，?？?571101）

目前，檢測(cè)赤霉素（gibberellins，GA）多采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，而檢測(cè)高效氯氰菊酯（β-cyperme?thrin）多采用氣相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS，GC-MSMS）。 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB12/T 986—2020［1］、中國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2871—2015［2］和商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4257—2015［3］都采用液相串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)赤霉素，因?yàn)槌嗝顾厥莾?nèi)源性物質(zhì)之一，在植物中含量很少。質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性好，尤其適合痕量植物樣品的檢測(cè)。高效氯氰菊酯曾被認(rèn)為不適合用液相串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23200.8—2016［4］、GB/T 23200.113—2018［5］均用氣相質(zhì)譜法或串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)高效氯氰菊酯，而NY/T 761—2008［6］用氣相法檢測(cè)氯氫菊酯，但氯氫菊酯會(huì)降解成同分異構(gòu)體（順?lè)锤咝葰渚挣ゼ绊樂(lè)吹托葰渚挣ィ?，真正?duì)農(nóng)業(yè)起防治作用的只有順式高效氯氫菊酯和反式高效氯氫菊酯，用氣相法也能檢測(cè)出來(lái)。GB/T 20769—2008［7］收錄有順式氯氫菊酯的檢測(cè)方法，但沒(méi)有收錄赤霉素。赤霉素和高效氯氫菊酯在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，有關(guān)其毒理的研究多見(jiàn)報(bào)道，因此研究一個(gè)前處理簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、檢測(cè)線(xiàn)低、重現(xiàn)性好且能同時(shí)測(cè)定這2 種農(nóng)藥的方法很有必要。

本研究建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定蔬菜和水果中赤霉素和高效氯氰菊酯的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法。蔬菜、水果樣品用乙腈均質(zhì)提取，經(jīng)過(guò)鹽析分層，吸取提取液，用50%甲醇1∶1（V/V）互溶，乙腈與5 mmol/L 乙酸銨溶液進(jìn)行梯度洗脫分離，采用電噴霧正負(fù)離子源模式（ESI+、ESI-）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）采集數(shù)據(jù)，外標(biāo)法定量，離子比定性。

1 材料與儀器

1.1 主要試驗(yàn)材料與試劑

蔬菜、水果樣品購(gòu)于海南省?？谑惺卟怂l(fā)市場(chǎng)；高效氯氰菊酯（99.1%），購(gòu)于美國(guó)Cato Re?search Chemical Inc；赤霉素（99.0%），購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer Gmb H 公司；甲醇（色譜純），購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司Thermo Fisher Technology Co.，Ltd；乙酸（分析純）、甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純）、氯化鈉（分析純），購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；乙酸銨（分析純），購(gòu)于阿拉丁公司；N-丙基乙二胺（PSA），購(gòu)于深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司；石墨化炭黑（GCB），購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TripleQuad 4500 液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，AB SCIEX 公司；JJ500 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；XW-80A 渦旋混合器，海門(mén)其林貝爾公司；Milli-Q A10 超純水儀，美國(guó)Millipore 公司；GL-21M 落地式高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi Koki Co.，Ltd 公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：采用逐級(jí)稀釋法配 制 質(zhì)量 濃度 分別 為0.010、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/L 的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，過(guò)微孔濾膜（有機(jī)相，13 mm×0.22 μm）備用。

2.2 樣品處理

2.2.1 樣品制備 參考NY/T 761—2008 樣品制備方法，蔬菜按四分法打成漿，葡萄打成漿，香蕉樣品去皮取可食用部分，切碎打漿混勻，制成待測(cè)樣品，放入樣品瓶，置于-18 ℃冰箱中備用。

2.2.2 樣品提取 稱(chēng)取10.00 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL 離心管中，加入15.0 mL 含乙腈溶液，1 500 r/min 渦旋，振蕩2 min；加入5.0 g NaCl 渦旋1 min，然后以20 000 r/min-4 ℃離心5 min。

2.2.3 樣品凈化 吸取1.00 mL提取上層液放入2 mL容量瓶?jī)?nèi)，用50%甲醇定容至刻度，進(jìn)行1∶1（V/V）稀釋?zhuān)^(guò)微孔濾膜（有機(jī)相，13 mm×0.22 μm），待上機(jī)檢測(cè)。

2.3 儀器條件

1）超高效液相色譜條件。色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。流動(dòng)相及流量見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

2）質(zhì)譜條件。質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜條件

MRM 監(jiān)測(cè)離子見(jiàn)表3。

表3 赤霉素和高效氯氰菊酯的質(zhì)譜條件參數(shù)

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件優(yōu)化

色 譜 柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm，2.1 mm×50 mm），在流速為0.30 mL/min 條件下，乙腈-5 mmol/L 乙酸銨溶液作為洗脫液時(shí)，目標(biāo)化合物離子化程度比乙腈-甲醇、乙腈-水作為洗脫液時(shí)效果好。在此測(cè)定條件下，赤霉素最長(zhǎng)保留時(shí)間為3.19 min，高效氯氰菊酯最長(zhǎng)保留時(shí)間為5.31 min。

3.2 不同提取劑對(duì)赤霉素和高效氯氰菊酯回收率的影響

研究比較了乙腈、0.1%甲酸乙腈、1.0%甲酸乙腈、0.1%乙酸銨乙腈、1.0%乙酸銨乙腈5 種提取劑對(duì)普通白菜、豇豆、葡萄、香蕉中赤霉素和高效氯氰菊酯的提取效果（表4）。

由表4 可知，加酸后的乙腈作提取劑時(shí)，赤霉素的回收率提高了，但高效氯氰菊酯的回收率反而降低。因?yàn)槌嗝顾匾兹苡谒嵝原h(huán)境中，乙腈為提取劑時(shí)兩者回收率均達(dá)到方法要求?；诜椒ê?jiǎn)便考慮，最終選擇純乙腈作為提取劑，而且乙腈為提取劑對(duì)普通白菜、豇豆、葡萄、香蕉中赤霉素和高效氯氰菊酯在儀器上的響應(yīng)和峰型都達(dá)到理想效果（圖1）。高效氯氰菊酯在儀器上出現(xiàn)2 個(gè)峰型，是因?yàn)楦咝惹杈挣蓪?duì)外消旋體混合物，其順?lè)幢燃s為2∶3。

圖1 赤霉素（1）和高效氯氰菊酯（2）在各個(gè)基質(zhì)的加標(biāo)定量離子色譜圖

表4 不同提取劑對(duì)赤霉素和高效氯氰菊酯的回收率 （單位：%）

3.3 不同凈化方式對(duì)赤霉素和高效氯氰菊酯回收率的影響

QuEChERS 前處理方法常用的凈化劑有PSA、C18、GCB 等［8，9］，其中PSA 主要用于除去樣品中的糖類(lèi)、有機(jī)酸、金屬離子等，C18 用以除去試樣中脂類(lèi)和蛋白質(zhì)等成分，GCB 對(duì)樣品中色素有較強(qiáng)的吸附凈化能力［10，11］。本研究分別以普通白菜、豇豆、葡萄和香蕉為基質(zhì)，對(duì)凈化方法和稀釋方法進(jìn)行了優(yōu)化（表5）。

由表5 可知，樣品采用稀釋的方法時(shí)2 種農(nóng)藥的回收率為80.0%~108.0%；采用PSA、GCB 2 種凈化方式時(shí)，2 種農(nóng)藥的回收率為80.7%~98.9%?；诃h(huán)保節(jié)能考慮，本試驗(yàn)選擇稀釋的方法，以減小基質(zhì)效應(yīng)。

表5 不同凈化方式對(duì)赤霉素和高效氯氰菊酯的回收率 （單位：%）

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍和檢出限 將上述配制成質(zhì)量濃度0.010、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/kg 的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照“3.1”所述LCMS/MS 儀器優(yōu)化條件上機(jī)檢測(cè)，以待測(cè)化合物定量離子的峰面積y為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到2 種農(nóng)藥的線(xiàn)性方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，赤霉素和高效氯氫菊酯在0.010~0.400 mg/kg 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)的峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系（R2>0.999），線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表6。

在空白基質(zhì)中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)檢測(cè)，以3 倍信噪比（S/N≥3）計(jì)算該方法的檢出限（LODs），以10 倍信噪比（S/N≥10）計(jì)算該方法的定量下限（LO?Qs）［12，13］，相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6 可知，2 種農(nóng)藥在各個(gè)基質(zhì)殘留的檢出限（LODs）范圍均為0.001 mg/kg，定量限（LOQs）范圍均為0.004 mg/kg，該方法的靈敏度可滿(mǎn)足蔬菜水果中赤霉素和高效氯氫菊酯殘留的檢測(cè)要求。

表6 2 種農(nóng)藥在4 種基質(zhì)中的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

3.4.2 回收率和精密度 取空白普通白菜、豇豆、葡萄、香蕉樣品，按0.040、0.100、0.400 mg/kg 3 個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，按“2.2”進(jìn)行前處理，每個(gè)水平測(cè)定6 次，對(duì)其測(cè)定值進(jìn)行回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）計(jì)算，其結(jié)果見(jiàn)表7。由表7 可知，2 種農(nóng)藥的回收率為80.0%~112.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.06%~13.58%。

表7 2 種農(nóng)藥在基質(zhì)中的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本研究所建立的方法對(duì)普通白菜、豇豆、葡萄、香蕉等樣品共20 份進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，有2 個(gè)普通白菜檢出高效氯氰菊酯值分別為2.70 mg/kg 和5.71 mg/kg，其他未發(fā)現(xiàn)有赤霉素和高效氯氰菊酯農(nóng)藥檢出。其原因可能是普通白菜容易生蟲(chóng)，豇豆沒(méi)有檢出是因?yàn)楹Ｄ鲜〗陙?lái)對(duì)豇豆管理比較嚴(yán)格，海南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳對(duì)豇豆從種到收都進(jìn)行嚴(yán)格管控和質(zhì)量安全技術(shù)指導(dǎo)，種植技術(shù)也日益成熟。在葡萄和香蕉中沒(méi)有檢出是因?yàn)榉N植技術(shù)成熟及目前種植多為規(guī)模化種植，基地在栽培技術(shù)及農(nóng)藥噴施管理方面相比種植散戶(hù)更加規(guī)范，因此在抽檢的10 個(gè)樣品中沒(méi)有檢出。

4 小結(jié)與討論

QuEChERS 是當(dāng)前果蔬農(nóng)藥殘留分析中最前沿的前處理方式，其原理是利用凈化劑與試樣中雜質(zhì)間的互相作用，吸附雜質(zhì)而達(dá)到凈化的目的。其主要操作步驟為：樣品經(jīng)乙腈提取，氯化鈉和無(wú)水硫酸鎂鹽析分層，PSA 吸附凈化，過(guò)膜得待測(cè)液。本研究基于普通白菜、豇豆、葡萄和香蕉4 種基質(zhì)，對(duì)QuEChERS 方法進(jìn)行了優(yōu)化。首先，以乙腈為提取劑，只加氯化鈉鹽析分層，不加無(wú)水硫酸鎂，結(jié)果表明農(nóng)藥回收率符合要求，同時(shí)避免了加無(wú)水硫酸鎂會(huì)發(fā)熱結(jié)塊、難混勻且使一些不耐熱農(nóng)藥降解的情況發(fā)生。其次，對(duì)凈化劑進(jìn)行選擇。凈化時(shí)加200 mg PSA 和100 mg GCB，雖然能夠減少樣品中糖類(lèi)、有機(jī)酸、色素等成分，干擾物質(zhì)的減少有利于降低方法檢出限，提高試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度，但通過(guò)稀釋的方式也可以達(dá)到相同的效果。而PSA 和GCB 商業(yè)試劑包貴，批樣處理消耗大，成本高，不適合一般的樣品檢測(cè)。基于環(huán)保和提高工作效率考慮，采用了稀釋降低基質(zhì)效應(yīng)減少干擾物的方法。

本研究以?xún)?yōu)化的QuEChERS 為前處理方式，樣品經(jīng)乙腈提取，50%甲醇1∶1（V/V）稀釋?zhuān)Y(jié)合LCMS/MS 法對(duì)普通白菜、豇豆、葡萄、香蕉中赤霉素和高效氯氰菊酯同時(shí)進(jìn)行定性定量分析。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量，在0.010~0.400 mg/L 范圍內(nèi)，赤霉素和高效氯氰菊酯線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.999。方法平均回收率為80.0%~112.1%，RSD為1.06%~13.58%；檢出限為0.001 mg/kg，定量限為0.004 mg/kg。該方法前處理操作便捷、試劑消耗少，精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度均符合殘留試驗(yàn)要求，可為同時(shí)測(cè)定蔬菜和水果中的赤霉素和高效氯氰菊酯殘留提供方法參考。