甘藍與甘藍型油菜雜交胚挽救技術研究

楊紅麗，徐學忠，胡靖鋒，蘭 梅，張麗琴，和江明，宋 爽

（云南省農業(yè)科學院，a.園藝作物研究所；b.國家蔬菜改良中心云南分中心；c.離退休處，昆明 650205）

甘藍（Brassica oleraceaL.）是中國重要的蔬菜作物，在全國各地均有栽培，甘藍根腫病大面積的發(fā)生導致甘藍品質和產量大幅度降低，給生產帶來嚴重的經濟損失，選育抗根腫病甘藍品種是防治的重要途徑之一。目前市場上用的抗根腫病甘藍品種多為國外蘿卜胞質雄性不育品種，對推廣品種實行技術壟斷，使產業(yè)發(fā)展受制于國外［1-3］。解決這一問題的有效方法是尋找和創(chuàng)制細胞質雄性不育的恢復系，目前，尚未發(fā)現在甘藍類蔬菜中存在細胞質雄性不育恢復系，因此，迫切需要從其他作物中導入恢復基因，創(chuàng)制出甘藍類蔬菜細胞質雄性不育恢復系，前人利用甘藍型油菜細胞質雄性不育恢復系已經成功創(chuàng)制并用于雜交種生產［4］。

為了拓寬育種材料的遺傳背景，許多學者將物種間的遠緣雜交作為主要手段，對植物性狀進行有目的的改良和優(yōu)化。雜交的不親和性及雜種的不育性是遠緣雜交的兩大瓶頸，常規(guī)人工雜交較難獲得成功［5-9］。在十字花科作物中，前人利用胚挽救技術克服遠緣雜交中幼胚死亡或敗育的問題已取得顯著成績［10-15］。甘藍和甘藍型油菜遠緣雜交時，采用常規(guī)的雜交方法無法克服雜種胚的敗育得到雜交種，本研究通過胚挽救試驗，在胚敗育之前取材子房和胚株進行離體培養(yǎng)，最終獲得雜合的離體培養(yǎng)植株，目的旨在利用含雄性不育恢復基因的甘藍型油菜來恢復雄性不育甘藍材料的育性。通過對甘藍與甘藍型油菜雜交后胚挽救培養(yǎng)取材時間與培養(yǎng)基配比的比較，篩選出甘藍與甘藍型油菜雜交后胚挽救的適宜取材時間和培養(yǎng)基，為提高雜種獲得率，有益基因轉移提供理論依據和實際應用技術。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍雄性不育系GL16047、甘藍型油菜N18008均由云南省農業(yè)科學院園藝作物研究所十字花科課題組提供。

1.2 試驗方法

試驗方法參考扈新民等［16］在甘藍與蘿卜屬間雜交及其胚挽救技術優(yōu)化的試驗方法，試驗于2018年4 月在云南省農業(yè)科學院園藝作物研究所試驗基地進行，甘藍與油菜分別與其他作物隔離種植，常規(guī)栽培管理。以甘藍雄性不育系GL16047 為母本、油菜自交系N18008 為父本配制屬間雜交組合，蕾期套袋，人工授粉。在雜交前2~3 d 摘除父、母本花序上已開放的花朵，套袋隔離。授粉后套袋隔離，嚴格防止父本以外的花粉污染，雜交后分別取材進行子房培養(yǎng)和胚珠培養(yǎng)。

1.2.1 授粉后不同時間取樣對離體子房發(fā)育的影響 分別取授粉后第5、6、7、8、9、10 天的子房，先用75%的乙醇消毒子房50~60 s 和10%次氯酸鈉消毒15 min，然后再用無菌水沖洗3 次，沖洗后將子房浸泡于無菌水中3~5 min，最后接種在A4 培養(yǎng)基（MS+1.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/ L）上。每個處理接種10 個子房，重復3次，共接種180 個子房。接種子房的培養(yǎng)基置于溫度（24±2）℃、光照度1 500 lx、每天光照12 h 的環(huán)境中培養(yǎng)，接種30 d 后剝出幼胚繼續(xù)培養(yǎng)，最后統(tǒng)計出苗情況，隔15 d 更換一次培養(yǎng)基。

1.2.2 不同激素處理對離體子房發(fā)育的影響 取授粉后第8 天的子房，在超凈工作臺進行表面消毒（消毒方法同“1.2.1”），分別接種在以下培養(yǎng)基：A1 培養(yǎng)基（MS+0.6 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、A2 培養(yǎng)基（MS+0.8 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、A3培養(yǎng)基（MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、A4 培養(yǎng)基（MS+1.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）。每種培養(yǎng)基接種10 個子房，重復3 次，共接種120 個子房，接種30 d 后剝出幼胚繼續(xù)培養(yǎng)，最后統(tǒng)計出苗情況，隔15 d 更換一次培養(yǎng)基。接種的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中的光溫條件同上。

1.2.3 授粉后不同取樣時間對離體胚珠發(fā)育的影響 分別取授粉后第14、16、18、20、22、24 天的子房，在超凈工作臺進行表面消毒（消毒方法同“1.2.1”），無菌條件下在濾紙上用鑷子和解剖刀剝離出胚珠，將發(fā)育正常色澤發(fā)亮的胚珠接種于B4 培養(yǎng)基（MS+7.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L），每個取樣天數接種15 個胚珠，重復3 次，共接種270 個胚珠。接種的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中的光溫條件同上，接種30 d 后開始調查胚珠出胚情況。

1.2.4 不同激素處理對離體胚珠發(fā)育的影響 取授粉后20 d 的子房，在超凈工作臺進行表面消毒（消毒方法同“1.2.1”），無菌條件下在濾紙上用鑷子和解剖刀剝離出胚珠，將發(fā)育正常色澤發(fā)亮的胚珠分別接種于以下培養(yǎng)基：B1 培養(yǎng)基（MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、B2培養(yǎng)基（MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、B3 培養(yǎng)基（MS+5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、B4 培 養(yǎng) 基（MS+7.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）。每種培養(yǎng)基接種15 個胚珠，重復3 次，共接種180 個子房，接種的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中的光溫條件同上。

2 結果與分析

2.1 授粉后不同取樣時間對離體子房發(fā)育的影響

從表1 可以看出，授粉后第5 天子房培養(yǎng)出胚率為0%，授粉后第6 天、第10 天子房培養(yǎng)出胚率相同，為3.3%，授粉后第7 天、9 天子房培養(yǎng)出胚率相同，為6.7%，授粉后第8 天子房培養(yǎng)出胚率為10.0%，授粉后第8 天的出胚率最高。試驗結果表明，授粉后不同時間取樣培養(yǎng)對雜種胚的發(fā)育影響很大，離體子房培養(yǎng)的取樣時間不是越早越好，授粉后第5 天取樣，子房生長量小，出胚率為0；授粉后第10 天取樣，隨授粉后天數的增加，子房生長量逐漸變小，雜種核和卵細胞的代謝不協(xié)調，出胚數降低；離體子房培養(yǎng)適宜的取樣時間為授粉后第8 天，不同天數取樣離體子房培養(yǎng)的出胚率差異明顯。

表1 授粉后不同取樣時間對離體子房發(fā)育的影響

2.2 不同激素處理對離體子房發(fā)育的影響

從表2 可以看出，取授粉后第8 天的子房接種，A1 培養(yǎng)基的出胚率為3.3%，A2、A4 培養(yǎng)基的出胚率為6.7%，A3 培養(yǎng)基的出胚率為10.0%。試驗結果表明，在胚培養(yǎng)中，適宜的激素處理可提高雜種胚獲得數，對離體子房的發(fā)育有明顯的促進作用，1.0 mg/L 6-BA 對出胚有明顯的促進作用，濃度過低（0.6~0.8 mg/L）出胚數少，濃度過高（1.2 mg/L）對出胚有抑制作用，出胚率降低。A3 培養(yǎng)基的出胚率最高，不同培養(yǎng)基之間的出胚率差異明顯。

表2 不同激素處理對離體子房發(fā)育的影響

2.3 授粉后不同取樣時間對離體胚珠發(fā)育的影響

從表3 可以看出，不同取樣時期對胚珠出胚率有直接影響，授粉后第14 天胚珠培養(yǎng)出胚率為0，授粉后第16 天、第24 天胚珠培養(yǎng)出胚率相同，為2.2%，授粉后第18 天胚珠培養(yǎng)出胚率為11.1%，授粉后第20 天胚珠培養(yǎng)出胚率為15.5%，授粉后第22天胚珠培養(yǎng)出胚率為8.9%。試驗結果表明，胚珠培養(yǎng)取樣時間很重要，取樣時間過早，種胚過小脫離母體后離體培養(yǎng)難度較大不容易存活，出胚率低；取樣時間過遲，胚珠發(fā)育開始退化，出胚率降低，在胚珠發(fā)育到一定時期但未開始退化前取樣，才能取得較好的效果；第20 天取樣的出胚率最高，不同天數取樣胚珠培養(yǎng)的出胚率差異明顯。

表3 授粉后不同取樣時間對離體胚珠發(fā)育的影響

圖1 是GL16047×N18008 離體胚珠培養(yǎng)情況，A圖是離體胚珠培養(yǎng)，成活胚增殖分化60 d 的生長情況；B 圖是離體胚珠培養(yǎng)，增殖生長成幼苗90 d 的生長情況；C 圖是離體胚珠培養(yǎng)，生長成獨立植株，120天煉苗移栽的生長情況。

圖1 GL16047×N18008 離體胚珠培養(yǎng)情況

2.4 不同激素處理對離體胚珠發(fā)育的影響

從表4 可以看出，取授粉后第20 天的子房進行離體胚珠培養(yǎng)，B1、B2、B3、B4 培養(yǎng)基上的出胚率分別為2.2%、6.7%、13.3%、0%，B3 培養(yǎng)基的出胚率最高；6-BA 濃度過高和過低都達不到理想的效果，只有適量才能達到最佳效果。試驗結果表明，適宜胚珠培養(yǎng)的6-BA 濃度為5.0 mg/L，不同培養(yǎng)基之間的出胚率差異明顯。

表4 不同激素處理對離體胚珠發(fā)育的影響

總的看來，甘藍與甘藍型油菜的雜交胚珠培養(yǎng)在雜種出胚率上明顯優(yōu)于子房培養(yǎng)，子房培養(yǎng)的雜種胚與胚珠培養(yǎng)的雜種胚發(fā)育存在差異，子房培養(yǎng)的雜種胚增殖慢，生長弱，不易得到再生植株，胚珠培養(yǎng)出的雜種胚增殖快，生長勢強，容易獲得再生植株。

3 小結與討論

遠緣雜交是對作物進行遺傳改良的重要途徑，胚挽救在十字花科植物遠緣雜交中應用廣泛。為恢復雄性不育甘藍的育性，通過雜交，利用含恢復基因的甘藍型油菜恢復雄性不育甘藍的育性，使甘藍和甘藍型油菜的優(yōu)良特性聚合，選育出高產、優(yōu)質和抗根腫病的甘藍新品種，滿足生產需求。

十字花科作物中不同物種間胚挽救胚齡大小選擇不同，胚齡大小對胚珠培養(yǎng)的影響最大，一般來說胚齡越小則要求的培養(yǎng)條件越復雜。在本試驗胚珠培養(yǎng)中，胚珠培養(yǎng)最佳取樣時間以授粉后第20 天為宜，過早或過晚取樣胚珠出胚率降低，胚成活最短時間在授粉后第16 天，超過24 d 取樣，胚珠發(fā)育開始退化，出胚率降低。究其原因，種胚過小脫離母體后離體培養(yǎng)難度較大不容易活，可能是雌雄配子的結合能力較差，遠緣雜交種受精后期異源遺傳物質的導入致使胚珠內遺傳不協(xié)調，胚容易出現敗育現象，這與扈新民等［16］甘藍與蘿卜屬間雜交及其胚挽救技術優(yōu)化的結論相似。

在本試驗中，NAA、6-BA 兩種激素使用對離體子房和胚珠的發(fā)育和形成起到很好的促進作用，子房培養(yǎng)其中以MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L 組合效果最好，胚珠培養(yǎng)以MS+5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L 組合效果最好。

在本試驗子房培養(yǎng)中，授粉后的離體時間對雜種胚的發(fā)育有很大影響，過早或過晚取樣對出胚率都有影響。授粉后第5 天取樣進行離體子房培養(yǎng)，子房生長量小，出胚數少，其原因可能是細胞分裂素和生長素提供適宜的營養(yǎng)環(huán)境及發(fā)育的光溫條件可能會降低雜種核和卵細胞的這種代謝的不協(xié)調性；授粉后第10 天取樣進行離體子房培養(yǎng)，出胚數減低，是由于隨著授粉后天數的延長，雜種核和卵細胞的代謝不協(xié)調對雜種胚發(fā)育的影響增大所致，這與戴林建等［17］油菜與蕓芥屬間雜種離體子房和胚培養(yǎng)研究的結論一致。甘藍與甘藍型油菜種間雜種的獲得為有益的基因交換和恢復雄性不育甘藍的育性找到了途徑。