褶皺臂尾輪蟲土池大規(guī)模培育中酵母維生素替代雞糞的應用效果

朱天，徐世陳，蔡萌，劉洋，韓萃，陳德芝，楊家新*

（1.南京師范大學海洋科學與工程學院，江蘇 南京 210023；2.射陽誠信長江蟹生態(tài)育苗場，江蘇 鹽城 224000）

褶皺臂尾輪蟲（）因其體型小，游動緩慢，且能在短時間內(nèi)進行快速培育，使其成為許多海產(chǎn)經(jīng)濟動物的開口餌料。自2001年以來，在我國沿海地區(qū)，利用雞糞為基肥并結合其他外源物和雞糞追肥培養(yǎng)餌料輪蟲的土池生態(tài)育苗模式，已經(jīng)成為我國河蟹育苗餌料生產(chǎn)的主推模式。輪蟲主要以微藻為食，在底泥中的輪蟲休眠卵受溫度誘導催發(fā)后，在合適的微藻密度下，輪蟲的種群密度能夠在較短的時間內(nèi)快速增長。雞糞因其富含大量氮、磷等生物基本元素，能夠有效地提高池塘的初級生產(chǎn)力，促進微藻的生長。因此，雞糞常常作為輪蟲大規(guī)模培育中培育池的主要基肥。然而，由雞糞介導的氮磷輸入易導致水體的富營養(yǎng)化，且在高濃度的氮磷脅迫下，輪蟲的生長與繁殖也會受到負面影響，從而影響輪蟲的產(chǎn)量。因此，需要一種更為清潔、高效的施肥/追肥方式來優(yōu)化土池培育輪蟲。

通過培養(yǎng)微藻喂養(yǎng)輪蟲的方式，很難在輪蟲大規(guī)模培育中支撐起輪蟲的攝食需求，因此需要與其他營養(yǎng)物相結合來實現(xiàn)輪蟲的規(guī)?；嘤Ｃ姘湍父缓鞍踪|(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種廣泛使用且極具潛力的輪蟲飼料。酵母的含氮量較低，將酵母進行活化后可用于輪蟲的連續(xù)培養(yǎng)，且不易造成水體污染。因此，酵母可以作為輪蟲的補充飼料用于投喂，減少培育池內(nèi)用于培養(yǎng)微藻的雞糞投入量。

此外，在輪蟲大規(guī)模生產(chǎn)中，輪蟲達到高峰期后，時常出現(xiàn)“種群崩潰”現(xiàn)象，嚴重影響了輪蟲產(chǎn)量與穩(wěn)定性。針對這一現(xiàn)象，一些學者認為添加適量的維生素有利于防止輪蟲的種群崩潰，提高輪蟲的產(chǎn)量。目前常用于輪蟲培育的維生素主要有維生素E（V）、維生素C（V）、維生素B12（V）等，維生素與酵母混合投喂能夠有效地使其在輪蟲體內(nèi)富集?，F(xiàn)參考國內(nèi)外文獻，選用V、V和V3 種維生素，制定合適的添加量，與酵母制成新型投喂品，對輪蟲培育池追肥，并與使用雞糞追肥的培育方式進行比較，探究酵母維生素在輪蟲培育池實際生產(chǎn)中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 池塘

試驗地位于江蘇省鹽城市射陽誠信長江蟹生態(tài)育苗場，選擇2 口土塘（PA、PB）作為輪蟲培育池。面積均為7 m×35 m，平均深度均為1.5 m，底質(zhì)均為黏性土壤。分別在2 口池塘的上風口、下風口和池塘中央設置3 個采樣點。PA 塘、PB 塘的水源均為經(jīng)過過濾處理的天然海水。使用前對2 口池塘清塘消毒，潑灑質(zhì)量濃度為30～50 g/m的漂白粉，暴曬2～3 d 后投入使用。其中PA 塘使用維生素和酵母混合物進行追肥，PB 塘使用發(fā)酵雞糞追肥。

1.2 酵母維生素混合物

PA 塘、PB 塘均以雞糞為基肥，并人工接種小球藻。PA 塘培育過程中，通過觀察其浮游動物和微藻的種群密度變化，使用酵母維生素混合物追肥1 次。酵母維生素混合物配方：酵母（60 kg/hm，安琪酵母股份有限公司）和水、酵母、紅糖（100∶10∶1）攪拌15 min 后，將其置于陰涼處活化30 min，取上清液與維生素混合。維生素添加量為：V100 g（鄭州中牧飼料有限公司公司生產(chǎn)）、V200 g（強勝飼料有限公司生產(chǎn)）、V200 g（強勝飼料有限公司生產(chǎn)）。PB 塘同日使用發(fā)酵雞糞追肥1 次，用量為60 m/hm。

1.3 樣品采集

采樣時間固定為每日08：00，使用13 號、25 號浮游生物網(wǎng)采集輪蟲和浮游植物進行定性定量分析。采集10 L 水樣，過濾濃縮至50 mL，制成混合水樣。水溫（WT）、溶解氧（DO）、pH 值、電導率（Cond）、鹽度（SAL）、葉綠素a（Chl-a）采用多參數(shù)YSI 水質(zhì)分析儀測定和?，攑H 計進行現(xiàn)場測定。使用HACH DR 900 分析儀配合DBR 200 消解器測定水體的銨態(tài)氮（NH-N）和總磷（TP）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析方法

使用SPSS 21.0、R 軟件進行數(shù)據(jù)檢驗和池塘環(huán)境因子的主成分分析（PCA）。采用單因素方差分析（ANOVA），對輪蟲生命表參數(shù)和種群增長參數(shù)進行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊性，則對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，組間多重比較采用Turkey 檢驗，對于不符合方差齊性的數(shù)據(jù)，使用Tamhane’s T2 檢驗進行多重比較。使用Origin 2019b 繪圖。

2 結果與分析

2.1 浮游生物

檢測輪蟲培育池的浮游植物種類，有利于分析培育池內(nèi)輪蟲餌料的組成以及水環(huán)境。輪蟲高峰期內(nèi)，培育池內(nèi)共檢測出藻類5 門9 種（表1）。輪蟲培育前期（1～4 d），池塘的藻類組成主要以綠藻（小球藻）、硅藻（中華盒形藻、格式圓篩藻）和黃藻（海綠球藻）為主，其中小球藻為人工接種的藻種；培育后期（7～10 d），2 口池塘除小球藻外，裸藻（尖尾裸藻、靜裸藻）出現(xiàn)的頻次較高。

表1 培育池內(nèi)浮游植物種類和出現(xiàn)頻次①

續(xù)表

2.2 輪蟲密度與攜卵率

輪蟲種群密度和攜卵率變化見圖1（a）（b）。PA 塘的輪蟲初始密度（55.25±2.82）ind./mL 與PB塘（55.00±2.47）ind./mL 相近。試驗第2 天，對2口池塘進行追肥，PA 塘輪蟲密度在追肥1 d 后（第3天）明顯增長，輪蟲密度達到峰值（66.5±4.18）ind./mL，此后密度有所下降，在培育期的3～10 d，PA 塘輪蟲密度均顯著高于PB 塘（P<0.05）[圖1（a）]。輪蟲的攜卵率代表了輪蟲種群的繁殖能力，由圖1（b）可見，試驗1～2 d，2 口池塘內(nèi)輪蟲攜卵率并無顯著差異，而當使用不同肥料進行追肥后，PA 塘的輪蟲攜卵率顯著高于PB 塘（P<0.05），此后5～7 d PA 塘的輪蟲攜卵率顯著高于PB 塘（P<0.05），8～10 d 2 口塘輪蟲攜卵率無顯著差異（P>0.05）。

圖1 輪蟲種群密度和攜卵率變化

2.3 環(huán)境因子主成分分析

試驗期間對PA 塘和PB 塘理化因子每日檢測，其變化范圍見表2。使用主成分分析來實現(xiàn)對兩池環(huán)境因子的時空變化的可視化。用于解釋主成分的前2 個變量（PC1，PC2）用于繪制二維散點圖，其結果見圖2（a）（b）。PA 塘池塘環(huán)境因子[圖2（a）] 的前2 個主成分解釋了總變量的90.88%，PC1 解釋了83.27%，PC2 解釋了7.61%。培育池1～3 d，4～6 d，7～10 d 這3 個階段擁有不同的水環(huán)境主成分。其中DO 和NH-N 在PC1 上具有較高的特征值，分別為0.96 和-0.15；Cond、SAL 和NH-N在PC2 上具有較高的絕對特征值，其特征值分別為0.88，0.33 和-0.31。PB 池池塘環(huán)境因子[圖2（b）]的前2 個主成分解釋了總變量的88.25%，PC1 解釋了59.27%, PC2 解釋了28.98%。根據(jù)圖2（b），可以將培育池的水環(huán)境分為1～6 d 和7～9 d 2 個階段，NH-N、DO 和SAL 在PC1 上擁有較高的特征值，分別為-0.73，0.61 和-0.24；NH-N、DO 和Cond 在PC2 上具有較高的特征值，分別為-0.69，-0.67 和0.24。

圖2 環(huán)境因子主成分分析

表2 2 口池塘水質(zhì)環(huán)境因子的變化范圍

2.4 輪蟲密度與環(huán)境因子相關性分析

通過對輪蟲密度與池塘環(huán)境因子之間的相關性分析發(fā)現(xiàn)，影響PA 塘輪蟲密度的主要環(huán)境因子為pH值、Chl-a 和NH-N，Pearson 相關性系數(shù)分別為0.64、-0.72和0.83；影響PB 塘輪蟲密度的主要因子為DO 和TP，其Pearson 相關性系數(shù)分別為-0.63 和0.76（表3）。

表3 輪蟲密度與環(huán)境因子間相關性分析①

3 討論

隨著中華絨螯蟹集約化育苗產(chǎn)業(yè)的擴大，溞狀幼體短期內(nèi)對輪蟲的集中需求，導致了對生物餌料輪蟲的大量需求。大規(guī)模培育輪蟲的過程中，輪蟲的種群密度受到食物濃度、環(huán)境因子以及營養(yǎng)水平等多種因素的協(xié)同影響。不同的餌料密度會導致不同的輪蟲種群增長；此外，不同水平的鹽度、WT、DO、NH-N 和TP 也會影響輪蟲的種群密度。因此，2 種投喂方式對土池輪蟲培育的影響，應當從多個方面考慮。

雞糞的匯入，能夠為池塘提供大量的氮磷等基本元素，增加水體的初級生產(chǎn)力，從而促進藻類的生長，以供輪蟲攝食。微藻作為輪蟲的基礎餌料，是天然水體中輪蟲的主要食物與營養(yǎng)來源。區(qū)別于雞糞施肥促進藻類生長以喂養(yǎng)輪蟲的間接培育方式，酵母可被輪蟲攝食，且含氮量極低，在輪蟲的連續(xù)培養(yǎng)中，不易造成水體污染，這2 種施肥方式，也會導致不同的水環(huán)境與浮游植物組成結構改變。研究表明，輪蟲具有攝食選擇性，在綠藻、硅藻和裸藻混合的水環(huán)境中，輪蟲主要以攝食綠藻（小球藻，微綠球藻等）為主。其中，海水小球藻富含輪蟲所需的各類營養(yǎng)以及豐富的高價不飽和脂肪酸（HUFAs），能夠強化輪蟲的營養(yǎng)價值，被認為是最適合用于培養(yǎng)輪蟲的藻類之一。因此，在土池培育中，小球藻常以人工接種的方式用于投喂輪蟲。該研究的結果中，PB 塘較PA 塘的浮游植物組成更為豐富，而多種藻類共存的水環(huán)境不利于單一藻種的生長。因此，使用酵母與維生素進行追肥相比于雞糞追肥，在培育池浮游植物的組成結構上更加有利于培育輪蟲。

小球藻與酵母是培育輪蟲的2 種常見飼料，小球藻用于投喂輪蟲，能夠為輪蟲提供較為全面的營養(yǎng)，而與小球藻相比，酵母缺乏幼苗生長所需的HUFAs，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等。因此，使用酵母培育輪蟲時，通常需要對輪蟲進行營養(yǎng)強化以滿足幼苗的攝食需求。文獻[9，14-16]研究表明，在輪蟲培育過程中添加V、V、V，能夠提高輪蟲的抗氧化能力，并促進輪蟲種群的增長與繁殖力。Tako研究表明，同時添加維生素和小球藻，能夠有效防止HUFAs 的氧化，增加輪蟲HUFAs 的含量。因此，基于這些學者的研究，選用酵母與維生素進行混合投喂，以求達到更好的輪蟲培育效果。本研究中，輪蟲種群密度的差異始于追肥日（3 d），PA 塘中輪蟲的種群密度于3～10 d 顯著高于PB 塘（P<0.05）；輪蟲攜卵率的顯著差異出現(xiàn)在追肥后的3～6 d，PA塘中輪蟲的攜卵量顯著高于PB 塘（P<0.05），這與預期的結果相一致，PA 塘的輪蟲在產(chǎn)量與繁殖能力上皆顯著高于PB，有效實現(xiàn)了輪蟲增產(chǎn)。

現(xiàn)使用主成分分析（PCA）和Pearson 相關性分析的方法，分析培育池的水環(huán)境，揭示2 口池塘中的環(huán)境因子變化，以及環(huán)境因子與輪蟲產(chǎn)量之間的關系。由PCA 的結果可以得出，2 口池塘1～6 d 的水環(huán)境主成分均與NH-N 含量有較高的相關度，而7～10 d 的主成分受DO 的影響較大。PA 塘中輪蟲密度與環(huán)境因子間的相關性分析表明（表3），培育期間，PA 塘內(nèi)的輪蟲密度與NH-N 含量呈顯著正相關（P<0.05）；而PB 塘中NH-N 含量與輪蟲密度的相關性并不顯著（P>0.05），且相關性系數(shù)為負值（-0.01），TP 與DO 更多地介導了輪蟲密度的變化。藺麗麗等認為，水體中的NH-N 含量超過5 mg/L，便會對壺狀臂尾輪蟲（Brachionus urceolaris）產(chǎn)生毒害作用，導致輪蟲的種群增長與繁殖力降低。本試驗中，PB 塘中NH-N 的峰值達到了7.12 mg/L（表2），超過了5 mg/L，相關性分析的結果也能夠印證這一觀點。因此，在培育期間，PB 塘水環(huán)境中的NH-N 含量對輪蟲種群的增長產(chǎn)生了負面影響，這也是導致PB 塘輪蟲種群密度低于PA 塘的原因之一。綜上所述，在以雞糞為基肥與追肥的輪蟲土池大規(guī)模培育中，使用酵母維生素混合物追肥代替雞糞追肥的方式，能夠使培育池擁有更好的水環(huán)境。該方法能夠減少一半雞糞的投入量，從源頭減少氮磷的匯入。此外，從生物防治污染的角度來說，更高的輪蟲產(chǎn)量，也代表能夠以生物的方式實現(xiàn)氮磷等基本營養(yǎng)元素的固定，并從水體中移出，防止更多的營養(yǎng)物流入天然水域，有效緩解輪蟲培育池帶來的尾水污染。

4 結語

褶皺臂尾輪蟲（B.plicatilis）大規(guī)模土池粗放式培育中，使用酵母維生素混合物追肥與直接使用雞糞追肥的方式相比，酵母維生素混合物方式有利于培育池內(nèi)餌料微藻的培養(yǎng)，提高輪蟲密度與繁殖能力，增加了輪蟲產(chǎn)量。此方法減少了一半的雞糞投入量，能夠在輪蟲培育池內(nèi)維持更好的水環(huán)境，有效降低輪蟲培育帶來的污染，操作簡易，適合在沿海生物餌料生產(chǎn)企業(yè)中進行推廣。