飼糧中添加黃花菜莖葉青貯對灘羊瘤胃菌群多樣性的影響

王 錦 張連全 王文亮 張久盤 趙正偉 楊宇為 馬吉鋒 張俊麗 王秀琴* 馬 青*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，銀川 750002；2.寧夏朔牧鹽池灘羊繁育有限公司，吳忠 751100)

黃花菜又名金針菜、萱草、忘憂草，是百合科萱草屬多年生草本植物[1]。近年來，寧夏自治區(qū)黨委政府將黃花菜產(chǎn)業(yè)作為鹽同紅集中連片貧困地區(qū)脫貧富民的重要產(chǎn)業(yè)之一。寧夏黃花菜種植主要集中在吳忠市的鹽池、紅寺堡2地。截止2020年底，僅吳忠市黃花菜種植面積達(dá)10 672 hm2，約占全國種植面積的17%[2]。大面積的黃花菜種植產(chǎn)生的大量莖葉，未能被合理利用，直接丟棄或者焚燒，造成生態(tài)環(huán)境破壞和資源浪費(fèi)，還會(huì)成為冬季火災(zāi)隱患。因此，探究黃花菜莖葉在畜禽飼料中高效利用成為目前主要的研究目標(biāo)。

灘羊產(chǎn)業(yè)作為寧夏九大優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè)之一[3]，在脫貧攻堅(jiān)及鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮重要作用。灘羊具有肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、膻腥味輕、瘦肉率高(灘羊肉可超過57%，普通羊肉為52%)、肌內(nèi)脂肪分布均勻等優(yōu)點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者歡迎[4]。隨著灘羊肉口碑大幅提升和飼養(yǎng)量不斷增加，飼料短缺現(xiàn)象已成為限制寧夏灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的關(guān)鍵問題[5]。因此，探究灘羊飼料中如何科學(xué)、合理、有效地利用黃花菜莖葉資源變得尤為重要。

青貯不僅可以改善飼草的適口性，而且還可以保持或者提高飼草的營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)因其制作過程簡單，做好以后可以常年使用[6]，因此將黃花菜莖葉做成青貯是一種很好利用途徑。梅寧安等[7]進(jìn)行了瓜薯秧混合青貯及黃花菜莖葉青貯最佳水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究，發(fā)現(xiàn)瓜薯秧混合青貯及黃花菜莖葉青貯在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%時(shí)，22～25 ℃包膜青貯45 d，青貯飼料感官評(píng)分可達(dá)2級(jí)，營養(yǎng)價(jià)值較高；趙正偉等[8]探究了黃花菜莖葉與全株玉米混貯揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)黃花菜莖葉與全株玉米混合比例為2∶8時(shí)，粗蛋白質(zhì)、VFA含量較優(yōu)，提高了青貯品質(zhì)；楊宇為等[9]研究了黃花菜莖葉青貯與全株玉米青貯不同比例混合對灘羊生長性能及屠宰性能的影響，結(jié)果表明，黃花菜莖葉青貯與全株玉米青貯混合比例為2∶8時(shí)，灘羊的生長性能及屠宰性能較好。

為進(jìn)一步研究黃花菜莖葉青貯在灘羊飼糧中適宜添加比例及其對灘羊瘤胃微生物區(qū)系的影響，本試驗(yàn)選擇早期斷奶灘羊公羔羊作為試驗(yàn)動(dòng)物，使用不同混合比例的黃花菜莖葉青貯與玉米青貯飼糧飼喂灘羊，并分析其瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物區(qū)系的變化，探明黃花菜莖葉青貯的適宜添加比例，探討其對灘羊瘤胃微生物區(qū)系的影響，為黃花菜莖葉青貯在鹽池灘羊產(chǎn)業(yè)中的高效利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年4月至2021年7月在寧夏朔牧鹽池灘羊繁育有限公司進(jìn)行，試驗(yàn)期共100 d，其中預(yù)試期10 d，正試期90 d。試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用3月齡體質(zhì)健康、體重[(21.60±1.09) kg]相近的灘羊公羔羊80只，按照體重隨機(jī)分為4組，每組20只。根據(jù)飼糧中黃花菜莖葉青貯和玉米青貯添加比例進(jìn)行分組，即對照組：100%青貯玉米；試驗(yàn)1組：20%黃花菜莖葉青貯+80%青貯玉米；試驗(yàn)2組：40%黃花菜莖葉青貯+60%玉米青貯；試驗(yàn)3組：60%黃花菜莖葉青貯+40%玉米青貯。試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)羊采用全舍飼，飼養(yǎng)在條件一致的圈舍內(nèi)，專人負(fù)責(zé)飼喂。通過10 d預(yù)試期，將黃花菜青貯逐步添加進(jìn)去，避免引起試驗(yàn)羊換料應(yīng)激。預(yù)試期結(jié)束后進(jìn)入正式試驗(yàn)。試驗(yàn)羊采用分圈混群飼養(yǎng)的方式，每天飼喂2次(09:00、17:00)，先粗后精，自由采食、自由飲水。

1.3 瘤胃液采集與處理

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)選取3只進(jìn)行屠宰并采集瘤胃液2份，1份-20 ℃保存，用于分析瘤胃發(fā)酵參數(shù)；1份-80 ℃保存以備提取DNA，進(jìn)行瘤胃微生物區(qū)系分析。

1.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定方法

瘤胃液氨態(tài)氮濃度采用馮宗慈等[10]改進(jìn)的比色法進(jìn)行測定；瘤胃液VFA濃度采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)的方法進(jìn)行測定。

1.5 瘤胃液樣品測序

1.5.1 瘤胃液基因組DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后采用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop檢測DNA的純度和濃度。

1.5.2 PCR擴(kuò)增

取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，以帶Barcode的特異引物，使用高效和高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

1.5.3 樣本測序

使用TIANSeq快速DNA文庫構(gòu)建試劑盒(天根生化科技有限公司)構(gòu)建測序文庫，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和Agient2100文庫檢測，合格后，使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行PE250 bp測序。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理計(jì)算，并采用DPS V9.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加黃花菜青貯莖葉對灘羊瘤胃液氨態(tài)氮和VFA濃度的影響

飼糧中添加黃花菜青貯莖葉對灘羊瘤胃液氨態(tài)氮和VFA濃度的影響見表2，各組之間瘤胃液氨態(tài)氮、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度沒有顯著差異(P>0.05)，但是都呈現(xiàn)試驗(yàn)1組瘤胃液氨態(tài)氮、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度最高，比對照組分別提高了28.65%、36.34%、26.70%、41.62%和3.00%，說明飼喂20%黃花菜莖葉青貯+80%青貯玉米試驗(yàn)飼糧可以提高瘤胃液氨態(tài)氮、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度。

表2 灘羊瘤胃液中氨態(tài)氮和VFA濃度

2.2 瘤胃菌群多樣性分析

2.2.1 操作分類單元(OTU)數(shù)量

利用Venn圖[11]可以展示樣品之間共有、特有的OTU[12]數(shù)目，直觀地表現(xiàn)出樣品間OTU的重合情況。結(jié)合OTU所代表的物種，可以找出不同環(huán)境中的共有微生物。由圖1可以看出，4個(gè)組共有10 478個(gè)OTU，其中對照組有3 074個(gè)OTU，試驗(yàn)1組有4 240個(gè)OTU，試驗(yàn)2組有3 805個(gè)OTU，試驗(yàn)3組有4 205個(gè)OTU，其中4個(gè)組共有的OTU數(shù)目為834個(gè)，占總OTU數(shù)目的8.00%，對照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組獨(dú)有的OTU數(shù)目分別為1 490、2 269、1 889和2 306個(gè)，分別占總OTU數(shù)目的14.22%、21.65%、18.02%和22.00%。OTU數(shù)目順序?yàn)樵囼?yàn)1組>試驗(yàn)3組>試驗(yàn)2組>對照組，各試驗(yàn)組的OTU數(shù)目均高于對照組，表明飼糧中添加黃花菜青貯莖葉提高了瘤胃內(nèi)特有微生物的種類，增加了微生物的多樣性，其中以試驗(yàn)1組微生物的種類和多樣性最高。

S0、S4、S8、S12分別代表對照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組。下圖同。

2.2.2 瘤胃菌群多樣性分析

2.2.2.1 稀釋曲線和Shannon指數(shù)曲線

稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度[13]，當(dāng)稀釋曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種。同時(shí)，在相同的測序深度下，比較不同樣本中OTU數(shù)目的多少，從而在一定程度上衡量每個(gè)樣本的多樣性高低。由圖2可以看出，隨著測序深度的增加，新物種出現(xiàn)的增加速度變得緩慢，但是仍然有新物種出現(xiàn)。

Shannon指數(shù)曲線可以反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。Shannon指數(shù)越大則OTU數(shù)目越多，物種越豐富，表明樣品中已涵蓋絕大多數(shù)的微生物物種信息。當(dāng)Shannon指數(shù)曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，OTU種類不會(huì)再隨測序量增加而增長；如果曲線沒有趨于平坦，則表明不飽和，增加數(shù)據(jù)量可以發(fā)現(xiàn)更多OTU。由圖3可以看出，當(dāng)測序深度較小時(shí)，Shannon指數(shù)曲線急速上升；當(dāng)測序深度達(dá)到8 700 reads時(shí)，Shannon指數(shù)曲線變化緩慢，已接近飽和，說明測序趨向飽和，即本試驗(yàn)當(dāng)前測序量足夠進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析。

圖2 樣品的稀釋曲線

圖3 樣品的Shannon指數(shù)曲線

2.2.2.2 α多樣性分析

α多樣性反映的是樣本內(nèi)的微生物群落多樣性，α多樣性有多種衡量指標(biāo)：Ace、Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)及覆蓋率。Chao1和Ace指數(shù)用于衡量物種相對豐度，即物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，Shannon和Simpson指數(shù)越大，說明樣品的物種多樣性越高[14]。由表3可以看出，除試驗(yàn)3組Simpson指數(shù)略低于對照組，各試驗(yàn)組的Ace、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)均高于對照組，說明試驗(yàn)組的物種豐度和多樣性高于對照組；其中，試驗(yàn)1組的Ace、Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)均最高，且Shannon指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，說明試驗(yàn)1組中的物種豐度和多樣性最高。覆蓋率越高，則說明樣本中物種被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低。本試驗(yàn)各組的覆蓋率均高于99%，則足以反映本次測序結(jié)果可以代表灘羊瘤胃中微生物菌群的真實(shí)情況。

表3 α 多樣性指數(shù)

2.2.2.3 β多樣性分析

β多樣性是指沿著環(huán)境梯度變化的不同群落之間，物種組成的相異性或物種沿環(huán)境梯度的更替速率，因此也被稱為生境間多樣性。使用QIIME2軟件進(jìn)行β多樣性分析，比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度，各組之間離散的越遠(yuǎn)，說明各組差異越大。β多樣性分析主要采用Binary Jaccard、Bray Curtis、Weighted Unifrac、Unweighted Unifrac 4種算法計(jì)算樣品間的距離，從而獲得樣本間的β值。這4個(gè)算法主要分為兩大類：加權(quán)(Bray Curtis和Weighted Unifrac)與非加權(quán)(Binary Jaccard和Unweighted Unifrac)。本試驗(yàn)要研究對照與試驗(yàn)組之間的關(guān)系，故采用加權(quán)分析方式。由圖4可以看出，各試驗(yàn)組之間都相距較遠(yuǎn)，各試驗(yàn)組與對照組相比較相距較遠(yuǎn)，說明各試驗(yàn)組瘤胃微生物區(qū)系存在著差異，也進(jìn)一步可以說明添加黃花菜莖葉青貯可以使灘羊的瘤胃微生物菌落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖4 主坐標(biāo)分析和非度量多維尺度分析圖

2.2.3 細(xì)菌組成與菌落結(jié)構(gòu)分析

2.2.3.1 門水平結(jié)構(gòu)分析

灘羊瘤胃細(xì)菌在門水平上的菌落組成和相對豐度見表4和圖5，共檢測到27個(gè)菌門，包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、Patescibacteria、放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)、螺旋菌門(Spirochaetota)、未分類(unclassified)、廣古菌門(Euryarchaeota)、脫硫菌門(Desulfobacterota)、絲狀桿菌門(Fibrobacterota)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、彎曲桿菌門(Campilobacterota)、洗脫微生物菌門(Elusimicrobiota)、互養(yǎng)菌門(Synergistota)、浮霉菌門(Planctomycetota)、蛭弧菌門(Bdellovibrionota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、黏液球菌門(Myxococcota)等。4個(gè)組灘羊瘤胃液中的菌門主要為厚壁菌門、擬桿菌門和Patescibacteria，占到了總細(xì)菌的90.77%以上。與對照組相比，試驗(yàn)1組瘤胃液中擬桿菌門、疣微菌門、螺旋菌門、廣古菌門、藍(lán)細(xì)菌門等相對豐度有所升高，但差異不顯著(P>0.05)，厚壁菌門、Patescibacteria、放線菌門、變形菌門等相對豐度有所降低，但差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)2組瘤胃液中擬桿菌門、螺旋菌門、廣古菌門、脫硫菌門、絲狀桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門等相對豐度有所升高，但差異不顯著(P>0.05)，厚壁菌門、Patescibacteria、放線菌門、變形菌門、疣微菌門等相對豐度有所降低，但差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)3組瘤胃液中擬桿菌門、變形菌門、螺旋菌門、廣古菌門、脫硫菌門、絲狀桿菌門等相對豐度有所升高，但差異不顯著(P>0.05)，厚壁菌門、Patescibacteria、放線菌門、疣微菌門等相對豐度有所降低，但差異不顯著(P>0.05)。

Unclassified：未分類；Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidota：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Euryarchaeota：廣古菌門疣微菌門；Spirochaetota：螺旋菌門；Actinobacteriota：放線菌門；Verrucomicrobiota：疣微菌門；Desulfobacterota：脫硫菌門；Other：其他。

續(xù)表4項(xiàng)目Items對照組Control group 試驗(yàn)1組Trial group 1 試驗(yàn)2組Trial group 2 試驗(yàn)3組Trial group 3 P值P-value廣古菌門 Euryarchaeota 0.21±0.040.95±0.120.49±0.063.17±1.300.138脫硫菌門 Desulfobacterota 0.21±0.040.21±0.040.29±0.030.35±0.100.417絲狀桿菌門 Fibrobacterota 0.09±0.060.06±0.020.20±0.010.17±0.050.089藍(lán)細(xì)菌門 Cyanobacteria 0.09±0.030.37±0.010.49±0.090.09±0.010.086彎曲桿菌門 Campilobacterota 0.03±0.010.03±0.010.05±0.020.05±0.020.281洗脫微生物菌門 Elusimicrobiota 0.01±0.000.02±0.000.03±0.010.03±0.010.425互養(yǎng)菌門 Synergistota 0.01±0.000.08±0.010.04±0.000.03±0.000.078

2.2.3.2 屬水平結(jié)構(gòu)分析

灘羊瘤胃細(xì)菌在屬上水平上的組成和相對豐度見表5和圖6，4組灘羊瘤胃液菌群總共包含339個(gè)屬，其中有18個(gè)菌屬相對豐度比例在1%以上，分別為瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、念珠菌糖單胞菌屬(Candidatus_Saccharimonas)、梭菌科_UCG-014(Clostridia_UCG-014)、未分類、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌屬群(Eubacterium_coprostanoligenes_group)、RF39、未培養(yǎng)(uncultured)、Muribaculaceae、理研菌科_RC9腸道群(Ikenellaceae_RC9_gut_group)、Saccharofermentans、瘤胃球菌科_NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)、韋榮球菌科_UCG-007(Erysipelotrichaceae_UCG-007)、奧爾森菌屬(Olsenella)、毛螺菌科_NK3A20群(Lachnospiraceae_NK3A20_group)、擬桿菌目_RF16群(Bacteroidales_RF16_group)、克里斯滕森菌科_R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)等。與對照組相比，試驗(yàn)1組瘤胃液中瘤胃球菌屬、RF39、奧爾森菌屬和毛螺菌科_NK3A20群的相對豐度顯著降低(P<0.05)，Muribaculaceae的相對豐度顯著升高(P<0.05)，普雷沃氏菌屬、理研菌科_RC9腸道群、瘤胃球菌科_NK4A214群、擬桿菌類_RF16群、克里斯滕森菌科_R-7群、UCG-001的相對豐度有所升高(P>0.05)，念珠菌糖單胞菌屬、梭菌科_UCG-014、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群、Saccharofermentans、韋榮球菌科_UCG-007的相對豐度有所降低(P>0.05)；試驗(yàn)2組瘤胃液中瘤胃球菌屬、奧爾森菌屬和毛螺菌科_NK3A20群的相對豐度顯著降低(P<0.05)；試驗(yàn)3組瘤胃液中瘤胃球菌屬、奧爾森菌屬和毛螺菌科_NK3A20群的相對豐度顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

氨態(tài)氮是瘤胃微生物合成菌體蛋白的主要原料，適宜濃度為8.5～30.0 mg/dL，如果氨態(tài)氮濃度過低，瘤胃微生物的生產(chǎn)能力將會(huì)受到抑制[15]。李與琦等[16]研究發(fā)現(xiàn)，湖羊瘤胃中的氨態(tài)氮濃度隨著不同微貯棉秸添加比例的增加呈現(xiàn)先升高再降低趨勢。有研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門分別參與了纖維物質(zhì)與非纖維物質(zhì)的降解，這些物質(zhì)經(jīng)瘤胃發(fā)酵后分別產(chǎn)生乙酸和丙酸[17]。瘤胃微生物通過分解飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生的VFA可以為動(dòng)物機(jī)體提供能量，反芻動(dòng)物瘤胃微生物發(fā)酵能為宿主提供70%日常生命活動(dòng)所需的能量[18]。金鹿等[19]研究了沙蒿多糖組合制劑對灘羊羔羊瘤胃菌群多樣性的影響，其結(jié)果顯示添加沙蒿多糖組合制劑可以提高瘤胃VFA的含量。本試驗(yàn)中，瘤胃液氨態(tài)氮濃度也是先升高后降低，與李與琦等[16]研究結(jié)果一致。同時(shí)，反芻動(dòng)物飼糧結(jié)構(gòu)、品質(zhì)及微生物活性、微生物區(qū)系都對瘤胃中的VFA(乙酸、丙酸、丁酸)的組成和濃度產(chǎn)生影響[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)1組灘羊瘤胃液中氨態(tài)氮、VFA(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸)濃度均最高，能為灘羊提供更多的能量，更有利于脂肪的沉積，可提高灘羊的體重和日增重。

Unclassified：未分類；Prevotella：普雷沃氏菌屬；Candidatus_Saccharimonas：念珠菌糖單胞菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；Clostridia_UCG-014：梭菌科_UCG-014；Bacteroidales_RF16_group：擬桿菌目_RF16群；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科_RC9腸道群；Eubacterium_coprostanoligenes_group：產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌屬群；Other：其他。

表5 黃花菜莖葉青貯對灘羊瘤胃菌群在屬水平上相對豐度的影響

續(xù)表5項(xiàng)目Items對照組Control group試驗(yàn)1組Trial group 1試驗(yàn)2組Trial group 2試驗(yàn)3組Trial group 3P值P-value擬桿菌類目_RF16群Bacteroidales_RF16_group1.09±0.835.09±3.164.67±3.2611.84±7.390.181克里斯滕森菌科_R-7群Christensenellaceae_R-7_group1.06±0.451.78±0.871.34±0.511.60±0.600.195UCG-0010.99±0.962.10±1.173.47±2.7311.58±6.980.176

瘤胃作為反芻動(dòng)物重要的消化器官，是天然的發(fā)酵罐，內(nèi)部含有豐富的瘤胃微生物，能夠降解單胃動(dòng)物難以消化的纖維物質(zhì)。瘤胃中微生物主要以細(xì)菌為主，每毫升瘤胃的內(nèi)容物中有超過百億個(gè)細(xì)菌[21]。反芻動(dòng)物瘤胃微生物的生長代謝不僅可以為其提供能量、蛋白質(zhì)、必需氨基酸等機(jī)體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)它還可以將纖維素和半纖維素分解、轉(zhuǎn)化，使其成為可供機(jī)體吸收的蛋白質(zhì)和能量物質(zhì)，以此來保證自身的營養(yǎng)需要[22]。瘤胃微生物菌群的結(jié)構(gòu)和相對豐度處于相對穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡，該平衡對于維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及在反芻動(dòng)物的消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)過程中起著重要的作用[23-24]。眾多研究都表明，厚壁菌門和擬桿菌門是反芻動(dòng)物瘤胃中的優(yōu)勢菌群，其對反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵過程產(chǎn)生重要的影響[25-26]。本試驗(yàn)中，4組灘羊瘤胃液中的優(yōu)勢菌為厚壁菌門、擬桿菌門、Patescibacteria和放線菌門，與上述研究結(jié)果一致。但是本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4組灘羊瘤胃液中還有一種Patescibacteria的細(xì)菌，對其在灘羊瘤胃中的作用還鮮有報(bào)道，這個(gè)細(xì)菌是不是灘羊瘤胃中特有的菌群，或許可作為下一步的研究方向。

厚壁菌門主要代表菌科為瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、和韋榮球菌科(Veronococcaceae)，主要代表屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Fusobacterium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)乳桿菌屬(Lactobacillus)等，擬桿菌門主要以普雷沃氏菌屬為主[27]。厚壁菌門中的瘤胃球菌屬主要由黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌組成，是一種瘤胃中重要的纖維降解菌，能產(chǎn)生的纖維素酶、半纖維素酶和木聚糖酶，用來分解粗飼料中的纖維素和半纖維素[28]。普雷沃氏菌在瘤胃中可以降解和利用淀粉和植物細(xì)胞壁多糖如木聚糖和果膠，但是不能降解纖維素。普雷沃氏菌的發(fā)酵產(chǎn)物主要是乙酸、琥珀酸和丙酸，其中丙酸主要通過丙烯酸途徑合成[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著黃花菜莖葉青貯添加比例的增加，占比較高(1%以上)的厚壁菌門、Patescibacteria、放線菌門、變形菌門相對豐度逐漸降低，而只有擬桿菌門相對豐度有升高的趨勢，進(jìn)一步從屬水平來看，試驗(yàn)1組中厚壁菌門中瘤胃球菌屬的相對豐度較對照組降低，并且擬桿菌門中普雷沃氏菌屬的相對豐度較對照組有所升高，說明黃花菜莖葉青貯添加比例并不是越多越好，還是有個(gè)適當(dāng)?shù)奶砑颖壤?，即?0%黃花菜莖葉青貯+80%青貯玉米為宜。其他幾種主要菌門相對豐度降低，而只有擬桿菌門的相對豐度升高，分析其原因可能由于黃花菜莖葉青貯的粗纖維含量低于玉米秸稈青貯，添加黃花菜莖葉青貯相當(dāng)于降低粗纖維含量，而且飼糧中粗蛋白質(zhì)、干物質(zhì)含量反而有所提升，所以瘤胃液厚壁菌門的相對豐度降低，而擬桿菌門的相對豐度升高，同時(shí)也印證了添加黃花菜莖葉青貯可以改變?yōu)┭蛄鑫钢芯航Y(jié)構(gòu)和組成。

4 結(jié) 論

綜上所述，灘羊飼糧中添加20%黃花菜莖葉青貯+80%青貯玉米時(shí)，對灘羊瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能影響較小，同時(shí)可以提高灘羊瘤胃菌群種類和多樣性，改變瘤胃菌落結(jié)構(gòu)和組成。在生產(chǎn)實(shí)踐中，黃花菜莖葉青貯可以作為一種粗飼料補(bǔ)充，但添加比例應(yīng)不高于20%。