不同培育方式下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群組成特征分析

張玉瑩 劉燕紅 郭文杰 郝文君 劉書杰 馮宇哲 崔占鴻

(青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，西寧 810016)

動物的腸道菌群是保證其腸道消化功能的重要組成部分，與宿主的健康狀態(tài)十分密切[1]。腸道菌群在宿主體內(nèi)的進化過程中，會參與宿主食物的消化吸收、能量代謝等多種生理功能，具有十分重大的意義[2-3]。張子敬等[4]研究了腹瀉與健康夏南牛犢牛糞便菌群的多樣性、結(jié)構(gòu)和組成，分析了腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群，篩選出10個生物標志物(biomarker)作為犢牛腹瀉參考的指標。牦牛作為青藏高原上特有的優(yōu)勢反芻家畜，主要以放牧飼養(yǎng)為主，利用該地區(qū)天然草地牧草為藏族群眾提供重要的生產(chǎn)和生活資料來源。犢牛是牦牛產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的后備軍，其培育質(zhì)量直接關(guān)系到成年牦牛的生產(chǎn)性能發(fā)揮。然而，在牦牛犢牛早期培育過程中，傳統(tǒng)的隨母哺乳放牧培育方式下犢牛腹瀉易發(fā)多發(fā)，發(fā)病后致死率較高，嚴重影響了牦牛犢牛的培育質(zhì)量，不利于牦牛生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。近年來，研究者開展了犢牛早期或適時斷奶后舍飼代乳飼養(yǎng)來培育牦牛犢牛，能有效預防犢牛腹瀉的發(fā)生[5]。楊俊仁等[6]發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加益生菌可有效提高犢牛的生產(chǎn)性能，增加經(jīng)濟收益。因此，系統(tǒng)地開展不同培育方式(放牧和舍飼)下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群組成特征分析，能為牦牛犢牛培育關(guān)鍵期的營養(yǎng)調(diào)控與優(yōu)良益生菌的篩選提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

2020年8月，在青海省海北州海晏縣青海湖牦牛繁育養(yǎng)殖專業(yè)合作社選取3月齡、體重[(45.00±5.00) kg]相近的放牧牦牛犢牛(公)12頭，其中6頭為健康犢牛，6頭為腹瀉犢牛，在天然草場進行放牧飼養(yǎng)，犢牛自由飲水，每日注意觀察犢牛的排糞情況，放牧條件下的犢牛所采食牧草根據(jù)犢牛的行動軌跡來獲得，由高山嵩草、垂穗披堿草、草地早熟禾、多裂委陵菜、翠雀花等組成；同時，在海晏縣西海鎮(zhèn)海北高原現(xiàn)代生態(tài)畜牧業(yè)科技試驗示范園選取3月齡、體重[(42.00±5.00) kg]相近的舍飼牦牛犢牛(公)12頭，其中6頭為健康犢牛，6頭為腹瀉犢牛，采用單欄飼養(yǎng)，代乳粉每日早、晚各飼喂1次，在飼喂代乳粉的基礎(chǔ)上補喂開食料和苜蓿干草(開食料∶苜蓿干草=1∶1)。代乳粉主要由全脂奶粉、乳清粉、濃縮蛋白、生物素、煙酸、微量元素、賴氨酸、蛋氨酸、維生素A、維生素D、維生素E等組成；開食料主要由玉米、豆粕、膨化大豆、麩皮、乳清粉、細石粉、預混料、脂肪粉、磷酸氫鈣、食鹽等組成。代乳粉、開食料和苜蓿干草營養(yǎng)成分含量見表1，放牧犢牛牧草營養(yǎng)水平與舍飼犢牛飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 代乳粉、開食料和苜蓿干草營養(yǎng)成分含量(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表2 放牧犢牛牧草營養(yǎng)水平與舍飼犢牛飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

健康和腹瀉犢牛糞便的采集均采用直腸取糞法。分別采集放牧條件下健康犢牛糞便樣品(FZ01、FZ02、FZ03、FZ04、FZ05、FZ06)和腹瀉犢牛糞便樣品(FX01、FX02、FX03、FX04、FX05、FX06)各6份；同時，采集舍飼條件下健康犢牛糞便樣品(SZ01、SZ02、SZ03、SZ04、SZ05、SZ06)和腹瀉犢牛糞便樣品(SX01、SX02、SX03、SX04、SX05、SX06)各6份。糞便樣品采集后立即放入液氮罐中保存，帶回實驗室后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存待測。

犢牛腹瀉參照郭文杰[5]提到的糞便評分來評定，具體評分標準為：形態(tài)正常，外觀較硬，評分1分；形態(tài)成形，外觀較軟，評分2分；形態(tài)不成形，外觀呈水樣，評分3分；形態(tài)不成形，外觀呈水樣，黏液附著少量血絲，評分4分；形態(tài)不成形，外觀呈水樣，黏液附著大量血絲，評分5分。每天記錄每頭牛的評分，連續(xù)記錄5 d，當糞便被評為3分及以上時則判定為腹瀉。

1.3 樣品處理與指標測定

采用磁珠法和基因組DNA提取試劑盒提取牦牛犢牛糞便樣品的細菌總DNA。具體操作為：在2 mL離心管加入樣本0.3 g，再加入10 μL RNase A渦旋振蕩混勻后70 ℃加熱裂解15 min提高裂解效率，12 000 r/min離心1 min，移上清液(約500 μL)至新的2 mL離心管，后續(xù)步驟嚴格按試劑盒操作流程進行。將提取的高質(zhì)量DNA樣品送至北京諾和致源有限公司進行測序與分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用Uparse軟件(v7.0.1001)對所有樣本的全部有效片段進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元(OTUs)。用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析。使用MUSCLE軟件進行快速多序列比對，Alpha多樣性和Beta多樣性分析均基于均一化處理化后的數(shù)據(jù)。使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Chao1、Shannon、Simpson和ACE指數(shù)，Alpha多樣性指數(shù)使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，以P<0.05作為顯著性差異的標準，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線；使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Unifrac距離，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制主成分分析(PCoA)圖；門水平和屬水平的菌群組成組間差異性通過t-檢驗(t-test)分析得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 放牧和舍飼條件下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群Alpha多樣性的比較

由圖1可知，放牧條件下，健康和腹瀉牦牛犢牛腸道菌群共有2 089個OTUs，健康牦牛犢牛獨有380個OTUs，腹瀉牦牛犢牛獨有1 302個OTUs；舍飼條件下，健康和腹瀉牦牛犢牛腸道菌群共有2 077個OTUs，健康牦牛犢牛獨有532個OTUs，腹瀉牦牛犢牛獨有1 023個OTUs。由圖2可知，2種培育方式下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群組成測序的稀釋曲線到后期均趨于平緩，說明此次測序數(shù)據(jù)是合理的。

FZ：放牧條件下的健康牦牛犢牛；FX：放牧條件下的腹瀉牦牛犢牛；SZ：舍飼條件下的健康牦牛犢牛；SX：舍飼條件下的腹瀉牦牛犢牛。下圖同。

由表3可知，在2種培育方式下，除ACE指數(shù)腹瀉牦牛犢牛顯著高于健康牦牛犢牛(P<0.05)外，Shannon、Simpson和Chao1指數(shù)在健康與腹瀉牦牛犢牛之間均無顯著差異(P>0.05)，表明與健康牦牛犢牛相比，腹瀉牦牛犢牛腸道菌群組成的物種豐富度更高；同時，Shannon和Simpson指數(shù)均表現(xiàn)為放牧牦牛犢牛顯著高于舍飼牦牛犢牛(P<0.05)，表明與舍飼牦牛犢牛相比，放牧牦牛犢牛腸道菌群組成的物種多樣性更高。

圖2 稀釋曲線

2.2 放牧和舍飼條件下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群Beta多樣性的比較

由圖3所示，4組牦牛犢牛腸道菌群組成多樣性存在一定差異，4組牦牛犢牛的腸道的主成分1(PC1)占總變異的24.17%，主成分2(PC2)占總變異的14.88%；2種培育方式下健康牦牛犢牛間、腹瀉牦牛犢牛間都相對獨立分開，表明腸道菌群組成的物種多樣性差異較大；但同一種培育方式下的健康與腹瀉牦牛犢牛間都有交叉，表明腸道菌群組成的物種多樣性差異較小。

2.3 放牧和舍飼條件下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群門水平相對豐度的比較

對豐度排名前十的菌門進行分析，由圖4得知，牦牛犢牛腸道菌群中優(yōu)勢菌門有擬桿菌門(Bacteroidetes)(健康放牧犢牛為43.04%、腹瀉放牧犢牛為38.87%、健康舍飼犢牛為55.87%、腹瀉舍飼犢牛為54.68%)、厚壁菌門(Firmicutes)(健康放牧犢牛為48.79%、腹瀉放牧犢牛為46.83%、健康舍飼犢牛為37.52%、腹瀉舍飼犢牛為38.44%)、螺旋菌門(Spirochaetes)(健康放牧犢牛為0.37%、腹瀉放牧犢牛為2.26%、健康舍飼犢牛為0.04%、腹瀉舍飼犢牛為0.06%)、變形菌門(Proteobacteria)(健康放牧犢牛為0.74%、腹瀉放牧犢牛為2.60%、健康舍飼犢牛為1.22%、腹瀉舍飼犢牛為1.85%)、放線菌門(Actinobacteria)(健康放牧犢牛為0.22%、腹瀉放牧犢牛為0.85%、健康舍飼犢牛為2.00%、腹瀉舍飼犢牛為1.36%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(健康放牧犢牛為1.02%、腹瀉放牧犢牛為1.23%、健康舍飼犢牛為0.09%、腹瀉舍飼犢牛為0.06%)。根據(jù)圖5的t-test分析得知，放牧條件下腹瀉牦牛犢牛腸道菌群組成中脫硫桿菌門(Desulfobacterota)的相對豐度顯著高于健康牦牛犢牛(P<0.05)。

表3 牦牛犢牛腸道菌群Alpha多樣性比較

2.4 放牧和舍飼條件下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群屬水平相對豐度的比較

對豐度排名前30的菌屬進行分析，由表4和圖6可以看出，4組牦牛犢牛共有的優(yōu)勢菌屬主要是擬桿菌屬(Bacteroides)、UCG-005、理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、另枝菌屬(Alistipes)、擬普氏菌屬(Alloprevotella)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)；在此基礎(chǔ)上，放牧條件下克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)是優(yōu)勢菌屬，且腹瀉牦牛犢牛腸道菌群中巴氏桿菌屬(Papillibacter)和Mailhella的相對豐度顯著高于健康牦牛犢牛(P<0.05)；舍飼條件下糞桿菌屬是優(yōu)勢菌屬，且腹瀉牦牛犢牛腸道菌群中巴氏桿菌屬和薩特氏菌屬(Sutterella)的相對豐度顯著高于健康牦牛犢牛(P<0.05)。

圖3 PCoA圖

3 討 論

3.1 放牧與舍飼條件下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群Aphla多樣性比較分析

牦牛作為青藏高原上特有的優(yōu)勢反芻家畜，主要以放牧飼養(yǎng)為主，利用該地區(qū)天然草地牧草為藏族群眾提供重要的生產(chǎn)和生活資料來源。牦牛腸道中有較多的纖維需要消化吸收，而腸道中本身不能產(chǎn)生分解纖維的相關(guān)酶，需要腸道中的細菌來產(chǎn)生，因此研究牦牛腸道中的菌群十分重要[7]。腸道是一個消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的場所，關(guān)鍵在于其中的微生物，并且腸道中的微生物可以調(diào)控宿主的健康[8]。糞便菌群經(jīng)常被用來代表腸道菌群[9]。目前對于牦牛犢牛腸道菌群的研究較少，本研究從放牧和舍飼2種培育方式下來分析牦牛犢牛的腸道菌群組成。郭仕輝[10]研究發(fā)現(xiàn)，與健康犢牛相比，腹瀉犢牛糞便菌群的Shannon和Simpson指數(shù)均顯著降低，但Chao1指數(shù)顯著增加。在本試驗中，從Alpha多樣性分析可以看出，腹瀉會導致牦牛犢牛腸道菌群組成發(fā)生變化，腹瀉牦牛犢牛腸道菌群ACE指數(shù)顯著高于健康牦牛犢牛，說明腹瀉牦牛犢牛的腸道菌群物種豐富度更高；放牧牦牛犢牛腸道菌群Shannon和Simpson指數(shù)顯著高于舍飼牦牛犢牛，說明放牧牦牛犢牛腸道菌群物種多樣性更高。

Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Spirochaetes：螺旋菌門；Proteobacteria：變形菌門；unidentified_Bacteria：未明確細菌；Actinobacteria：放線菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Cyanobacteria：藍藻菌門；Acidobacteriota：酸桿菌門；Euryarcheaota：廣古菌門。

3.2 放牧與舍飼條件下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群門水平相對豐度比較分析

有研究報道，腸道中的六大優(yōu)勢菌門分別是厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、梭桿菌門、疣微菌門，其中厚壁菌門和擬桿菌門數(shù)量最多最常見，占腸道菌群的90%[11]。厚壁菌門/擬桿菌門比值與維持體內(nèi)平衡有關(guān)，厚壁菌門/擬桿菌門比值變化可導致肥胖或者炎癥性腸病(IBD)，厚壁菌門/擬桿菌門比值上升，導致肥胖，厚壁菌門/擬桿菌門比值下降，導致IBD；大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門能夠更好的發(fā)酵和代謝碳水化合物[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，放牧條件下牦牛犢牛腸道菌群中厚壁菌門/擬桿菌門比值≥1，說明放牧條件下的犢牛更容易發(fā)生肥胖，可能與夏天草場資源較豐富有關(guān)，也有可能是因為放牧條件下犢牛的營養(yǎng)來源均是牧草，導致厚壁菌門的數(shù)量增多，從而導致厚壁菌門/擬桿菌門比值上升；舍飼條件下牦牛犢牛腸道菌群中厚壁菌門/擬桿菌門比值≤1，說明舍飼條件下的犢牛容易發(fā)生IBD，可能是因為本次試驗的舍飼犢牛是出生1月齡時從放牧條件下轉(zhuǎn)為舍飼條件的，犢牛應激狀態(tài)較為持久。擬桿菌門是降解飼料中非纖維性碳水化合物最重要的一種細菌[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，對于擬桿菌門相對豐度，舍飼條件下健康牦牛犢牛比腹瀉牦牛犢牛高出1.19%，放牧條件下健康牦牛犢牛比腹瀉牦牛犢牛高出4.17%，說明無論哪種培育條件，腹瀉均會使牦牛犢牛腸道菌群中擬桿菌門的數(shù)量下降，使得腸道菌群組成發(fā)生改變。有研究發(fā)現(xiàn)，當發(fā)生疾病時，腸道菌群逐漸由厚壁菌門轉(zhuǎn)變?yōu)樽冃尉T[14]。在本試驗中，對于變形菌門相對豐度，放牧條件下腹瀉牦牛犢牛比健康牦牛犢牛高出1.86%，舍飼條件下腹瀉牦牛犢牛比健康牦牛犢牛高出0.53%，說明腹瀉讓犢牛腸道中的優(yōu)勢菌群發(fā)生了改變。放線菌門可以分解多種有機物，可以利用不同的碳水化合物作為能源[15]。在本研究中，舍飼條件下的牦牛犢牛腸道菌群中放線菌門占總菌的比例大于放牧條件下，說明舍飼條件下的攝入的碳水化合物比放牧條件的高。有研究報道，疣微菌門在健康體重組兒童腸道內(nèi)的數(shù)量顯著高于肥胖組兒童[16]。本試驗中，放牧條件下牦牛犢牛腸道菌群中疣微菌門的相對豐度大于舍飼條件下，且厚壁菌門/擬桿菌門比值也較高，可能說明放牧條件下牦牛犢牛生長發(fā)育較好，這可能是由于舍飼條件下的犢牛從放牧狀態(tài)轉(zhuǎn)到舍飼狀態(tài)，應激狀態(tài)較為持久，導致犢牛發(fā)育較為緩慢。

圖5 脫硫桿菌門t-檢驗差異分析圖

表4 放牧與舍飼條件下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群屬水平相對豐度比較

續(xù)表4項目 Items組別 GroupsFZ FX SZ SX 蘇黎世桿菌屬 Turicibacter——1.291.82罕見小球菌屬 Subdoligranulum——1.591.39副桿菌屬 Parabacteroides——1.801.51

圖6 巴氏桿菌屬、Mailhella和薩特氏菌屬t-檢驗差異分析圖

3.3 放牧與舍飼條件下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群屬水平相對豐度比較分析

普雷沃氏菌和碳水化合物的發(fā)酵有一定的聯(lián)系，普雷沃氏菌比例越高，底物發(fā)酵程度越高[17]。而在本試驗中，放牧條件下健康牦牛犢牛腸道菌群中普雷沃氏菌科UCG-003和普雷沃氏菌科UCG-004的相對豐度高于腹瀉牦牛犢牛，說明腹瀉使得犢牛的腸道菌群組成發(fā)生了改變，影響了犢牛對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。普雷沃氏菌屬于擬桿菌門，可以高效降解半纖維素，水解蛋白質(zhì)、淀粉、發(fā)酵糖和氨基酸[18-19]。陳熙[20]研究顯示，患有腸道疾病、代謝紊亂的人群，艾克曼菌屬豐度比正常人群低；當肥胖人群進行限制高熱量飲食治療時，艾克曼菌屬豐度提高。本試驗中，放牧條件下腹瀉牦牛犢牛腸道菌群中艾克曼菌屬相對豐度比健康牦牛犢牛高出0.99%。有研究報道，克里斯滕森菌科與健康參數(shù)的關(guān)聯(lián)部分可能是由于它與高蛋白質(zhì)和纖維飲食有關(guān)[21]。放牧條件下，克里斯滕森菌科R-7群是牦牛犢牛腸道菌群中的優(yōu)勢菌屬，可能與放牧條件下牦牛犢牛的采食習性有關(guān)，放牧牦牛多以牧草為食，而牧草纖維含量較高。另枝菌屬在腸道或免疫系統(tǒng)的成熟等方面有巨大的潛力，但是還需要更多的研究來確定另枝菌屬的細菌脂質(zhì)的生化和功能作用[22]。普氏菌屬促進蛋白質(zhì)分解并且協(xié)同一些分解纖維素的菌種發(fā)揮作用，以此提高機體對纖維素的分解能力[23]。在舍飼條件下，瘤胃中普氏菌屬相對豐度顯著升高，而這主要是由于擬桿菌門相對豐度的提高[24]，從門水平來看，本次試驗中舍飼條件下牦牛犢牛腸道菌群中擬桿菌門的相對豐度高于放牧條件下，也就導致了舍飼條件下的普氏菌屬相對豐度高于放牧條件下；在劉佳星的報道中發(fā)現(xiàn)，四神丸組會讓腹瀉型腸易激綜合征大鼠的腸道菌群中的羅姆布茨菌屬和蘇黎世桿菌屬豐度顯著增加[25]；而在本試驗中發(fā)現(xiàn)，舍飼條件下的牦牛犢牛腸道中羅姆布茨菌屬和蘇黎世桿菌屬相對豐度都較高，說明舍飼條件下的牦牛犢?？赡艽嬖谝恍撛诘难装Y。擬普氏菌屬屬于擬桿菌門，是琥珀酸和醋酸的高產(chǎn)菌[26-27]，并且高水平的琥珀酸會引起炎癥、組織損傷和癌變[28-29]，而高濃度的醋酸會誘導結(jié)腸炎[30]。本試驗結(jié)果顯示，放牧條件下牦牛犢牛擬普氏菌屬的相對豐度較高，說明放牧條件下的腹瀉情況較為嚴重，需要及時治療。研究發(fā)現(xiàn)，薩特氏菌屬的豐度和炎癥細胞因子水平呈負相關(guān)，薩特氏菌屬是變形菌門中最豐富的菌屬之一。本試驗中，舍飼條件下腹瀉牦牛犢牛的變形菌門相對豐度比健康牦牛犢牛高0.63%，而薩特氏菌屬則顯著高于健康牦牛犢牛，說明薩特氏菌屬是舍飼條件下引起牦牛犢牛腹瀉的另一個重要原因。

引起巴氏桿菌病的病原體是多殺性巴氏桿菌[31]，多殺性巴氏桿菌會引起出血性敗血癥，感染動物的呼吸道[32]，臨床表現(xiàn)為高熱，排出流狀糞便，糞便中帶有黏液和血液，氣味難聞等癥狀[33]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，無論是在放牧條件下還是舍飼條件下，腹瀉牦牛犢牛的巴氏桿菌屬相對豐度均顯著高于健康牦牛犢牛，說明在這2種培育方式下巴氏桿菌屬是引起牦牛犢牛腹瀉的原因。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，隨母哺乳放牧與舍飼代乳2種培育方式下牦牛犢牛腸道菌群的多樣性和豐富度差異較大，且2種培育方式下健康與腹瀉牦牛犢牛腸道菌群組成在屬水平存在一定差異，但無論是在放牧還是舍飼條件下，腹瀉牦牛犢牛腸道菌群中的巴氏桿菌屬的相對豐度均顯著高于健康牦牛犢牛，說明巴氏桿菌屬是2種培育方式下引起牦牛犢牛發(fā)生腹瀉的共有特征。