熱應(yīng)激對肉牛血清生化指標(biāo)、瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系的影響

楊梓曼 尚相龍 陳 豪 蘭 劍 聶春桃 陳 環(huán) 瞿明仁 宋小珍

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西省動物營養(yǎng)重點實驗室/營養(yǎng)飼料開發(fā)工程研究中心，南昌 330045)

在動物生產(chǎn)中，機體因各種異常刺激而出現(xiàn)的非特異性防御反應(yīng)稱為應(yīng)激反應(yīng)；引起應(yīng)激反應(yīng)的刺激源有很多，如環(huán)境、飼養(yǎng)管理、運輸、微生物等，其中以環(huán)境刺激最為廣泛且難以避免[1]。我國南方大部分地區(qū)夏季溫度高，持續(xù)時間長，且潮濕多雨，這種環(huán)境極易誘發(fā)肉牛出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致其食欲下降、養(yǎng)分消化利用率降低、免疫力低下，大大降低了肉牛的生長性能和養(yǎng)殖效益，嚴(yán)重制約了肉牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。關(guān)于熱應(yīng)激對牛生產(chǎn)的影響，國內(nèi)外均做了大量的研究。蔡慶雙[3]研究表明，肉牛在熱應(yīng)激狀態(tài)下，機體熱平衡被破壞，產(chǎn)熱大于散熱，體內(nèi)熱量難以散發(fā)，從而導(dǎo)致體溫升高、呼吸加速等生理變化。另有報道顯示，熱應(yīng)激可引起機體甲狀腺功能減退，使血液中促甲狀腺激素(TSH)、甲狀腺素(T4)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)含量分別比適溫條件下肉牛降低了40.0%、45.4%和25.9%[4]。Kim等[5]發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激條件下，肉牛生理異常，心率和體溫、血液中皮質(zhì)醇(COR)和熱休克蛋白70(HSP70)含量均顯著升高。Brien等[6]觀察發(fā)現(xiàn)，夏季處于熱應(yīng)激狀態(tài)的雜交牛，其粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、鈣及磷的表觀消化率顯著低于非熱應(yīng)激狀態(tài)。

瘤胃是反芻動物消化養(yǎng)分的主要場所，瘤胃微生物能將飼糧中大部分養(yǎng)分降解生成揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和氨供機體代謝和利用。對反芻動物而言，維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)十分重要，一旦失衡便會直接導(dǎo)致瘤胃發(fā)酵功能紊亂，影響瘤胃健康[7]。盡管維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)對于肉牛生產(chǎn)十分重要，但是目前國內(nèi)外有關(guān)熱應(yīng)激對肉牛的影響主要集中在生長性能、生理生化等表觀指標(biāo)上。而關(guān)于熱應(yīng)激對肉牛瘤胃發(fā)酵功能的影響研究較少，從瘤胃微生物多樣性的角度出發(fā)研究其影響機理的報道則更少。因此,本試驗選擇江西省本地黃牛品種——錦江牛作為研究對象，探討熱應(yīng)激對肉牛血清生化指標(biāo)、瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系的影響，以期從瘤胃微生態(tài)的變化揭示熱應(yīng)激影響肉牛生長性能的機制，從而為后期探索緩解我國南方肉牛熱應(yīng)激的合理措施提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組設(shè)計

在江西高安裕豐農(nóng)牧業(yè)有限公司選擇體況、體重[(330±20) kg]相近、18月齡左右、飼養(yǎng)管理一致的健康錦江牛20頭，按照飼養(yǎng)時間的不同隨機分為常溫組和高溫組，每組10頭牛，單欄飼養(yǎng)。常溫組飼養(yǎng)于春季適溫環(huán)境(2020年4—5月)；高溫組飼養(yǎng)于夏季高溫高濕環(huán)境(2020年7—8月)。試驗期包括預(yù)試期10 d，正試期30 d。

1.2 飼養(yǎng)管理及基礎(chǔ)飼糧

所有試驗牛均采用舍飼飼養(yǎng)，并飼喂相同的基礎(chǔ)飼糧，每日06:00、16:00各飼喂1次，先粗后精。自由飲水，每天清掃圈舍，保持牛舍清潔衛(wèi)生。其他管理方法同牛場。

試驗牛基礎(chǔ)飼糧配方參照《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)，按肉牛體重300 kg、日增重0.5 kg的營養(yǎng)需求設(shè)計，飼糧精粗比為4∶6，其組成及營養(yǎng)水平如表1所示。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 牛舍環(huán)境的溫濕指數(shù)(THI)

在牛舍距離地面1.5 m處的位置懸掛3個溫濕度計，避免動物接觸。記錄試驗期內(nèi)每日08:00、14:00和20:00牛舍內(nèi)的溫度和相對濕度，參照Berman[8]的方法，計算牛舍THI。

THI=td-(0.55-0.55RH)×(td-58)。

式中：RH為相對濕度;td為華氏溫度。其中td=T×9/5+32，T為攝氏溫度。

1.3.2 體溫、呼吸頻率

體溫：在正試期間每隔10 d測定每頭試驗牛的肛溫，計算平均值。

呼吸頻率：在正試期間，每隔10 d測定每頭試驗牛靜臥時每分鐘腹部的起伏次數(shù)，計算平均值。

1.3.3 血清生化指標(biāo)

在正試期第30天晨飼前，每組選6頭體重相近的試驗牛，綁定后進(jìn)行頸靜脈采血。使用非抗凝真空采血管采集30 mL血液，低速離心機3 000 r/min離心15 min，分離血清并于-80 ℃保存待測。

血清中總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的測定采用比色法，參照試劑盒說明書中的推薦方法進(jìn)行試驗操作，樣品批量測定前要先設(shè)計好預(yù)試驗檢測方法的準(zhǔn)確性；血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，具體測定方法參照說明書進(jìn)行。以上所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系的測定與分析

試驗結(jié)束后，每組選4頭試驗牛屠宰，立即收集瘤胃液，4層紗布過濾后，迅速測定pH并于-80 ℃冰箱保存，分別用于分析瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系。

瘤胃pH使用S-320型酸度計測定；氨態(tài)氮(NH3-N)濃度參考馮宗慈等[9]的方法進(jìn)行測定；菌體蛋白濃度(MCP)濃度參考王敬堯[10]的考馬斯亮藍(lán)法測定；VFA含量采用氣相色譜儀(日本島津GC-2014)測定，參考曹慶云等[11]的峰面積外標(biāo)法。氣相色譜測定條件如下：色譜柱為Nukol毛細(xì)管柱；柱溫190 ℃；FID檢測器溫度250 ℃；載氣為高純氮氣(N2)，流速為75 mL/min；燃?xì)鉃闅錃?H2)，流速70 mL/min；助燃?xì)鉃榭諝?，流?0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。

對所采集的瘤胃液樣品進(jìn)行16S rRNA基因測序，測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。通過MiSeq PE300測序平臺進(jìn)行微生物多樣性檢測，分析在門水平和屬水平下的群落物種組成及豐度。以提取的樣品總DNA為模板，對細(xì)菌16S rRNA V3～V4高變區(qū)兩側(cè)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所采用的細(xì)菌通用引物序列為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) PCR。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗分析，以P<0.05為差異顯著性評判標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為差異極顯著性評判標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激對肉牛生理指標(biāo)的影響

由表2可知，與常溫組相比，高溫組的環(huán)境溫度、環(huán)境相對濕度均極顯著升高(P<0.01)，呼吸頻率顯著升高(P<0.05)，體溫有升高的趨勢(P=0.088)。常溫組平均THI為69.86，高溫組的平均THI為83.40，2組之間差異極顯著(P<0.01)。

表2 不同環(huán)境條件下的THI和肉牛體溫、呼吸頻率

2.2 熱應(yīng)激對肉牛血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，與常溫組相比，高溫組的血清T-AOC顯著降低(P<0.05)，IgA含量與GSH-Px活性均極顯著降低(P<0.01)。其他指標(biāo)組間均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 熱應(yīng)激對肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知，與常溫組相比，高溫組瘤胃NH3-N濃度顯著升高(P<0.05)，總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量極顯著降低(P<0.01)。其他指標(biāo)組間均無顯著差異(P>0.05)。

2.4 熱應(yīng)激對肉牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

2.4.1 瘤胃菌群的Venn圖

如圖1所示，常溫組的操作分類單元(OTU)總數(shù)量為1 570個，高溫組的OTU總數(shù)量為1 599個，其中包含的2組共享的OTU數(shù)量為1 362個，占OTU總數(shù)量的75.37%。常溫組獨有的OTU數(shù)量為208個，占總OTU數(shù)量的11.51%，高溫組獨有的OTU數(shù)量為237個，占總OTU數(shù)量的13.11%。

表3 熱應(yīng)激對肉牛血清生化指標(biāo)的影響

表4 熱應(yīng)激對肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

NT：常溫組 normal temperature group; HT:高溫組 high temperature group。

2.4.2 瘤胃菌群α多樣性指數(shù)

由表5可知，各樣本覆蓋指數(shù)達(dá)到0.99以上，可準(zhǔn)確地反映瘤胃中微生物群落的種類和結(jié)構(gòu)多樣性。與常溫組相比，高溫組瘤胃液微生物的Shannon、Simpson、Ace、Chao1、覆蓋指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

2.4.3 瘤胃菌群在門水平和屬水平上的組成和相對豐度

由圖2和表6可知，在門水平上，常溫組和高溫組瘤胃液的優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)，這2個菌門占總細(xì)菌比例的90%以上。與常溫組相比，高溫組的放線菌門(Actinobacteriota)的相對豐度均顯著升高(P<0.05)，脫硫桿菌門(Desulfobacterota)和Patescibacteria的相對豐度極顯著升高(P<0.01)；其他菌門相對豐度組間無顯著差異(P>0.05)。

由圖3和表7可知，在屬水平上，常溫組和高溫組的優(yōu)勢菌屬均為普雷沃氏菌屬(Prevotella)。與常溫組相比，高溫組的克里斯滕森菌科_R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、NK4A214_group和普雷沃氏菌科UCG-003(Prevotellaceae UCG-003)的相對豐度顯著降低(P<0.05)；其他菌屬相對豐度組間無顯著差異(P>0.05)。

表5 熱應(yīng)激對肉牛瘤胃菌群豐富度和多樣性的影響

Firmicutes:厚壁菌門; Bacteroidetes:擬桿菌門; Actinobacteriota:放線菌門; Desulfobacterota:脫硫桿菌門;Proteobacteria:變形菌門; Synergistetes:互養(yǎng)菌門; Unclassified_k_norank_d_Bacteria:未分類細(xì)菌; Others:其他。

表6 熱應(yīng)激對肉牛瘤胃菌群門水平相對豐度的影響

Prevotella:普雷沃氏菌屬; Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科_RC9腸道群; Succiniclasticum:解琥珀酸菌屬; Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕森菌科_R-7群; Ruminococcus:瘤胃球菌屬; Prevotellaceae UCG-003:普雷沃氏菌科UCG-003; Norank_f_Eubacterium coprotangligenes group:未明確產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群; Brevibacillus:短芽孢桿菌屬; Lachnospiraceae_XPB1014_group:毛螺菌科XPB1014群; Veillonellaceae_UCG-001:韋榮氏菌科_UCG-001; Lachnospiraceae_NK3A20_group:毛螺菌科NK3A20群; Prevotellaceae_UCG-001:普雷沃氏菌科UCG-001;Bacillus:芽孢桿菌屬; Butyrivibrio: 丁酸弧菌屬; Unclassified_f_Lachnospiraceae:未明確毛螺菌科; Norank_f_Ruminococcaceae:未明確瘤胃球菌科；Eubacterium ventriosum_group:腹真桿菌群; Anaerovibrio:厭氧弧菌屬; Desulfovibrio:脫硫弧菌屬; Uunclassified_f_Prevotellaceae:未明確普雷沃氏菌科; Norank_f_Bifidobacteriaceae:未明確雙歧桿菌科; Saccharofermentans:產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬; Desulfobulbus:脫硫球莖菌屬; Ureibacillus:尿毒桿菌屬; Lactobacillus:乳酸菌屬; Other:其他。

表7 熱應(yīng)激對肉牛瘤胃菌群屬水平相對豐度的影響

3 討 論

3.1 熱應(yīng)激對肉牛生理指標(biāo)的影響

熱應(yīng)激是指動物在受到高溫、高濕、氣流等外界刺激下出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)，引起熱應(yīng)激的刺激源主要為環(huán)境溫度和濕度。目前，生產(chǎn)上常用THI來評價動物熱應(yīng)激程度，當(dāng)72≤THI≤79，為輕度熱應(yīng)激；當(dāng)7988，為重度熱應(yīng)激[8]。本試驗結(jié)果表明，常溫組肉牛無熱應(yīng)激，高溫組肉牛處于中度熱應(yīng)激狀態(tài)。在生產(chǎn)中體溫和呼吸頻率常用作衡量肉牛受熱應(yīng)激影響程度的重要指標(biāo)。有研究報道，高溫環(huán)境會引起綿羊體溫和呼吸頻率的升高[12]。馬燕芬等[13]研究表明，肉牛在熱應(yīng)激條件下其體溫和呼吸頻率會顯著升高。本試驗研究也表明，高溫高濕條件下的肉牛體溫有升高趨勢，呼吸頻率顯著升高。分析其原因為，肉牛屬于恒溫動物，當(dāng)環(huán)境溫度超過肉牛等熱區(qū)上限溫度范圍，機體熱平衡被打破，產(chǎn)熱高于散熱，則會導(dǎo)致體溫升高，而機體會通過增強呼吸頻率和出汗量的方式來散發(fā)體內(nèi)多余熱量[14]。

3.2 熱應(yīng)激對肉牛血清生化指標(biāo)的影響

正常情況下，氧自由基在機體內(nèi)含量保持動態(tài)平衡，但受到外界刺激后，體內(nèi)氧自由基大量產(chǎn)生，過量的氧自由基無法及時被清除，則可能造成細(xì)胞氧化損傷[15]。在本研究中，熱應(yīng)激狀態(tài)下肉牛血清中T-AOC、GSH-Px活性顯著降低。T-AOC和GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化酶，可反映機體對氧自由基的清除能力。有研究報道，在遭受熱應(yīng)激侵襲時，羊血清中GSH-Px活性、T-AOC均顯著降低[16]。在肉牛研究中也有相似發(fā)現(xiàn)，王玲等[17]研究報道，肉牛在夏季高溫環(huán)境下，血清中抗氧化酶活性顯著降低。以上種種研究結(jié)果均表明熱應(yīng)激可導(dǎo)致肉?？寡趸芰ο陆怠?/p>

免疫球蛋白是具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)、與抗體分子結(jié)構(gòu)相似的球蛋白，是體內(nèi)免疫系統(tǒng)的重要組成部分。IgA是機體體液免疫系統(tǒng)的組成部分，在機體局部發(fā)生感染時產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本試驗結(jié)果表明，熱應(yīng)激肉牛血清中IgA含量極顯著降低。有研究報道，熱應(yīng)激會使得妊娠期西門塔爾牛血清中IgA、IgG含量顯著降低[18]。彭孝坤等[19]同樣發(fā)現(xiàn)，在山羊發(fā)生熱應(yīng)激時，其血清中IgA含量顯著降低。以上結(jié)果均表明，熱應(yīng)激狀態(tài)下反芻動物機體的體液免疫功能會受到抑制，而熱應(yīng)激影響血清免疫球蛋白正常分泌的機理有待進(jìn)一步研究和探討。

3.3 熱應(yīng)激對肉牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響

pH作為評價瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要指標(biāo)之一，其最適范圍為6.2～6.8，過高或過低都不利于瘤胃微生物的生存與發(fā)酵。本試驗中試驗牛瘤胃pH均在正常范圍內(nèi)，說明中度熱應(yīng)激并沒有導(dǎo)致肉牛瘤胃pH異常。NH3-N是瘤胃微生物可利用的主要氮源，其濃度反映的是瘤胃微生物對飼糧含氮物質(zhì)的降解程度及合成MCP效率之間的關(guān)系[20]。瘤胃液中NH3-N濃度過高、過低或釋放不均勻都會對瘤胃微生物產(chǎn)生不利影響。據(jù)報道，瘤胃NH3-N的適宜濃度范圍為0.35～29.00 mg/d[21]。在本試驗中，2個組瘤胃NH3-N濃度均在適宜范圍內(nèi)，但高溫組瘤胃液NH3-N濃度顯著升高，分析可能與熱應(yīng)激降低了瘤胃壁對NH3-N的吸收能力和瘤胃微生物對NH3-N的利用效率有關(guān)。VFA是瘤胃微生物的主要代謝產(chǎn)物，可為反芻動物生命活動提供70%～80%的能量[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激降低了瘤胃中VFA的含量，瘤胃液VFA含量與瘤胃微生物菌群的組成有很大關(guān)系，高溫應(yīng)激導(dǎo)致VFA含量下降可能與瘤胃纖維分解菌等豐度下降有關(guān)，這在本研究結(jié)果中也得到了證實。張燦[23]研究報道，熱應(yīng)激可顯著提高藏綿羊和山羊瘤胃液中NH3-N濃度，顯著降低VFA含量，這與本研究結(jié)果是一致的。Correia等[24]也報道，熱應(yīng)激會使肉牛瘤胃液中VFA含量降低。

3.4 熱應(yīng)激對肉牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

本試驗采用高通量測序技術(shù)檢測熱應(yīng)激肉牛的瘤胃內(nèi)容物，并對其瘤胃菌群進(jìn)行分析。測序結(jié)果顯示，常溫組與高溫組的覆蓋指數(shù)均達(dá)到0.99，說明測序樣品取樣充分，測序結(jié)果可準(zhǔn)確真實地反映肉牛瘤胃微生物菌群的種類與結(jié)構(gòu)。α多樣性指數(shù)中，Shannon和Simpson指數(shù)體現(xiàn)微生物菌群的多樣性，Chao1和Ace指數(shù)體現(xiàn)微生物菌群的豐富度。本試驗中α多樣性指數(shù)均無顯著差異，這與Tajima等[25]和Correia等[24]的研究結(jié)果相似，說明熱應(yīng)激沒有影響瘤胃細(xì)菌多樣性。

瘤胃是反芻動物營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的主要場所，瘤胃微生物可以將飼料中的纖維及非蛋白氮轉(zhuǎn)化為VFA和MCP，為動物提供能量和蛋白質(zhì)[26]。熱應(yīng)激引起的微生物群變化可能會改變瘤胃中的發(fā)酵模式，導(dǎo)致消化率、VFA產(chǎn)量以及甲烷排放量的變化。在本試驗中，2組動物瘤胃菌群優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門和厚壁菌門，占門水平總菌群數(shù)的90%以上，這與Zhang等[27]的研究結(jié)果相一致。本研究結(jié)果顯示，放線菌門、脫硫桿菌門和Patescibacteria的相對豐度均顯著增加。放線菌門為革蘭氏陽性菌，能夠代謝淀粉和低聚糖等物質(zhì)，主要代謝產(chǎn)物為乳酸和乙酸[28]；脫硫桿菌門屬于變形菌門，能氧化乳酸、丙酮酸等產(chǎn)生乙酸和二氧化碳。有報道表明，荷斯坦牛瘤胃中Patescibacteria的相對豐度與環(huán)境溫度呈正相關(guān)[29]，這與本試驗結(jié)果相一致。但是，Kim等[30]研究報道，反芻動物瘤胃內(nèi)的放線菌門和脫硫桿菌門的相對豐度均會受熱應(yīng)激的影響而降低。Zhao等[31]發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激發(fā)生后，瘤胃菌群中的乳酸菌種類增多，乙酸菌種類減少。這與本研究結(jié)果不一致，分析可能與熱應(yīng)激程度及瘤胃微生物菌群互相作用有關(guān)，有關(guān)機制還需要進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示中，常溫組與高溫組瘤胃菌群的優(yōu)勢菌屬均為普雷沃氏菌屬，這在前人的研究中也得到證實[32]。普雷沃菌屬與普雷沃氏菌科UCG-003都屬于擬桿菌門，可對飼糧中的蛋白質(zhì)、淀粉、寡糖及半纖維素產(chǎn)生積極降解作用，產(chǎn)生乙酸、丙酸等VFA[33-34]。本試驗中，高溫組普雷沃菌屬的相對豐度無顯著差異，但普雷沃氏菌科UCG-003的相對豐度顯著降低，這可能是導(dǎo)致瘤胃VFA含量顯著下降的主要原因。此外，克里斯滕森菌科_R-7群和NK4A214_group屬于厚壁菌門，可產(chǎn)生纖維素酶和半纖維素酶分解瘤胃中的粗纖維產(chǎn)生VFA。本試驗結(jié)果顯示，克里斯滕森菌科_R-7群和NK4A214_group的相對豐度顯著降低，說明熱應(yīng)激狀態(tài)下肉牛瘤胃對纖維的降解作用受到抑制，這與高溫組瘤胃TVFA含量顯著下降的結(jié)果是一致的。

4 結(jié) 論

夏季熱應(yīng)激導(dǎo)致肉牛體溫、呼吸頻率升高，血清抗氧化能力、免疫功能下降，瘤胃菌群中纖維素分解菌豐富度降低，瘤胃液VFA含量下降，NH3-N濃度升高，但不影響瘤胃細(xì)菌的多樣性。