蛋氨酸羥基類似物異丙酯對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃發(fā)酵及微生物區(qū)系的影響

馬麗琴 王 玲 溫 萬 田 佳 周佳敏 王鳳蓮 馬旭林 陳 昊

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏回族自治區(qū)畜牧工作站，銀川 750002)

圍產(chǎn)期是奶牛泌乳周期中最為關(guān)鍵的階段，其涉及胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育、機(jī)體的健康維持、乳腺的更新和修復(fù)及泌乳啟動(dòng)等重要生理過程，圍產(chǎn)期奶牛由于分娩應(yīng)激、采食量下降及內(nèi)分泌激素的劇烈變化，導(dǎo)致奶牛出現(xiàn)免疫抑制和氧化應(yīng)激[1-2]，易誘發(fā)生產(chǎn)癱瘓、真胃移位、脂肪肝和酮病、瘤胃酸中毒、胎衣不下、乳房炎等代謝性疾病，增加淘汰風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有75%的奶牛疾病是發(fā)生在圍產(chǎn)期，產(chǎn)后1個(gè)月內(nèi)尤為嚴(yán)重[3-4]，因此，如何有效緩解圍產(chǎn)期奶牛應(yīng)激及營(yíng)養(yǎng)調(diào)控，對(duì)圍產(chǎn)期奶牛生產(chǎn)性能的發(fā)揮及奶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

蛋氨酸(Met)和賴氨酸(Lys)是反芻動(dòng)物首要限制性氨基酸，兩者的限制順序因飼糧的不同而不同[5]。大量研究證明，當(dāng)奶牛飼喂以玉米為基礎(chǔ)的飼糧時(shí)，Met和Lys是限制性最高的2種氨基酸[6]，當(dāng)奶牛飼喂玉米-豆粕型飼糧時(shí)，Met是第一限制性氨基酸[7]。近年來，有研究表明，Met對(duì)奶牛免疫功能[8]、乳蛋白質(zhì)合成[9]和含硫抗氧化物合成[10]等方面有著重要的調(diào)控作用。因此，本研究旨在探討圍產(chǎn)前期添加蛋氨酸羥基類似物異丙酯(HMBi)的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)措施是否對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃發(fā)酵及微生物區(qū)系產(chǎn)生影響，以期為緩解圍產(chǎn)期奶牛的應(yīng)激及泌乳早期的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇40頭健康的荷斯坦圍產(chǎn)期奶牛，根據(jù)年齡、體況、胎次、預(yù)產(chǎn)期及上一胎次泌乳量相近原則進(jìn)行配對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20頭牛，試驗(yàn)?zāi)膛７纸M情況見表1。在圍產(chǎn)前期，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在飼喂基礎(chǔ)飼糧的同時(shí)補(bǔ)充30 g/d HMBi(占干物質(zhì)采食量的0.19%[8，11])，在圍產(chǎn)后期2組飼喂相同飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2，試驗(yàn)期44 d。試驗(yàn)期間，奶牛飼養(yǎng)管理按牧場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)管理流程執(zhí)行(飼喂全混合日糧，每日2次；散欄式飼養(yǎng)，自由飲水，自由采食)。

表1 試驗(yàn)?zāi)膛７纸M情況

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表2項(xiàng)目 Items圍產(chǎn)前期Early perinatal period圍產(chǎn)后期Post-perinatal period鈣 Ca0.770.98磷 P0.340.52

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 瘤胃液的采集

根據(jù)年齡、體況、胎次、預(yù)產(chǎn)期及上一胎次泌乳量相近的原則，試驗(yàn)組與對(duì)照組各選擇6頭奶牛，分別于產(chǎn)前7 d(-7 d)和產(chǎn)后7 d(+7 d)晨飼前用胃管式牛瘤胃液采樣器采集瘤胃液50 mL，經(jīng)4層紗布過濾，用臺(tái)式酸度計(jì)測(cè)定瘤胃液pH。將濾液分裝于5和10 mL無菌凍存管中，隨后置于液氮速凍后置于-80 ℃的冰箱內(nèi)保存，用于測(cè)定各組奶牛分娩前后瘤胃發(fā)酵指標(biāo)和微生物區(qū)系的變化。

用氣相色譜儀(日本島津GC-2014C)測(cè)定瘤胃液中的總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸的濃度[12]。利用比色法測(cè)定瘤胃液NH3-N濃度[13]。MCP含量采用嘌呤堿基法[14]測(cè)定。

1.2.3 瘤胃液微生物總DNA提取及瘤胃微生物測(cè)定

使用Hipure Soil DNA提取試劑盒(Magen公司)抽提瘤胃液總DNA，DNA提取完成后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法對(duì)DNA的純度及濃度進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)檢合格的樣品-20 ℃保存。取適量檢測(cè)合格的DNA樣品于離心管中進(jìn)行稀釋，將稀釋后的基因組DNA作為模板，DNA擴(kuò)增目的片段為V3～V4區(qū)(測(cè)序引物為341F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)，PCR擴(kuò)增完成后，用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用AMPure XP Beads對(duì)第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，用ABI Steponeplus Real-Time PCR System(Life Technologies)進(jìn)行定量，根據(jù)Illumina HiSeq2500的PE250模式Pooling上機(jī)測(cè)序。測(cè)序完成后，原始讀數(shù)據(jù)上傳在NCBI SRA(Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫。

使用UPARSE流程將clean tag按≥97%相似度聚類為操作分類單元(OTU)。選取豐度最高的tag序列作為每個(gè)OTU的代表序列。OTU代表序列比對(duì)Greengene數(shù)據(jù)庫使用RDP注釋軟件(2.2)的樸素貝葉斯模型進(jìn)行物種分類注釋，置信閾值設(shè)為0.8～1.0。使用Krona(2.6)顯示每個(gè)物種分類的豐度統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理后，采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Alpha多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)采用ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan氏法對(duì)平均值進(jìn)行多重比較。以P≤0.05為差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 HMBi對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表3可知，試驗(yàn)組奶牛產(chǎn)后瘤胃液NH3-N濃度顯著低于對(duì)照奶牛(P≤0.05)，試驗(yàn)組與對(duì)照組產(chǎn)前瘤胃液NH3-N濃度差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)組與對(duì)照組奶牛在分娩前后瘤胃液pH，MCP含量，TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度及乙酸/丙酸沒有顯著差異(P>0.05)。

表3 添加HMBi對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

續(xù)表3項(xiàng)目Items時(shí)間Time/d對(duì)照組 Control group試驗(yàn)組 Test groupSEMP值P-value氨態(tài)氮 NH3-N/(mg/dL)-74.704.543.650.52+73.92a2.33b0.410.05微生物蛋白 MCP/(mg/dL)-72.222.300.230.87+71.361.920.180.12

2.2 HMBi對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌的影響

2.2.1 添加HMBi對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌Alpha多樣性的影響

由表4可知，在圍產(chǎn)期，試驗(yàn)組Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)均高于對(duì)照組(P>0.05)，產(chǎn)前試驗(yàn)組Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)較對(duì)照組分別提高了3.65%和2.86%，產(chǎn)后試驗(yàn)組Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)較對(duì)照組分別提高了14.96%和13.08%，試驗(yàn)組奶牛產(chǎn)前ACE指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，產(chǎn)后試驗(yàn)組ACE指數(shù)較對(duì)照組提高了9.13%；產(chǎn)后試驗(yàn)組Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，產(chǎn)前試驗(yàn)組Shannon指數(shù)較對(duì)照組提高了0.80%，但無顯著差異(P>0.05)。

雖然跨境電商零售從貿(mào)易的范圍大小有廣義和狹義之分，但在海關(guān)看來，跨境電商零售主要針對(duì)的是C類消費(fèi)者，即終端個(gè)人消費(fèi)者。本文主要研究面向終端個(gè)人消費(fèi)者的跨境電商零售。按貿(mào)易的進(jìn)出口方向，跨境電商零售還可分為本國(guó)商品銷售至海外的跨境電商零售出口和海外商品銷售至跨境電商零售進(jìn)口。早在2003年，跨境電商零售出口就已經(jīng)開始出現(xiàn)，其主要經(jīng)營(yíng)模式有兩種：一種是第三方平臺(tái)模式，即為國(guó)內(nèi)賣家和國(guó)外消費(fèi)者提供一個(gè)統(tǒng)一的交易平臺(tái)；另一種是自建平臺(tái)型，將國(guó)內(nèi)的外貿(mào)企業(yè)作為自己的供應(yīng)商，通過自身的銷售平臺(tái)，面向海外消費(fèi)者銷售商品。

表4 添加HMBi對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌Alpha多樣性的影響

2.2.2 添加HMBi對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌Beta多樣性的影響

由表5可知，產(chǎn)前對(duì)照組(CK-1組)與產(chǎn)前試驗(yàn)組(T-1組)瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組間差異不顯著(R<0.30，且P>0.05)，產(chǎn)后對(duì)照組(CK-2組)與產(chǎn)后試驗(yàn)組(T-2組)瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在差異趨勢(shì)(0.300.75，且P<0.05)。由此可知，在產(chǎn)前試驗(yàn)組與對(duì)照組奶牛瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，產(chǎn)后試驗(yàn)組與對(duì)照組奶牛瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在差異趨勢(shì)，并且產(chǎn)后試驗(yàn)組與對(duì)照組奶牛瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)較產(chǎn)前發(fā)生了極顯著變化。

表5 基于OTU水平圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌組間相似性分析

在主坐標(biāo)分析(PCoA)中，主成分的貢獻(xiàn)值分別為22.87%、27.49%。由圖1可見，CK-1組與T-1組樣本間距離較近，且分布聚焦，說明在圍產(chǎn)前期試驗(yàn)組與對(duì)照組樣本組間和組內(nèi)差異較小，CK-2組內(nèi)樣本間距離較遠(yuǎn)且分布較為離散，說明產(chǎn)后對(duì)照組樣本組內(nèi)個(gè)體差異較大，T-2組樣本間距離比較接近，提示添加HMBi對(duì)于維持圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌菌群平衡具有積極作用。

圖1 圍產(chǎn)期奶牛瘤胃液樣品的主坐標(biāo)分析

2.2.3 添加HMBi對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.3.1 瘤胃細(xì)菌門水平組成差異分析

本試驗(yàn)共鑒定出16個(gè)菌門，其中厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)4個(gè)主要細(xì)菌門類相對(duì)豐度總和占到總菌的93%以上，是圍產(chǎn)期奶牛瘤胃優(yōu)勢(shì)菌門(圖2)。圍產(chǎn)期奶牛瘤胃液樣品細(xì)菌門水平的菌群組成如表6所示。對(duì)瘤胃細(xì)菌門水平組成差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明，產(chǎn)前對(duì)照組奶牛瘤胃厚壁菌門相對(duì)豐度極顯著高于試驗(yàn)組(P<0.01)，但在產(chǎn)后2組間差異不顯著(P>0.05)；與對(duì)照組相比，產(chǎn)后試驗(yàn)組奶牛瘤胃纖維桿菌門(Fibrobacteres)相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，產(chǎn)前試驗(yàn)組奶牛瘤胃Kiritimatiellaeota相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；產(chǎn)后試驗(yàn)組奶牛瘤胃變形菌門相對(duì)豐度極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，產(chǎn)后試驗(yàn)組奶牛瘤胃Patescibacteria、Kiritimatiellaeota、浮霉菌門及螺旋體門相對(duì)豐度有線性增加的趨勢(shì)(0.05

2.2.3.2 瘤胃細(xì)菌屬水平組成差異分析

本試驗(yàn)共鑒定出119個(gè)屬水平的菌群，普雷沃氏菌屬1(Prevotella_1)、理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、普雷沃氏菌屬7(Prevotella_7)、瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)等是組成圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌群落的主要菌屬類(圖3)。奶牛瘤胃液樣品細(xì)菌屬水平的菌群組成如表7所示。對(duì)瘤胃細(xì)菌屬水平組成差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明，產(chǎn)前試驗(yàn)組奶牛瘤胃解琥珀酸弧菌科UCG-001(Succinivibrionaceae_UCG-001)、互營(yíng)球菌屬(Syntrophococcus)的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；產(chǎn)后試驗(yàn)組奶牛瘤胃瘤胃球菌科_UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005)、瘤胃球菌屬1(Ruminococcus_1)、厭氧弧菌屬(Anaerovorax)的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，歐氏菌屬(Olsenella)的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Actinobacteria：放線菌門；Euryarchaeota：廣古菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Cyanobacteria：藍(lán)藻門；Planctomycetes：浮霉菌門；Other：其他；Unclassified：未分類。

表6 添加HMBi對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌門水平組成的影響

續(xù)表6項(xiàng)目Items時(shí)間Time/d對(duì)照組 Control group試驗(yàn)組 Test groupSEMP值P-value螺旋體門 -70.410.400.040.89 Spirochaetes+70.110.270.050.09 纖維桿菌門 -70.230.200.020.44 Fibrobacteres+70.03b0.10a0.010.01 疣微菌門 -70.190.240.040.59 Verrucomicrobia+70.050.040.020.83 黏膠球形菌門 -70.130.190.020.22 Lentisphaerae+70.010.040.010.28 WPS-2-70.170.130.020.26 +70.010.030.010.25 梭桿菌門Fusobacteria-70.0030.0030.000.74 +70.0200.0040.010.32

Prevotella_1：普雷沃氏菌屬1；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9腸道群；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科R-7群；Prevotella_7：普雷沃氏菌屬7；Ruminococcaceae_NK4A214_group：瘤胃球菌科NK4A214群；Saccharofermentans：產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌；Ruminococcus_2：瘤胃球菌屬2；Ruminococcus_1：瘤胃球菌屬1；Succiniclasticum：解琥珀酸弧菌屬；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌科UCG-001；Other：其他；Unclassified：未分類。

表7 添加HMBi對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌屬水平組成的影響(相對(duì)豐度在1%以上)

續(xù)表7項(xiàng)目Items時(shí)間Time/d對(duì)照組 Control group試驗(yàn)組 Test groupSEMP值P-value解琥珀酸弧菌屬-71.031.230.070.20Succiniclasticum+71.682.790.370.14解琥珀酸弧菌科UCG-001-70.01b0.03a0.040.01Succinivibrionaceae_UCG-001+70.860.870.0040.99瘤胃球菌科NK4A214群-74.324.390.260.90Ruminococcaceae_NK4A214_group+71.743.160.410.09瘤胃球菌科UCG-005-72.622.860.170.51Ruminococcaceae_UCG-005+70.24b0.69a0.090.01瘤胃球菌科UCG-010-72.122.030.110.70Ruminococcaceae_UCG-010+70.230.510.090.13瘤胃球菌科UCG-014-71.881.710.120.53Ruminococcaceae_UCG-014+71.281.530.270.66瘤胃球菌屬1-72.792.660.250.81Ruminococcus_1+70.96b1.90a0.240.04瘤胃球菌屬2-71.111.340.110.30Ruminococcus_2+73.502.410.180.67厭氧弧菌屬-71.050.950.070.49Anaerovorax+70.15b0.37a0.050.03互營(yíng)球菌屬-70.02b0.07a0.010.04Syntrophococcus+71.18a0.10b0.240.03歐氏菌屬-70.350.370.020.72Olsenella+71.30a0.66b0.160.04產(chǎn)糞甾醇真桿菌科群-72.121.930.070.19Eubacterium_coprostanoligenes_group+70.620.860.120.34嚙齒真桿菌群-71.060.940.090.54Eubacterium_ruminantium_group+71.072.050.450.31毛螺旋菌屬-70.060.080.010.48Lachnospira+71.260.520.250.15毛螺旋菌科NK3A20群-70.951.010.090.72Lachnospiraceae_NK3A20_group+72.420.990.510.20理研菌科RC9腸道群-79.359.660.200.46Rikenellaceae_RC9_gut_group+71.934.060.640.10克里斯滕森菌科R-7群-79.578.010.600.21Christensenellaceae_R-7_group+71.443.050.550.16

3 討 論

3.1 HMBi對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃液VFA是反芻動(dòng)物瘤胃微生物降解碳水化合物過程中產(chǎn)生的主要產(chǎn)物，是瘤胃微生物及動(dòng)物本身主要的能量來源，其濃度和組成是反映瘤胃消化代謝活動(dòng)是否正常的重要指標(biāo)之一。VFA主要包括乙酸、丙酸和丁酸，其總濃度的高低及其相對(duì)比例受飼糧結(jié)構(gòu)、干物質(zhì)采食量水平等因素影響，瘤胃液VFA的濃度高低可以反映瘤胃的發(fā)酵類型和VFA的吸收利用情況，瘤胃液TVFA濃度的增加表明瘤胃微生物對(duì)碳水化合物的降解能力有所增強(qiáng)。本研究中，添加HMBi對(duì)瘤胃液TVFA、乙酸、丙酸、丁酸的濃度及乙酸/丙酸沒有表現(xiàn)出顯著影響。此外，隨著產(chǎn)后奶牛飼糧中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物水平的升高，產(chǎn)后奶牛瘤胃液TVFA、乙酸、丙酸和丁酸濃度也明顯升高。劉宏波[15]和周帥等[16]的體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，添加HMB可以提高瘤胃TVFA的濃度。Noftsger等[17]的體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，添加HMB對(duì)奶牛瘤胃液TVFA濃度沒有顯著影響，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致，由此可見，添加HMB對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵的影響不一致，這可能與試驗(yàn)方法、HMB的類型及其添加劑量和作用時(shí)間有關(guān)。Koenig等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HMB能夠增加瘤胃乙酸的比例，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

相對(duì)穩(wěn)定的瘤胃內(nèi)環(huán)境是瘤胃微生物定植與功能發(fā)揮的重要條件。瘤胃pH是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵狀況的重要指標(biāo)，與飼糧組成、采食水平、反芻時(shí)間、瘤胃中VFA及其他有機(jī)酸的濃度有關(guān)。本試驗(yàn)中，添加HMBi對(duì)瘤胃液pH無顯著影響，但隨著產(chǎn)后奶牛飼糧能量水平的提高，各組瘤胃液pH都有明顯的下降趨勢(shì)，產(chǎn)后試驗(yàn)組與對(duì)照組奶牛瘤胃pH較產(chǎn)前分別降低17.06%和22.28%。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組奶牛瘤胃液pH在產(chǎn)前和產(chǎn)后更趨近于瘤胃微生物最適生長(zhǎng)的pH范圍(pH=6～7)[19]。NH3-N是瘤胃微生物降解飼糧中肽類、氨基酸、氨、非蛋白氮及內(nèi)源蛋白質(zhì)的主要產(chǎn)物，同時(shí)也是合成MCP的重要氮源。通常情況下，瘤胃內(nèi)NH3-N濃度可以反映瘤胃可代謝蛋白質(zhì)的降解和瘤胃微生物對(duì)NH3-N的吸收和利用情況，如果瘤胃NH3-N濃度過低則MCP合成受阻，過高則影響NH3-N吸收和利用的速度，造成氮源的浪費(fèi)。有學(xué)者研究表明，在奶牛飼糧中添加過瘤胃蛋氨酸可顯著降低瘤胃NH3-N濃度，提高瘤胃微生物對(duì)NH3-N的利用率，進(jìn)而提高瘤胃MCP的產(chǎn)量[20-21]，本試驗(yàn)中，添加HMBi降低了產(chǎn)前和產(chǎn)后奶牛瘤胃NH3-N濃度，增加了MCP產(chǎn)量，與上述研究結(jié)果一致。結(jié)果提示飼糧中添加HMBi可以提高瘤胃微生物對(duì)NH3-N的利用率，促進(jìn)MCP的合成。

3.2 HMBi對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

目前，已有大量的研究證明飼糧結(jié)構(gòu)、品種、年齡、飼喂方式和機(jī)體健康狀況等與反芻動(dòng)物瘤胃微生物的豐度和多樣性密切相關(guān)[22-23]。圍產(chǎn)期奶牛由于生理代謝和飼糧結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化，在分娩前后奶牛瘤胃微生物豐富度、多樣性及菌群結(jié)構(gòu)等都發(fā)生了顯著變化。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，產(chǎn)后試驗(yàn)組與對(duì)照組奶牛瘤胃細(xì)菌的豐富度和多樣性均低于產(chǎn)前，產(chǎn)后奶牛瘤胃細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)與產(chǎn)前奶牛存在差異，與Lima等[24]的研究結(jié)果一致。在奶牛分娩前后，試驗(yàn)組Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于對(duì)照組，表明添加HMBi提高了圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌豐富度和多樣性，推測(cè)可能是因?yàn)樘砑親MBi平衡了產(chǎn)前奶牛飼糧中Lys和Met的比例，降低了奶牛分娩前后瘤胃NH3-N濃度，提高了可代謝蛋白質(zhì)的利用率，而導(dǎo)致奶牛瘤胃細(xì)菌豐富度和多樣性出現(xiàn)差異。通過對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌Beta多樣性分析，結(jié)果表明，在產(chǎn)前試驗(yàn)組與對(duì)照組樣本間距離較近且分布聚焦，在產(chǎn)后試驗(yàn)組與對(duì)照組樣本距離較遠(yuǎn)且分布離散，提示添加HMBi未對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)造成明顯的影響。

本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組與對(duì)照組奶牛瘤胃微生物的優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，與前人在奶牛瘤胃微生物區(qū)系上的研究結(jié)果[25]一致。通過對(duì)不同組奶牛產(chǎn)前和產(chǎn)后瘤胃細(xì)菌進(jìn)行分析，在門水平上，產(chǎn)前試驗(yàn)組奶牛瘤胃厚壁菌門相對(duì)豐度極顯著降低，Kiritimatiellaeota相對(duì)豐度顯著升高；產(chǎn)后試驗(yàn)組奶牛瘤胃變形菌門相對(duì)豐度極顯著降低，纖維桿菌門相對(duì)豐度顯著升高，Patescibacteria、浮霉菌門、螺旋體門相對(duì)豐度有提高的趨勢(shì)。在屬水平上，產(chǎn)前試驗(yàn)組奶牛瘤胃解琥珀酸弧菌科UCG_001、互營(yíng)球菌屬相對(duì)豐度顯著升高，普雷沃氏菌屬7相對(duì)豐度有提高的趨勢(shì)；產(chǎn)后試驗(yàn)組奶牛瘤胃球菌科UCG_005、瘤胃球菌屬1、厭氧弧菌屬相對(duì)豐度顯著提高，歐氏菌屬相對(duì)豐度顯著降低，與其他學(xué)者[26-27]報(bào)道的關(guān)于圍產(chǎn)期奶牛瘤胃菌群變化規(guī)律相似。在分娩前后，產(chǎn)后試驗(yàn)組與對(duì)照組瘤胃纖維桿菌門相對(duì)豐度均低于產(chǎn)前，但在產(chǎn)后試驗(yàn)組纖維菌門相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，表明從產(chǎn)前到產(chǎn)后這一過程導(dǎo)致瘤胃細(xì)菌對(duì)飼料纖維的降解能力降低，這可能與奶牛飼糧結(jié)構(gòu)從產(chǎn)前低淀粉飼糧轉(zhuǎn)換為產(chǎn)后高精料飼糧，飼糧中精粗比的變化導(dǎo)致纖維素分解菌和淀粉分解菌的豐度變化關(guān)[28-29]，同時(shí)說明添加HMBi提高了奶牛產(chǎn)后纖維桿菌門相對(duì)豐度，進(jìn)而提高了瘤胃細(xì)菌對(duì)飼料纖維素的降解能力，與前人的研究結(jié)果[30]相似。相關(guān)研究表明，當(dāng)奶牛飼糧結(jié)構(gòu)由低能飼糧轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣茱暭Z時(shí)，瘤胃菌群中的擬桿菌門相對(duì)豐度會(huì)顯著降低，而厚壁菌門的相對(duì)豐度會(huì)顯著升高[31]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果不一致，可能是由于奶牛在產(chǎn)后飼糧的泌乳凈能盡管已由產(chǎn)前的5.98 MJ/kg提升至產(chǎn)后7.24 MJ/kg，但由于奶牛產(chǎn)后干物質(zhì)采食量尚未恢復(fù)，加之奶牛分娩與采樣時(shí)間間隔過短，導(dǎo)致瘤胃細(xì)菌的適應(yīng)能力降低。變形菌門是動(dòng)物胃腸道菌群平衡的關(guān)鍵指示物，如果變形菌門的相對(duì)豐度顯著增加，可以間接表明動(dòng)物胃腸道菌群失調(diào)[32]。本試驗(yàn)中，產(chǎn)后對(duì)照組奶牛瘤胃變形菌門相對(duì)豐度極顯著高于試驗(yàn)組，與徐曉峰等[33]的研究結(jié)果相似，而試驗(yàn)組奶牛變形菌門相對(duì)豐度在分娩前后差異較小，可以推斷，添加HMBi在維持奶牛產(chǎn)后瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的平衡和瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的平衡等方面具有積極作用。

4 結(jié) 論

① 添加HMBi顯著降低了產(chǎn)后奶牛瘤胃液NH3-N濃度，對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃MCP合成及瘤胃液pH，TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度及乙酸/丙酸沒有表現(xiàn)出顯著影響。

② 添加HMBi提高了圍產(chǎn)期奶牛瘤胃細(xì)菌豐富度和多樣性，并對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)有一定影響。

③ 在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加30 g/d HMBi，提高了產(chǎn)后奶牛瘤胃纖維桿菌門、瘤胃球菌科UCG-005、厭氧弧菌屬的相對(duì)豐度，降低了變形菌門的相對(duì)豐度，在一定程度上提高了瘤胃細(xì)菌對(duì)飼糧纖維、淀粉等物質(zhì)的消化能力，提升了瘤胃細(xì)菌對(duì)產(chǎn)后高淀粉飼糧結(jié)構(gòu)的適應(yīng)能力，改善了產(chǎn)后奶牛瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡等問題。