基于Notch通路研究川芎嗪注射液對老年心肌梗死大鼠心肌細胞增殖、凋亡的影響

紀新博 符碧薇 顧申紅 陳菊明 麥華德 林蕓蕓 楊智

(海南醫(yī)學院 1第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科，海南 ?？?570102；2基礎(chǔ)醫(yī)學與生命科學學院)

心肌梗死屬心血管常見危重癥之一，病情發(fā)展迅速且病死率高，心肌梗死后心肌細胞受損導致心功能不全，嚴重影響機體健康，減少心肌細胞損傷對于改善心功能具有重要意義〔1〕。川芎嗪作為中藥川芎的有效單體成分，具有改善微循環(huán)、活血化瘀等功效，對心肌梗死大鼠具有保護作用〔2〕，川芎嗪亦可抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡過程實現(xiàn)對疾病的保護〔3,4〕，但在心肌梗死中其是否可影響心肌梗死區(qū)細胞增殖、凋亡情況尚不清楚。因此，本研究采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法建立老年心肌梗死大鼠模型，探討川芎嗪注射液對老年心肌梗死大鼠心肌細胞增殖、凋亡的影響并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性SPF級大鼠，6～10月齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2018-0012。飼養(yǎng)條件：21～25℃，濕度40%～60%，12 h光照/12 h黑暗處理，正常飲水攝食。本實驗動物在海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院暫養(yǎng)7 d進行實驗，本研究經(jīng)海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理協(xié)會審核并通過。

1.2試劑與儀器 川芎嗪注射液(北京市燕京藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H20163160)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(北京凱瑞基生物技術(shù)有限公司，貨號：120662)；Ki67蛋白抗體(Anti-Ki67)、一抗兔抗鼠Notch、Ki67、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-1)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，二抗山羊抗兔IgG(美國Abcam公司，貨號分別為：ab197234、ab52627、ab15580、ab179515、ab181602、ab150077)；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：C1062S)；多普勒超聲診斷儀(濮陽市滬康醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號：DW-C8)。

1.3研究方法

1.3.1模型建立及藥物處理 實驗前大鼠禁食過夜，26只大鼠參考文獻方法〔5〕建模，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，固定于實驗臺上，頸正中切口，暴露出心臟后分離右頸總動脈，心導管經(jīng)右側(cè)心動脈插入左心室并連接呼吸機；而后左胸第4肋間剪段肋骨，暴露出左心耳和左心室，分離做冠狀動脈前降支并結(jié)扎，檢測大鼠心電圖(ECG)，以ECG ST段明顯抬高為模型制備成功標志，共建模成功24只。模型成功后隨機分為模型組和干預組，每組12只，假手術(shù)組僅打開胸腔暴露出心臟但不結(jié)扎。

干預組每天腹腔注射120 mg/kg川芎嗪注射液〔6〕，假手術(shù)組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水，連續(xù)6 w。

1.3.2多普勒超聲檢測心功能指標 實驗結(jié)束后，超聲診斷儀檢測左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室射血分數(shù)(LVEF)。

1.3.3TTC染色檢測心肌梗死體積 超聲后迅速處死大鼠，其中4只摘除心臟，置于預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗，-20℃冷凍25 min，平行心室橫切成6片，0.1% TTC中37℃孵育15 min，10%甲醛中室溫固定1 h，拍照并用ImageJ軟件分析梗死百分比。正常心肌呈紅色，梗死區(qū)呈白色。

1.3.4免疫熒光檢測心肌組織中細胞增殖蛋白Ki67水平 超聲后迅速處死剩余大鼠，模型組取梗死區(qū)域組織，假手術(shù)組、干預組相同部位取心肌組織，部分置于4%多聚甲醛中制冰凍切片；部分組織置于-20℃冰箱當天待用；部分置于-80℃冰箱保存。冰凍切片置于4℃丙酮中固定10 min，通風后PBS漂洗，0.5%牛血清白蛋白(BSA)滴加切片中，室溫封閉40 min，加一抗Ki67，4℃孵育過夜；加熒光標記的二抗，核復染，共聚焦顯微鏡、Image J軟件分析增殖蛋白Ki67的免疫熒光圖像。

1.3.5流式細胞術(shù)檢測心肌組織凋亡情況 -20℃冰箱中取出心肌組織，眼科剪剪成糜狀，PBS沖洗去除血細胞，膠原酶消化15 min，吸上清繼續(xù)消化25 min，上清置于300目網(wǎng)篩，反復消化直至組織消化完全，取心肌細胞單細胞懸浮液100 μl(5×107個細胞)，加入5 μl Annexin-FITC和2.5 μl碘化丙啶(PI)溶液，避光孵育10 min后添加400 μl緩沖液，30 min內(nèi)上機檢測并分析。

1.3.6Western印跡檢測心肌組織中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白表達情況 從-80℃冰箱中取出心肌組織，RIPA裂解液冰上裂解心肌組織20 min，提取總蛋白，上樣20 μg行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜后封閉，一抗Notch、Ki67、Caspase-1、GAPDH，4℃孵育過夜，加入對應二抗，顯色并定量分析，蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1川芎嗪注射液對大鼠心功能影響 與假手術(shù)組相比，模型組心功能指標LVEDD、LVESD顯著升高，LVEF顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，干預組心功能指標LVEDD、LVESD顯著降低，LVEF顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2川芎嗪注射液對大鼠心肌梗死情況的影響 與假手術(shù)組相比，模型組心肌梗死體積顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，干預組心肌梗死體積顯著降低(P<0.05)。見表2、圖1。

2.3川芎嗪注射液對大鼠心肌細胞增殖的影響 與假手術(shù)組相比，模型組Ki67細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，干預組Ki67細胞數(shù)量顯著升高(P<0.05)。見表2、圖2。

表1 3組心功能指標比較

表2 3組心肌梗死體積、心肌細胞凋亡、Ki67細胞數(shù)量比較

2.4川芎嗪注射液對大鼠心肌細胞凋亡的影響 與假手術(shù)組相比，模型組心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，干預組心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表2、圖3。

2.5川芎嗪注射液對大鼠心肌組織中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白的影響 與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織中Notch、Caspase-1蛋白水平顯著升高、Ki67蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，干預組心肌組織中Notch、Caspase-1蛋白水平顯著降低、Ki67蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表3、圖4。

圖1 3組大鼠心肌梗死體積

藍色-DAPI，紅色-Ki67圖2 3組大鼠心肌細胞增殖情況(免疫熒光染色，×200)

圖3 3組大鼠心肌細胞凋亡情況

表3 3組心肌組織中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白水平比較

圖4 3組大鼠心肌組織中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白表達

3 討 論

人口老齡化加劇會導致心肌梗死發(fā)病率升高，嚴重影響患者生存質(zhì)量和存活壽命〔7〕?；颊咴谘鲃恿W、神經(jīng)體液等作用下易發(fā)生心肌重構(gòu)，表現(xiàn)為左心室形狀及結(jié)構(gòu)改變，伴有心肌細胞肥大、代償性肥厚等出現(xiàn)，最終發(fā)生心力衰竭〔8〕。川芎在臨床上具有活血化瘀功效，川芎嗪作為川芎主要有效成分之一，可改善血流動力學、神經(jīng)功能指標，從而治療血管類疾病〔9〕。本研究結(jié)果提示左冠狀動脈前降支結(jié)扎建立老年心肌梗死大鼠模型后，心肌組織出現(xiàn)大面積梗死，且心功能發(fā)生變化，若持續(xù)梗死則可能造成心肌缺血導致心肌細胞壞死和凋亡、抑制細胞增殖等現(xiàn)象；川芎嗪干預心肌梗死模型大鼠后，心肌梗死現(xiàn)象得到緩解，心肌狀況、心功能有所改善。

細胞增殖可以誘導內(nèi)皮細胞增生，形成心血管，從而影響疾病進程〔10〕。誘導胚胎干細胞衍生的心肌細胞核內(nèi)皮細胞增殖，可促進血管生成，從而改善心功能、增加毛細血管密度，進而緩解受損心肌情況，緩解心肌梗死情況〔11〕。增殖蛋白Ki67作為標志性增殖蛋白，反映心肌細胞再生情況〔12，13〕；在急性心肌梗死中其水平下降，與血流動力學和心肌氧化應激損傷關(guān)系密切〔14〕。本研究結(jié)果提示可能心肌梗死情況下心肌細胞增殖降低，不能形成新的血管，使心肌組織不能發(fā)揮正常作用。川芎嗪干預心肌梗死模型大鼠后，心肌細胞增殖情況得到緩解。

正常情況下細胞凋亡可促進細胞新陳代謝，是清除衰老細胞的重要機制，也是機體免疫系統(tǒng)清除異常細胞的主要途徑，使機體行使正常功能；其異常新陳代謝加重疾病進程〔15〕。心肌梗死患者發(fā)生心肌缺血性缺氧、缺血性壞死，易導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊錯誤導致蛋白的積累及鈣離子失衡，誘導細胞凋亡途徑產(chǎn)生〔16〕。凋亡蛋白數(shù)量較多，其中Caspase家族是目前發(fā)現(xiàn)與凋亡家住關(guān)系最為緊密的家族，調(diào)控細胞凋亡情況〔17〕。其中Caspase-1作為Caspase家族一員，當細胞受到刺激時可促進細胞膜形成親水通道，導致細胞膨脹裂解，是多種疾病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)〔18〕。本研究結(jié)果提示心肌組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器發(fā)生變化，從而誘導凋亡蛋白加劇，促使凋亡途徑加劇，加重疾病進程；川芎嗪干預心肌梗死模型大鼠后，心肌凋亡途徑受抑制，從而緩解疾病進程。

Notch信號通路在心血管疾病中發(fā)揮重要作用，與心肌重構(gòu)關(guān)系密切〔19〕。Notch受體和配體在心肌細胞中均表達，在衰竭和未衰竭心肌細胞中表達存在差異，在心肌損傷中被激活，并影響細胞增殖、分化、凋亡等情況〔20〕。本研究結(jié)果提示Notch通路在心肌梗死大鼠中被激活發(fā)揮功能；川芎嗪干預心肌梗死模型大鼠后，可能通過抑制Notch信號通路實現(xiàn)對心肌細胞增殖、凋亡情況的緩解，從而實現(xiàn)對心肌梗死的保護。

綜上所述，川芎嗪注射液可保護老年心肌梗死，可能是通過抑制Notch信號通路實現(xiàn)對心肌細胞增殖的促進、凋亡的抑制。但Notch下游影響因子眾多，對增殖、凋亡的直接作用情況尚需進一步研究。