桑芪首烏片對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

謝青 魏丹霞 顧力華 楊仁華 劉朵 陳鵬

(1昆明市中醫(yī)醫(yī)院康復(fù)科，云南 昆明 650051;2昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

腦缺血再灌注損傷是指腦組織缺血一定時(shí)間后重新恢復(fù)血液灌注時(shí)，腦組織結(jié)構(gòu)損傷及功能障礙進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，其主要引起腦組織細(xì)胞凋亡或壞死〔1〕。因此如何最大程度地抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞再生，對(duì)治療腦缺血再灌注損傷具有重要意義。中醫(yī)在此方面取得了良好的療效〔2，3〕。國家級(jí)名老中醫(yī)陸家龍教授根據(jù)腦卒中(恢復(fù)期)的病因病機(jī)潛心研究出的“桑芪首烏方”，具有補(bǔ)益肝腎、益氣活血化瘀功效，該方臨床療效顯著，前期已證實(shí)了該方具有神經(jīng)保護(hù)作用〔4，5〕。本文在前期研究基礎(chǔ)上，通過觀察桑芪首烏片對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞缺血再灌注損傷模型大鼠的療效及Notch受體1、Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)和Hes家族發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子(Hes)1的影響，探討桑芪首烏片對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，體重(270±20)g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，許可證號(hào)：SYXK(滇)K2015-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度(22 ± 2)℃，相對(duì)濕度50%～65%，自由光照。

1.2藥物 桑芪首烏片，由桑寄生、黃芪、制首烏、生白芍、炒杜仲、當(dāng)歸、川芎、丹參、天麻、釣藤、黃柏、火麻仁、夜交藤、秫米、炒谷芽、秒麥芽、三七須根17味中藥組成，由昆明市中醫(yī)醫(yī)院制劑科提供。尼莫地平片(山東新華制藥股份有限公司，20 mg/片，批號(hào)：20151121)。

1.3主要試劑與儀器 鼠抗Notch1(A-8)抗體，Santa公司；兔抗NICD(ab8387)抗體，Abcam公司；鼠抗Hes1(E-5)抗體，Santa公司；恒溫振蕩器，中國上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；病理包埋機(jī)及切片機(jī)，德國Leica公司。1659001 蛋白電泳儀、TPC-0220G型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀，美國Bio-Rad 公司；PCR逆轉(zhuǎn)錄儀，德國Biometra公司。

1.4局灶性腦缺血再灌注大鼠模型制備 SD雄性大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始造模，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h，自由飲水。采用Zea-Longa改良的短暫性大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞線栓法(MCAO)并根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》(第三版)加以改進(jìn)，復(fù)制局灶性腦缺血再灌注模型〔6，7〕。大鼠清醒后Bederson評(píng)分≥2分提示造模成功，納入本實(shí)驗(yàn)。滿分為11分，分?jǐn)?shù)越高，表示動(dòng)物神經(jīng)行為障礙越嚴(yán)重。

1.5分組與給藥 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模成功后，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，桑芪首烏片低(0.7 g/kg)、中(1.4 g/kg)、高(2.8 g/kg)劑量組，尼莫地平片陽性對(duì)照組，每組10只。術(shù)后動(dòng)物狀態(tài)穩(wěn)定后，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組灌胃蒸餾水，桑芪首烏片低、中、高劑量組及尼莫地平片陽性對(duì)照組大鼠均分別灌胃給予相應(yīng)劑量的受試藥物或陽性藥物。灌胃容量按1.0 ml/100 g體重計(jì)，1次/d，連續(xù)28 d。

1.6觀察指標(biāo)與方法

1.6.1神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 于手術(shù)當(dāng)天，術(shù)后第14天、第28天采用Bederson評(píng)分分級(jí)法分別對(duì)各組進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定并記錄評(píng)定結(jié)果。

1.6.2梗死灶體積測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，迅速處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，立即放入盛冰鹽水的玻璃杯中，將玻璃杯放入4℃冰箱15 min。取出后按冠狀切面順序切厚度為2 mm的腦片5片，然后將腦片置于氯化三苯四氮唑(TTC)溶液中，避光，放入恒溫振蕩器，溫度設(shè)置為37℃，30 min后取出腦片拍照，采用顯微圖像分析系統(tǒng)計(jì)算腦梗死體積。

1.6.3蘇木素-伊紅(HE)染色檢測(cè)病理形態(tài)學(xué)改變 取左側(cè)腦組織，去除嗅球后切成2 mm腦片，先用4%的多聚甲醛溶液固定24 h，然后依次經(jīng)過乙醇梯度脫水、石蠟包埋、HE染色，制備成永久病理封片，通過顯微鏡觀察病理變化。

1.6.4尼氏體染色檢測(cè)神經(jīng)元功能狀態(tài) 大鼠大腦組織石蠟切片常規(guī)脫蠟復(fù)水，蒸餾水沖洗3遍，玻片上滴加1%甲苯胺藍(lán)完全覆蓋腦組織，置于飽和水蒸氣的濕盒內(nèi)。將濕盒放置于37℃溫箱內(nèi)染色30 min。蒸餾水沖洗至流出水無明顯藍(lán)色，70%乙醇分色數(shù)秒至數(shù)分鐘，以細(xì)胞質(zhì)僅為淺淡藍(lán)色終止分色。70%酒精、80%酒精、95%酒精，各2 min梯度脫水，無水乙醇2次，每次5 min，二甲苯2次，每次10 min透明，中性樹膠封片隨機(jī)選擇10個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)尼氏體數(shù)量。

1.6.5實(shí)時(shí)熒光定量(RT)-PCR檢測(cè)Notch1、NICD和Hes1基因表達(dá) 分離缺血再灌注損傷大鼠海馬組織，用Trizol一步法提取總RNA；用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參檢測(cè)Notch1、NICD和Hes1 3個(gè)基因的表達(dá)變化。

1.6.6Western印跡檢測(cè)Notch1、NICD和Hes1蛋白表達(dá) 分離局灶性缺血再灌注損傷大鼠海馬組織，提取總蛋白，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。常規(guī)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入Notch1、NICD和Hes1的抗體和內(nèi)參β-actin的抗體，孵育；洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育；洗膜后用Western印跡熒光試劑激發(fā)熒光，顯示于X片，經(jīng)顯影、掃描后用Image Pro Plus軟件進(jìn)行顯影條帶的灰度值比較，以β-actin為內(nèi)參，比較各組Notch1、NICD和Hes1 3個(gè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分 除正常對(duì)照組外，造模成功，各組動(dòng)物清醒后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。給藥14 d進(jìn)行神經(jīng)行為評(píng)分，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組評(píng)分明顯增加(P<0.05)；桑芪首烏片低、中、高劑量組及尼莫地平陽性藥物對(duì)照組評(píng)分也增加，但尼莫地平陽性對(duì)照組及桑芪首烏片高劑量組評(píng)分均明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05)。給藥28 d，模型對(duì)照組評(píng)分進(jìn)一步增加；尼莫地平陽性藥物對(duì)照組及桑芪首烏片中、高劑量組評(píng)分均明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 各組神經(jīng)行為評(píng)分及腦梗死灶大小比較

2.2各組腦梗死體積比較 除正常對(duì)照組外，其余各組均出現(xiàn)明顯的梗死灶。桑芪首烏片各劑量治療組及尼莫地平陽性對(duì)照組梗死灶明顯，但梗死范圍較模型對(duì)照組明顯減小，見圖1。經(jīng)28 d藥物治療后，桑芪首烏片中、高劑量組、尼莫地平陽性對(duì)照組梗死灶體積、修正梗死灶體積和梗死率與模型對(duì)照組比較均明顯縮小(P<0.05)，見表1。

1～6：桑芪首烏片低、中、高劑量組、尼莫地平陽性對(duì)照組、模型對(duì)照組和正常對(duì)照組；圖5同圖1 各組腦梗死灶

2.3各組病理學(xué)改變 正常對(duì)照組細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核居中，核膜、核仁清晰；模型對(duì)照組細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核碎裂、溶解、消失，出現(xiàn)大片紅染區(qū)域，細(xì)胞壞死明顯；尼莫地平陽性對(duì)照組及桑芪首烏片各劑量組細(xì)胞排列紊亂，但細(xì)胞壞死范圍明顯較模型對(duì)照組減??；且桑芪首烏片低、中、高劑量組細(xì)胞壞死數(shù)量與劑量呈負(fù)相關(guān)，見圖2。

圖2 各組腦梗死病理改變(HE染色，×400)

2.4各組尼氏體計(jì)數(shù) 正常對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞形態(tài)完整，可見塊狀及顆粒狀尼氏體，數(shù)量較多。模型對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)尼氏體溶解消失，數(shù)量減少，與正常對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05);桑芪首烏片低、中、高劑量組隨劑量增加，細(xì)胞形態(tài)明顯改善，尼氏體數(shù)量增加；3個(gè)劑量的桑芪首烏片組和尼莫地平陽性對(duì)照組與模型對(duì)照組比較，尼氏體數(shù)量顯著增加(P<0.05)，見圖3、表2。

2.5各組腦組織中Notch1、NICD和Hes1mRNA表達(dá) 模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，Notch1、NICD和Hes1 3個(gè)基因表達(dá)均有增加，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)28 d給藥治療，與模型對(duì)照組比較，桑芪首烏片中、高劑量組及尼莫地平陽性對(duì)照組3個(gè)基因表達(dá)均明顯增加(P<0.05)；桑芪首烏片低劑量組與模型組比較，3個(gè)基因表達(dá)雖有增加，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖4。

2.6各組腦組織中Notch1、NICD和Hes1蛋白表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組Notch1、NICD和Hes1蛋白的表達(dá)水平均有增加，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型對(duì)照組比較，桑芪首烏片中、高劑量組及尼莫地平陽性對(duì)照組上述3個(gè)蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05)；桑芪首烏片低劑量組與模型組比較，3個(gè)蛋白表達(dá)雖有增加，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5、表3。

圖3 各組腦組織中尼氏體數(shù)量(尼氏體染色，×200)

表2 各組腦組織中尼氏體數(shù)量和局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Notch1、NICD及Hes1 mRNA相對(duì)表達(dá)比較

圖4 各組基因擴(kuò)增曲線

圖5 各組局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Notch1、NICD和Hes1蛋白表達(dá)

表3 各組Notch1、NICD及Hes1蛋白表達(dá)

3 討 論

腦缺血再灌注損傷引起神經(jīng)元壞死或凋亡導(dǎo)致腦功能障礙，可引起不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，是引起患者致殘的重要原因。目前，無論是溶栓、介入、營養(yǎng)神經(jīng)、康復(fù)訓(xùn)練等均無法完全恢復(fù)患者的神經(jīng)功能。因此，尋找更好的方法促進(jìn)神經(jīng)再生以替代受損的腦組織，改善患者的神經(jīng)功能，提高患者的生活質(zhì)量一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)〔8〕。

神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是一種具有分化潛能和自我更新能力的母細(xì)胞，在生理狀態(tài)下多處于“靜息”狀態(tài)，在缺血或創(chuàng)傷性損傷刺激下，NSCs可被激活，分化成熟為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，并遷移到特定的區(qū)域，替代并修復(fù)受損的神經(jīng)元，一定程度上改善神經(jīng)功能缺損。大量研究證實(shí)，內(nèi)源性 NSCs 的增殖、遷移和定向分化，能改善腦缺血后的神經(jīng)功能缺損癥狀〔9〕。然而內(nèi)源性NSCs的增殖數(shù)量有限，不足以進(jìn)行自我代償和修復(fù)。外源性NSCs移植又因?yàn)楦杉?xì)胞資源匱乏及移植后的免疫排斥反應(yīng)等在臨床應(yīng)用中受到諸多限制。因此，最大程度地促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖、遷移、分化，恢復(fù)和重建神經(jīng)功能成為目前研究的熱點(diǎn)〔10〕。

神經(jīng)再生過程受到多種細(xì)胞信號(hào)通路和因子的調(diào)控，其中Notch信號(hào)通路是NSCs維持和自我更新的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與神經(jīng)再生密切相關(guān)〔11～13〕。Yoon等〔14〕在研究小鼠大腦的母細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，在缺乏內(nèi)源性和外源性的生長(zhǎng)因子而僅有Notch信號(hào)通路時(shí)，就足夠支持NSCc的自我更新。陳娉婷等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路，上調(diào)Notch1、Notch2蛋白表達(dá)水平，可促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。Notch信號(hào)通路主要有Notch受體、Notch配體、轉(zhuǎn)錄因子及下游靶基因組成。當(dāng)相鄰細(xì)胞間的Notch配體與受體結(jié)合后，引起受體多次水解釋放其胞內(nèi)活性結(jié)構(gòu)域(NICD)入核。NICD與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使其從轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，啟動(dòng)靶基因HES-1/HES-5等最終發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔16〕。

Notch1是Notch受體中最重要的亞型，其在NSCs增殖中發(fā)揮著重要作用〔17〕。NICD是Notch受體的活性部分，是Notch信號(hào)活化的標(biāo)志。Notch信號(hào)通路激活后主要通過Hes1轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)NSCs增殖，維持其干性特征，當(dāng)Hes1失活時(shí)，NSCs增殖抑制并向神經(jīng)元方向分化〔18〕。Wang等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)成年鼠在腦缺血缺氧后，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖過程中，NICD和HES1的表達(dá)水平增高，阻斷Notch通路后，NICD、HES1的表達(dá)減少，同時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖也明顯減少。房鈺鈔等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)miR-155缺失可上調(diào)Notch1、NICD和Hes1表達(dá)，使神經(jīng)元凋亡減輕。王俊杰等〔3〕研究表明地黃飲子能改善 MCAO 大鼠模型的神經(jīng)功能缺損，減小腦梗死體積，減輕腦組織病理改變，可能與激活 Notch信號(hào)通路，上調(diào) Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA 的表達(dá)，促進(jìn) NSCs 增殖有關(guān)。

腦缺血再灌注損傷屬“中風(fēng)”范疇，國家級(jí)名老中醫(yī)陸家龍教授認(rèn)為其恢復(fù)期病機(jī)多為本虛標(biāo)實(shí)，以肝腎不足、氣血虧虛為本，以瘀血內(nèi)停、痰濁阻絡(luò)為標(biāo)〔21〕?！吧＼问诪醴健蹦苊黠@改善腦梗死患者的中醫(yī)證候及偏癱肢體的運(yùn)動(dòng)功能，其總有效率高達(dá)85.29%；同時(shí)基礎(chǔ)研究也證實(shí)了該方能上調(diào)MCAO模型大鼠腦組織中腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體酪氨酸激酶B的表達(dá)。本研究選取桑芪首烏片干預(yù)，方中桑寄生、首烏等補(bǔ)肝腎、益精血，配伍黃芪以益氣活血化瘀。諸藥合用，使肝有所補(bǔ)，腎有所滋，腦有所養(yǎng)，精血得旺，髓海得充，瘀去痰除，經(jīng)絡(luò)通暢。