基于NLRP3信號通路研究牙周炎加重肥胖大鼠胰島素抵抗的作用機(jī)制

高巖 成思源 黃晶 孫路全

(天津市北辰醫(yī)院口腔科,天津 300400)

牙周炎是一種由局部因素引起的牙周支持組織慢性炎癥，是我國成年人最常見的口腔問題，也是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的首位因素〔1，2〕。研究表明牙周病不僅引起口腔局部感染炎癥，而且作為細(xì)菌儲庫可引起輕微的慢性炎癥反應(yīng)進(jìn)而影響全身各臟器功能〔3，4〕。研究已經(jīng)證實(shí)在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中，牙周炎致病菌(如牙齦卟啉單胞菌)是通過激活炎癥細(xì)胞模式識別受體(PRRs)，包括Toll樣受體(TLRs)和NOD樣受體家族(NLRs)等，激活牙周炎癥信號通路〔5～8〕。研究已經(jīng)證實(shí)牙周炎患者免疫細(xì)胞內(nèi)白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18的表達(dá)可因細(xì)菌的改變而表達(dá)上調(diào)，而NLRP3在其中起了關(guān)鍵性作用。Huang等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)NLRP3信號通路在慢性牙周炎炎癥早期激活過程中的重要作用。通過NLRP3信號通路，牙齦上皮細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子，如IL-1β，最終導(dǎo)致牙周組織破壞。NLRP3作為一種重要的代謝紊亂傳感器，控制了肥胖相關(guān)的胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞的功能障礙。肥胖是我國公共衛(wèi)生領(lǐng)域一項日益嚴(yán)重的問題，由此引發(fā)的高血壓、糖尿病發(fā)生率也逐漸升高。Virto等〔10〕發(fā)現(xiàn)肥胖會導(dǎo)致胰島素敏感性降低，而流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肥胖與牙周炎通過胰島素抵抗相互關(guān)聯(lián)加重肥胖及原發(fā)病。但目前，關(guān)于牙周炎、肥胖、胰島素抵抗3者之間的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過建立SD雄性大鼠牙周炎模型，旨在探討牙周炎加重肥胖大鼠胰島素抵抗的相關(guān)機(jī)制及可能的信號通路。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 40只SD雄性大鼠購于第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，動物合格證號：0001517，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(渝)2017-0005。普通飼料及高脂飼料均購于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。Trizol試劑、RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購于美國Abcam公司。飲用高溫高壓滅菌水，溫度：24～26℃；濕度：40%～70%；白晝10 h、黑夜14 h間斷照明。

1.2模型構(gòu)建及分組 將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，根據(jù)處理方式的不同分為對照組、肥胖組、模型組、治療組。對照組：不做任何處理，浦頭飼料正常飼養(yǎng)。肥胖組：采用高脂飲食喂養(yǎng)20 w。模型組：肥胖模型構(gòu)建同肥胖組，成功后通過腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，取仰臥位固定，分離上頜左側(cè)第一磨牙頰腭側(cè)牙齦，采用正畸結(jié)扎線結(jié)扎，齦溝底局部滴入牙周病炎患者的唾液10 μl/次，誘導(dǎo)牙周炎模型。治療組：參照模型組方法造模后，對大鼠進(jìn)行牙周基礎(chǔ)治療，治療方法包括牙齦清潔、牙齦下刮治、1%過氧化氫(H2O2)+生理鹽水沖洗。

1.3Micro-CT檢測 處死大鼠后，取頜骨組織固定48 h。利用Micro-CT技術(shù)，在不破壞大鼠頜骨的前提下，重建內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)，測量第二磨牙釉牙骨質(zhì)界(CEJ)到牙槽嵴頂(AC)的距離(CEJ-AC)，計算骨丟失量及骨剩余量。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，取下實(shí)驗(yàn)側(cè)牙槽骨，放于脫鈣液中24 h過夜，沖洗約2 h，常規(guī)石蠟包埋，牙體長軸近遠(yuǎn)中方向切片，烤片，冷卻后低溫凍存。經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化。蘇木素染色30～60 s，沖洗5 min，伊紅染色30 s，沖洗5 min；乙醇梯度脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5血脂及胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo) 在處死大鼠前12 h禁食，收集大鼠眼底靜脈血進(jìn)行檢測。采用比色法測定血脂指標(biāo)，檢測項目包括：血清三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)。利用公式計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)、新β細(xì)胞功能指數(shù)(MBCI)。

1.6RT-PCR檢測NLRP3 mRNA、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)1 mRNA表達(dá) 處死小鼠后，解剖胰腺及肝臟組織。采用Trace試劑盒，提取mRNA，洗脫后，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA完整性。95℃預(yù)變性3 min，95℃ 30 s，退火溫度40 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，設(shè)置熒光反應(yīng)在每個擴(kuò)增周期后80℃ 10 s的條件下進(jìn)行，最后72℃持續(xù)5 min。NLRP3上游引物：5′-TTCCATTTGTAGGCCAACGGG C-3′，下游：5′-CTGTCCGCATGTCAGCATACGT-3′;caspase1上游引物：5′-GCCACGGTGGTGAAAC AGTA-3′，下游：5′-AGCCTTGGTTCGAAACATCG-3′;β-actin上游引物：5′-GTGTTGGCGTACAGGTC TTTG-3′，下游：5′-CGTACCACTGGCATCGTG AT-3′。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組骨丟失量及剩余量比較 造模后8 w，與對照組及肥胖組比較，模型組與治療組的骨丟失量顯著升高，骨剩余量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組骨丟失量及剩余量比較

2.2牙周組織HE染色 HE染色顯示，正常組牙周組織結(jié)構(gòu)完好，結(jié)合上皮附著緊密，牙槽嵴頂完整，無牙槽骨吸收。造模組牙周組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，結(jié)合上皮根向遷移，大量炎細(xì)胞浸潤，牙槽嵴頂顯著吸收，表現(xiàn)為慢性牙周炎，見圖1。

圖1 正常組和造模組牙周組織(HE染色，×400)

2.3各組血脂相關(guān)指標(biāo)水平比較 模型組TG、TC、LDL-C水平顯著高于對照組，HDL-C水平顯著低于對照組(P<0.05)；治療組TG、LDL-C水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

2.4各組胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)水平比較 與對照組和肥胖組比較，模型組HOMA-IR水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組HOMA-IR水平顯著降低(P<0.05)；4組口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)曲線下面積比較：模型組>治療組>肥胖組>對照組(P<0.05)；對照組MBCI、HOMA-β水平顯著高于其他3組，且模型組MBCI、HOMA-β水平均顯著低于肥胖組，治療組MBCI、HOMA-β水平均顯著高于模型組(P<0.05)。見表3。

表2 各組血脂相關(guān)指標(biāo)水平比較

2.5各組胰腺NLRP3、caspase1 mRNA檢測 胰腺NLRP3、caspase1 mRNA水平比較：模型組>肥胖組>對照組，且治療組NLRP3、caspase1 mRNA水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表3。

2.6各組肝臟NLRP3、caspase1 mRNA檢測 模型組肝臟NLRP3、caspase1 mRNA水平顯著高于對照組和肥胖組，且治療組NLRP3、caspase1 mRNA水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表4。

表3 各組胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)及胰腺NLRP3、caspase1 mRNA相對表達(dá)量水平比較

表4 各組肝臟NLRP3、caspase1 mRNA相對表達(dá)量

3 討 論

胰島素抵抗貫穿2型糖尿病(T2DM)整個病程，有研究提出胰島素抵抗是T2DM誘因，與肥胖密切相關(guān)。肥胖使機(jī)體陷入慢性炎癥，最終導(dǎo)致外周組織發(fā)生胰島素抵抗現(xiàn)象〔11～13〕。肥胖組織有大量巨噬細(xì)胞浸潤〔14〕。脂肪相關(guān)巨噬細(xì)胞(ATMs)，尤其是CD11陽性的ATMs，產(chǎn)生大量促炎因子最終導(dǎo)致胰島素抵抗〔15〕。Deepti等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗可用于預(yù)測人群中牙齦或牙周炎癥發(fā)生風(fēng)險，這可能與口腔致病細(xì)菌定植相關(guān)，這類致病菌可由口腔進(jìn)入體內(nèi)，進(jìn)而引發(fā)心臟病、T2DM和消化道疾病。本研究結(jié)果表明模型組及治療組發(fā)生明顯的骨吸收，但在發(fā)生骨吸收的同時也存在一定的結(jié)構(gòu)改建，出現(xiàn)了大量炎細(xì)胞浸潤，說明本研究構(gòu)建的模型符合慢性牙周炎的慢性炎性狀態(tài)。本研究表明牙周基礎(chǔ)治療對緩解牙周炎大鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)有一定的效果，研究結(jié)論與柴巧學(xué)等〔17〕研究結(jié)論一致。NLRP3炎性小體由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和caspase1所組成〔18〕。NLRP3炎性小體能被病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)激活，當(dāng)NLRP3被異常激活后，可大量招募caspase1，成熟的caspase1通過剪切IL-1β與IL-18的前體形式，使其成熟并分泌到細(xì)胞外，參與機(jī)體炎性反應(yīng)和天然免疫應(yīng)答〔19〕。研究表明T2DM患者體內(nèi)NLRP3相關(guān)信號通路的異常激活與胰島素抵抗有密切聯(lián)系〔20，21〕。本研究結(jié)果表明模型組胰腺及肝臟組織內(nèi)，出現(xiàn)了NLRP信號通路相關(guān)分子的異?；罨?，但在接受牙周基礎(chǔ)治療后，相關(guān)信號分子的活化程度有所下降。此研究結(jié)果與研究〔20，21〕結(jié)論一致。陳一丁〔20〕研究表明老年T2DM患者外周血NLRP3炎性小體的表達(dá)水平升高，且與患者的血糖控制水平和胰島素抵抗呈正相關(guān)關(guān)系。白桂榮等〔21〕同樣也得出類似研究，其研究結(jié)論表明NLRP3在T2DM人群中表達(dá)增加，并且隨著血糖逐步增高，其胰島素抵抗也逐漸加重。