下調(diào)cyclinD1對心肌梗死模型大鼠干預(yù)效果及作用機制

王雅潔 王文斌 費年華

(咸寧市中心醫(yī)院 1老年病科，湖北 咸寧 437000；2甲狀腺乳腺外科)

心肌梗死可導(dǎo)致惡性心律失常、心力衰竭，嚴重者可導(dǎo)致患者猝死〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞肥大屬于一種漸進且復(fù)雜的過程，是心臟前后負荷增加的多種病理性刺激代償反應(yīng)，在早期心肌細胞肥大現(xiàn)象對心臟正常功能具有代償意義，但隨著心肌梗死患者疾病進展，心肌細胞肥大是引發(fā)惡性心律失常、心力衰竭、猝死的危險因素〔2〕。細胞周期蛋白(cyclin)D1在神經(jīng)細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞等終末分化細胞中表達，且參與心肌細胞肥大的發(fā)生〔3〕。本研究探討下調(diào)cyclinD1對心肌梗死模型大鼠的干預(yù)效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取45只SPF級SD健康大鼠，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供。鼠齡4～10 w，平均(7.1±1.3)w，體重210～260 g，平均(235.6±10.2)g，飼養(yǎng)溫度22～25℃，室內(nèi)濕度35%～40%，飼養(yǎng)室定時進行紫外線照射消毒。統(tǒng)一喂標準飼料，允許自由活動，飼養(yǎng)時間為1 w。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準。主要試劑：Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(北京義翹神州科技有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(武漢純度生物科技有限公司)；小G蛋白RhoA激酶(ROCK)1、ROCK2抗體(佰思諾(天津)生物科技有限公司)；cyclinD1抗體(武漢博士德生物有限公司)。

1.2方法

1.2.1cyclinD1基因轉(zhuǎn)染 取大鼠心肌細胞放置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在恒溫為37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中做培養(yǎng)處理，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細胞融合率達到80%～90%時使用0.25%的胰酶消化，傳代。按照Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書對大鼠心肌細胞進行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染物的不同將大鼠心肌細胞分為siRNA-cyclinD1(下調(diào))細胞、siRNA-對照序列細胞。將轉(zhuǎn)染后的大鼠心肌細胞放置于恒溫為37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，進行后續(xù)實驗。

1.2.2建模及分組 將所有大鼠隨機分為空白組、上調(diào)組、下調(diào)組各15只，參照文獻〔4〕構(gòu)建心肌梗死大鼠模型，所有大鼠腹腔注射10% 35 ml的水合氯醛做麻醉處理，使用生物機能實驗系統(tǒng)檢測大鼠，在氣管插管后連接小動物呼吸機，打開大鼠胸腔，使用撐胸器撐開，將心臟充分暴露出，使用8-0無創(chuàng)傷四絲線合針在大鼠肺動脈圓錐與主動脈交界處大約2 mm處穿過并結(jié)扎左冠狀動脈前降支。建模成功標志：大鼠結(jié)扎線以下心肌波動減縮、顏色變蒼白且心電圖顯示ST段明顯抬高。10 min后將轉(zhuǎn)染后的大鼠siRNA-VEGF-B(下調(diào))心肌細胞局部注射于下調(diào)組大鼠左心室游離壁上、下、左、右4個部位，siRNA-對照序列(上調(diào))心肌細胞局部注射于上調(diào)組大鼠左心室游離壁上、下、左、右4個部位，空白組不做任何處理。注射完成后常規(guī)胸腔滴注利多卡因以預(yù)防大鼠心室顫動、室性心動過速，吸進胸腔積液后將呼吸機斷開，常規(guī)關(guān)閉胸腔，在各組大鼠蘇醒后將氣管插管拔除，常規(guī)喂養(yǎng)，連續(xù)3 d注射青霉素預(yù)防感染。

1.2.3心功能檢測 腹腔2% 40 mg/kg戊巴比妥鈉以麻醉大鼠，使用Vivid7 Dimension彩色多普勒超聲檢測儀測定大鼠心功能指標，使用探頭為13 MHz，深度為3.5 cm，速度為200 mm/s，在取得滿意的二維圖像后，在乳頭肌將M型取樣線垂直于室間隔和左心室后獲得M型心動圖，檢測左室舒張末壓(LVEDP)、左室舒張壓(LVDP)、左室收縮壓(LVSP)、心率。

1.2.4左心室重量指數(shù)檢測 最后1次給藥后禁食12 h，將大鼠稱完體重后處死，取其心臟，去除心外膜脂肪組織、大血管及心房和右心室后，使用生理鹽水進行沖洗，待吸干心臟多余水分后，稱得左心室重量(LVW)，并計算左心室重量指數(shù)=左心室重量/大鼠體重(BW)。

1.2.5心肌酶水平檢測 取所有大鼠尾部靜脈血3 ml，采用美國Olympus公司AU640 型全自動生化分析儀檢測所有大鼠心肌酶水平，包括肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、羥丁酸脫氫酶(HBDH)。

1.2.6病理組織學(xué)觀察 在大鼠心功能、心肌酶測定完成后，選取各組5只大鼠采用斷頭法處死，立即取大鼠心肌組織，將提取的組織制作標本，使用40 ml/L的多聚甲醛進行固定，常溫下使用15%的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，脫水后進行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，做蘇木素-伊紅(HE)染色處理后使用顯微鏡觀察心肌組織病理變化。

1.2.7心肌細胞肥大情況檢測 選取各組中5只大鼠，參照Nozato〔5〕所用方法測定各組100個心肌細胞表面積，取9～10個視野，取均值。

1.2.8心肌組織中ROCK/cyclinD1信號通路蛋白表達量檢測 Western印跡檢測心肌組織中ROCK/cyclinD1信號通路蛋白表達量，提取各組中剩余5只大鼠心肌組織樣本，提取樣品總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)法定量分析，50 μg蛋白樣品上樣后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，避光封閉1 h洗滌，將1∶1 000比例稀釋的ROCK1、ROCK2、cyclinD1一抗稀釋溶液，4℃下過夜，洗滌，將1∶5 000比例稀釋的ROCK1、ROCK2、cyclinD1二抗稀釋溶液加入，溫床孵育1 h后洗滌，發(fā)光液ECL加入，曝光3次，取重疊值，分析蛋白條帶灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參蛋白。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件行F、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學(xué)觀察 對照組心肌細胞壞死、變性，局部心肌纖維排列紊亂，存在炎性細胞浸潤；上調(diào)組可見局部心肌細胞壞死，細胞核固縮、碎裂，部分心肌纖維斷裂、溶解，大量炎性細胞浸潤；下調(diào)組可見心肌組織形態(tài)清晰，少量心肌細胞壞死，心肌纖維排列較為整齊，少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 3組心肌組織(HE，×100)

2.23組心功能比較 上調(diào)組LVDP、LVSP水平顯著低于空白組，LEVDP、心率顯著高于空白組(P<0.05)；下調(diào)組LVDP、LVSP水平顯著高于空白組，LEVDP、心率顯著低于空白組(P<0.05)。下調(diào)組LVDP、LVSP水平顯著高于上調(diào)組、LEVDP、心率顯著低于上調(diào)組(P<0.05)。見表1。

表1 3組心功能及心肌酶水平比較

2.33組心肌酶水平比較 上調(diào)組CK-MB、CK、HBDH、LDH水平均顯著高于空白組(P<0.05)；下調(diào)組CK-MB、CK、HBDH、LDH水平均顯著低于空白組(P<0.05)；下調(diào)組CK-MB、CK、HBDH、LDH水平均顯著低于上調(diào)組(P<0.05)。見表1。

2.43組心肌細胞肥大比較 上調(diào)組LVW/BW、心肌細胞橫斷面積均顯著高于空白組(P<0.05)；下調(diào)組LVW/BW、心肌細胞橫斷面積均顯著低于空白組(P<0.05)；下調(diào)組LVW/BW、心肌細胞橫斷面積均顯著低于上調(diào)組(P<0.05)。見表2。

2.53組心肌組織中ROCK/cyclinD1信號通路蛋白表達量比較 上調(diào)組心肌組織中ROCK1、ROCK2、cyclinD1蛋白表達量均顯著高于空白組(P<0.05)；下調(diào)組心肌組織中ROCK1、ROCK2、cyclinD1蛋白表達量均顯著低于空白組(P<0.05)；下調(diào)組心肌組織中ROCK1、ROCK2、cyclinD1蛋白表達量均顯著低于上調(diào)組(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 3組心肌細胞肥大情況及ROCK/cyclinD1信號通路蛋白表達量比較

圖2 ROCK/cyclinD1信號通路蛋白

3 討 論

心肌梗死的發(fā)生多以冠狀動脈粥樣硬化狹窄為基礎(chǔ)，在過勞、激動、暴飲暴食、寒冷刺激、大量飲酒等因素的誘導(dǎo)下增加心肌耗氧量或?qū)е鹿跔顒用}痙攣，最終引發(fā)急性心肌梗死的發(fā)生〔6,7〕。流行病學(xué)調(diào)查顯示，心肌梗死好發(fā)于老年人群，致死率較高，且45歲以下人群的發(fā)病率呈逐年升高趨勢〔8〕。

cyclinD1基因定位于人染色體11q13，包括4個內(nèi)含子和5個外顯子，長度大約為15 kD，編碼相對分子質(zhì)量為34 000的蛋白質(zhì)〔9,10〕。研究發(fā)現(xiàn)cyclin D1基因?qū)儆谝环N較為重要的可調(diào)節(jié)細胞周期基因，可與周期蛋白依賴性激酶(CDK)4發(fā)生結(jié)合作用并激活其激酶活性，促使pRb磷酸化，釋放E2F，進而誘導(dǎo)細胞從G1期進入至S期，最終促進細胞增殖〔11,12〕。在機體處于正常情況下，細胞進入S期后cyclinD1基因會迅速分解，進而維持細胞正常的增殖過程，但當(dāng)機體處于病理狀態(tài)下，cyclinD1基因分解異常，進而導(dǎo)致細胞異常增殖〔13,14〕。李敬美等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期調(diào)節(jié)因子cyclinB、cyclinD、cyclinE與H9c2心肌細胞肥大相關(guān)。本研究結(jié)果說明，下調(diào)cyclinD1基因可抑制心肌梗死大鼠心肌細胞肥大，改善心功能，抑制疾病進展。

研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死發(fā)生后會出現(xiàn)心肌細胞肥大現(xiàn)象，屬于多種心血管疾病的并發(fā)癥，心肌細胞肥大可在一定程度上增加惡性心律失常、心力衰竭等不良事件發(fā)生率〔16〕。ROCK屬于小G蛋白家族成員之一，研究已經(jīng)證實小G蛋白超家族與心肌細胞肥大相關(guān)〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)小G蛋白家族包括Ras、Rho、Rab、Ran、ARFs五個亞族，其中Ras、Rho與心臟相關(guān)〔18〕。RhoA屬于Rho亞家族成員之一，RhoA/ROCK參與心肌細胞肥大過程，其經(jīng)降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達或減少eNOS磷酸化，抑制一氧化氮(NO)生成，進而抑制心肌細胞肥大〔19〕。研究顯示RhoA/ROCK經(jīng)激活ERK1/2-GATA信號通路促進心肌細胞肥大〔20〕。而cyclinD1屬于細胞周期調(diào)控基因，在心肌梗死發(fā)生后表達升高，可進一步促進心肌細胞肥大。本研究結(jié)果提示下調(diào)cyclinD1可能經(jīng)作用于ROCK/cyclinD1信號通路抑制心肌細胞肥大，最終起到改善心功能的目的。