蝦青素通過ROS/NLRP3炎癥小體信號通路減輕碘海醇誘導的HK-2損傷

張馳昊 高冬梅 鄭迪 軒永麗 李文華,

(徐州醫(yī)科大學 1心血管病研究所，江蘇 徐州 221000；2附屬醫(yī)院)

隨著冠心病的診斷、介入和放射診療技術的發(fā)展，對比劑的廣泛使用，由對比劑引起的急性腎損傷(CI-AKI)逐漸成為醫(yī)源性腎衰竭的常見原因之一〔1〕。同時，CI-AKI、支架內(nèi)血栓和支架內(nèi)再狹窄已成為經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)患者術后的三大并發(fā)癥〔2〕，也是PCI術后1年死亡、心肌梗死和靶血管重建風險的獨立預測因素〔3〕。CI-AKI的發(fā)生增加患者的醫(yī)療負擔，病情嚴重者可發(fā)展為慢性腎功能衰竭，甚至需要腎臟替代治療，嚴重威脅患者預后。

CI-AKI的發(fā)病機制未完全明確，多種因素可能參與了CI-AKI的發(fā)生發(fā)展。大多數(shù)學者認為，對比劑引起氧自由基損傷〔4〕、腎臟血流動力學改變〔5〕及對比劑的直接腎小管毒性損傷〔6〕是其重要機制。此外，還可能與腎小管阻塞、內(nèi)皮祖細胞數(shù)量減少、炎癥反應和免疫機制相關。本研究旨在探討蝦青素(AST)在碘海醇(CM)誘導的HK-2細胞損傷中的保護作用，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1主要材料 人近端腎小管上皮細胞株(HK-2)；AST(sigma)；CM(揚子江藥業(yè)有限公司)；胎牛血清(四季青，中國)；DMEM/F12( Hyclone,美國)；N-乙酰半胱氨酸(NAC，阿拉丁公司，中國)； 二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構域樣受體蛋白(NLRP)3抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase-1)抗體(美國Proteintech公司)；人白細胞介素(IL)-1β、人IL-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國ABclonal Technology公司)；β-actin抗體(美國Proteintech公司)。

1.2細胞培養(yǎng)與分組 HK-2細胞株在含10%胎牛血清、0.1%青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞長至70%～80%時，換不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞同步于靜止生長期(G0/G1期)后隨機分組：空白對照組(Con組)、溶劑對照組(DMSO組)、AST對照組(AST組)、CM組、AST預處理組(AST+CM組)、N-乙酰半胱氨酸預處理組(NAC+CM組)。

1.34，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)DNA熒光染色觀察細胞核形態(tài) 將生長于24 孔培養(yǎng)板中的大鼠腎小管上皮細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕洗3次，4%多聚甲醛(溶于0.1 mol/L PBS，pH7.4)室溫固定15 min后，再次用PBS輕洗3次×5 min，避光條件下加入3 ml DAPI(熒光性的DNA結(jié)合染料，用含0.2%Triton的PBS溶解)染色5～10 min，PBS沖洗3遍×5 min。在Olympus熒光顯微鏡上，以400 nm為激發(fā)光，455 nm發(fā)射光觀察。

1.4Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡 用2 ml PBS輕輕潤洗培養(yǎng)皿中的細胞，去除PBS。將細胞重新懸浮于之前的培養(yǎng)基中或預冷的1×結(jié)合緩沖液中使其細胞濃度大約為1×106細胞/ml。取500 μl細胞懸液(5×105個細胞)至1個干凈的離心管中，離心1 000 r/min×5 min，去上清，加入500 μl PBS洗滌細胞1次，離心，去上清。再加入500 μl的1×結(jié)合緩沖液洗滌細胞1次，離心，去上清；加入100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞后加入5 μl Annexin V-APC室溫避光反應15 min。加入500 μl的1×結(jié)合緩沖液洗滌細胞1次，離心，去上清；加入200 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞后加入5 μl PI。將樣品在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測分析。

1.5流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平 以細胞接種密度為4×105/ml，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h至細胞貼壁。根據(jù)分組用相應藥物處理細胞，Con組、DMSO組無特殊處理；CM組加入Rosoup 1 μl+1 ml活性氧熒光探針(DCFH-DA)；實驗各組處理時間到后，除Con組、DMSO組外，各實驗組加入終濃度為10 μmol/L DCFH-DA 1 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min。棄培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基洗3遍×5 min，充分去除未進入細胞的DCFH-DA。胰酶消化收集細胞，上流式細胞儀檢測ROS，激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm。

1.6Western印跡檢測蛋白表達水平 提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉，用特異性抗體進行免疫雜交檢測，β肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照，化學發(fā)光劑顯色，最后對目的條帶進行掃描密度分析。每組重復3次。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞上清液IL-1β、IL-18分泌水平 以細胞密度為2×105個/孔，接種到12孔板上，每組設6個復孔，分組及轉(zhuǎn)染條件同前。分別于轉(zhuǎn)染后1、3、5 d收集細胞上清，應用ELISA，檢測各組細胞上清中IL-1β、IL-8表達情況。實驗步驟按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.8統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism5.0 軟件進行χ2檢驗，t檢驗，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1CCK-8檢測各組細胞增殖活性 與Con組〔(100.00±9.21)%〕相比，DMSO組AST組差異無統(tǒng)計學意義〔(98.41±7.03)%，(96.05±5.33)%，P>0.05〕；CM組細胞的增殖活性明顯下降〔(51.50±3.06)%，P<0.05〕。AST+CM組〔(87.17±4.62)%〕和NAC+CM組HK-2細胞增殖活性較CM組明顯增加〔(90.01±4.83)%，P<0.05〕。與NAC+CM組相比，AST+CM組HK-2細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2DAPI 熒光染色觀察各組細胞核形態(tài) 采用DAPI DNA 熒光染色的方法觀察細胞核形態(tài)，DAPI可以和雙鏈DNA的A堿基相結(jié)合，DAPI染色后細胞核會發(fā)出淡藍白色的熒光。正常細胞的細胞核似于圓形，邊緣清晰，染色均勻且淡染。早期凋亡細胞呈現(xiàn)核固縮，核染色加深；晚期凋亡細胞表現(xiàn)為核碎裂成大小不等的圓形小體，并被細胞膜所包繞，即凋亡小體，細胞核DAPI染色熒光較強。Con組、DMSO 組和AST組，細胞核近似于圓形，邊緣清晰，染色均勻且淡染，未見凋亡細胞。CM組細胞較Con組狀態(tài)差，可見大量細胞出現(xiàn)核固縮、核深染，固縮的核呈高亮狀態(tài)，部分細胞可見核裂解，為凋亡細胞。與CM組相比，AST組核固縮、核深染狀態(tài)明顯改善，凋亡細胞顯著減少；NAC+CM組核固縮、核深染狀態(tài)也明顯改善，凋亡細胞減少。觀察AST+CM組與NAC+CM組中凋亡細胞比例相似。AST+CM組與NAC+CM組比較無明顯差異。見圖1。

2.3各組細胞ROS的表達 用FCM檢測平均熒光強度來表明腎小管上皮細胞內(nèi)ROS的表達水平，實驗結(jié)果顯示：與Con組(602.14±70.09)相比，DMSO 組(663.76±93.53)和AST組ROS表達水平(506.56±81.77)無明顯變化(P>0.05)；與Con組比較，CM組腎小管上皮細胞內(nèi)ROS表達顯著升高(2 494.33±402.56，P<0.05)。與CM組相比，AST+CM組(1 091.97±28.87)及NAC+CM組細胞內(nèi)ROS(887.29±179.45)均明顯降低(P<0.05)。AST+CM組與NAC+CM組腎小管上皮細胞內(nèi)ROS 表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4AnnexinV/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率 與Con組〔(2.32±0.61)%〕相比，DMSO組〔(2.58±0.97)%〕及AST組腎小管上皮細胞的細胞凋亡率〔(2.81±0.79)%〕無明顯變化(P>0.05)；與 Con組比較，CM組細胞凋亡率〔(18.53±3.52)%〕顯著升高(P<0.05)。 AST+CM組〔(8.24±2.48)%〕、NAC+CM組細胞凋亡率〔(7.55±1.27)%〕較 CM組顯著降低(P<0.05)。 AST+CM組和NAC+CM組進行比較，腎小管上皮細胞的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.5Western印跡檢測各組NLRP3炎性小體相關蛋白表達水平 與Con組相比，DMSO組和AST組腎小管上皮細胞中NLRP3、caspase-1蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；CM 組 NLRP3、caspase-1蛋白表達與Con組比較均顯著增加(P<0.05)。 與CM組比較，AST+CM組NAC+CM組NLRP3、caspase-1蛋白表達明顯減少(均P<0.05)。AST+CM組與NAC+CM組NLRP3、caspase-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、圖3。

圖1 各組HK-2細胞DAPI熒光染色(×200)

圖2 Annexin V/PI染色后流式細胞儀檢測細胞凋亡率

表1 各組HK-2細胞 NLRP3、caspase-1蛋白表達、IL-1β、IL-18表達比較

1～6：Con組，DMSO組，AST組，CM組，AST+CM組，NAC+CM組圖3 各組HK-2細胞 NLRP3、caspase-3蛋白的表達

2.6ELISA KITS測各組細胞IL-1β、IL-18表達 與Con組相比，DMSO組、AST組腎小管上皮細胞中IL-1β、IL-18表達量無明顯變化(P>0.05)；與Con組相比，CM組腎小管上皮細胞中IL-1β和IL-18表達量顯著增加(P<0.05)。 AST+CM組腎小管上皮細胞中IL-1β和IL-18表達量較CM組明顯減少(P<0.05)；NAC+COM組腎小管上皮細胞中IL-1β和IL-18表達量較CM組也明顯減少(P<0.05)。見表1。

3 討 論

CI-AKI是指血管內(nèi)途徑應用含碘對比劑后出現(xiàn)的急性腎功能損害〔7〕。最常使用的臨床診斷標準由 2003 年及 2008 年歐洲泌尿生殖放射協(xié)會確定，即使用對比劑后48～72 h內(nèi)SCr的絕對值升高大于44.2 μmol/L(0.5 mg/dl)或相對于基線水平升高大于25%，并且排除其他導致腎功能急性惡化的原因〔8〕。應用對比劑后，血肌酐通常在對比劑使用后1～2 d開始升高，3～5 d達到高峰，7～10 d恢復到正?！?〕。

CI-AKI的危險因素包括：基礎腎功能不全、糖尿病、高齡、高血壓、高膽固醇血癥、急性心肌梗死、血容量減少、高滲對比劑及對比劑的使用劑量等。其中基礎腎功能不全的患者CI-AKI的發(fā)生率明顯升高，尤其是合并糖尿病的患者〔10〕。CI-AKI的主要發(fā)病機制主要包括：(1)腎臟血流動力學改變；(2)氧化應激；(3)細胞凋亡；(4)造影劑的直接細胞毒性；(5)免疫炎癥反應等。一旦發(fā)生CI-AKI，不僅會增加患者腎衰竭和死亡的風險〔3,11〕，而且會顯著延長患者的住院時間，增加經(jīng)濟負擔〔12〕。

AST是迄今為止發(fā)現(xiàn)的自然界中抗氧化性最強的物質(zhì)。AST被證明具有抗氧化活性，可作為自由基的清除劑和ROS的猝滅劑〔13～15〕。在動物實驗和人體研究中還表現(xiàn)出有效的抗炎作用和抗凋亡作用。氧化應激、細胞凋亡和免疫炎癥反應是CI-AKI的常見病理生理學特征，因此AST可能在這種情況下具有潛在的治療作用。許多研究證明，AST對各種腎臟疾病具有預防作用〔16～20〕。最近的研究表明，AST的抗氧化活性在各種腎毒性藥物如黏菌素，順鉑和次氮基三乙酸鐵誘導的急性腎損傷中起保護作用〔21～23〕。Kim等〔24〕證實，在AST可以通過清除自由基減輕高濃度葡萄糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應。與本研究一致，本研究結(jié)果顯示，CM損傷后，細胞增殖活性受到抑制，AST預處理后可以改善細胞增殖活性，緩解CM誘導的HK-2細胞損傷。研究結(jié)果證實，細胞凋亡和炎癥反應機制參與了CM誘導的HK-2細胞損傷的發(fā)生；AST可以通過改善細胞凋亡和炎癥反應，減輕CM誘導的HK-2細胞損傷。

NLRP3能夠通過細胞凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)與caspase-1組成多蛋白復合體，即NLRP3炎癥小體〔25〕。NLRP3炎癥小體在機體受到外界刺激時能夠感受多種微生物產(chǎn)物和代謝性應激使NLRP3 炎癥小體激活，進而激活caspase-1，由活化的caspase-1作為效應蛋白誘導下游的細胞凋亡和炎癥反應〔26,27〕。人體內(nèi)多種細胞內(nèi)均有 NLRP3 炎癥體的表達，如單核細胞、樹突細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、上皮細胞和成骨細胞細胞質(zhì)〔28,29〕。研究顯示，NLRP3炎性小體及其介導的下游細胞凋亡和炎癥反應，在CI-AKI的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔30,31〕。對比劑可以作為PAMP激活NLRP3炎癥小體，對比劑干預后腎組織細胞內(nèi)的NLRP3表達水平顯著提高，參與腎組織的炎癥反應，從而引起腎臟組織細胞的損傷〔32〕。在NLRP3基因敲除的小鼠中對比劑引起的腎損傷顯著減輕。這提示，NLRP3炎癥小體可以作為防治對比劑急性腎損傷藥物研究的重要靶點〔30〕。本研究與上述研究結(jié)果一致，本實驗結(jié)果證明，AST是通過抑制NLRP3炎癥小體信號通路發(fā)揮作用的。

ROS目前被認為是激活NLRP3炎癥復合物的關鍵分子之一，ROS可以通過特有的途徑誘導NLRP3炎癥小體的組裝和激活〔33～35〕。AST作為自然界最強的抗氧化劑，其抗氧化性是維生素E的數(shù)百倍，AST能夠有效抑制ROS產(chǎn)生〔36〕。本實驗研究結(jié)果顯示：CM組HK-2細胞內(nèi) ROS 含量顯著升高；AST預處理后HK-2細胞內(nèi)ROS活性明顯降低。實驗結(jié)果初步證實我們的推測，AST是通過抑制ROS的產(chǎn)生實現(xiàn)對NLRP3炎癥小體信號通路的抑制作用，從而減輕碘海醇誘導的人HK-2的炎癥反應和細胞凋亡損傷。為了進一步證實，我們應用了ROS的特異性抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制ROS的產(chǎn)生。本實驗結(jié)果進一步證實了AST是通過抑制ROS的產(chǎn)生，從而抑制NLRP3炎癥小體及其下游的細胞凋亡和炎癥反應，減輕CM誘導的HK-2的損傷。