高通量二代測序鑒定ICU重癥肺炎老年患者下呼吸道菌群變化臨床意義

邊偉帥 陳煒 甄潔 劉平 趙國敏 張輝

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100038)

健康人體中存在大量不同種類的微生物，參與人體發(fā)育、營養(yǎng)、免疫及疾病等各個(gè)方面。研究顯示下呼吸道也存在大量的定植菌，正常狀態(tài)下不會致病，而是維持著炎癥反應(yīng)及抗炎反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡。呼吸道的菌群變化與呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)〔1〕，其中，肺炎是呼吸系統(tǒng)最常見的疾病之一，死亡率高達(dá)30.5%～46.6%〔2〕。對明確的病原菌進(jìn)行精準(zhǔn)的抗感染治療有助于減低肺炎患者死亡率及減少耐藥菌產(chǎn)生〔3〕。但肺炎患者多數(shù)為老年人，因老年人群免疫功能降低、炎癥指標(biāo)反應(yīng)較差，臨床表現(xiàn)常不典型，在病原學(xué)診斷上有一定困難〔4〕。而且鑒于目前對感染病原學(xué)的診斷，尤其針對細(xì)菌，主要仍基于細(xì)菌培養(yǎng)，而由于細(xì)菌的特性及培養(yǎng)條件，不能鑒定出所有致病菌，目前對于肺炎患者下呼吸道的菌群變化研究較少。本研究通過高通量二代測序基因技術(shù)對下呼吸道菌群多樣性及存在的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，為臨床治療重癥肺炎提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2020年1月入住首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科的重癥肺炎患者80例。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床肺感染評分>6分〔5〕；行經(jīng)口氣管插管及機(jī)械通氣治療；年齡>60歲；急診入院患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在慢性間質(zhì)性肺病；肺結(jié)核；病毒性肺炎；免疫缺陷性疾??；部分肺切除；合并其他臟器感染。分組：A組：入院時(shí)即予以氣管插管的社區(qū)獲得性肺炎(CAP)患者35例；B組：入院48 h后予以氣管插管的院內(nèi)獲得性肺炎(HAP)患者45例。記錄患者年齡、性別、碳青霉烯類抗菌藥物應(yīng)用時(shí)間(CAR)、氣管插管前住院時(shí)間(MV)、急性生理與慢性健康評估(APACHE)Ⅱ評分、C反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)、血清白蛋白(ALB)等指標(biāo)。留取肺部痰液標(biāo)本，利用高通量二代基因測序技術(shù)分析呼吸道微生物群落結(jié)構(gòu)，比較A、B兩組下呼吸道菌群變化。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本采集 經(jīng)氣管插管應(yīng)用一次性吸痰管將痰液負(fù)壓抽取至滅菌集痰器中，然后轉(zhuǎn)移至無菌EP管中，放置于-80℃冰箱保存。

1.3高通量二代基因測序 應(yīng)用Ion S5 XL 平臺進(jìn)行擴(kuò)增子測序分析。采用十六烷基三甲基溴化銨或 十二烷基磺酸鈉方法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μl。根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物擴(kuò)增得到相應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，使用Thermofisher的IonS5TMXL 進(jìn)行上機(jī)測序。

1.4基因信息分析 基于得到的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元(OTUs)聚類和物種分類分析，并將OTU和物種注釋結(jié)合，從而得到每個(gè)樣品的 OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果。再對 OTUs進(jìn)行豐度、多樣性指數(shù)等分析，同時(shí)對物種注釋在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。最后在以上分析的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)行一系列的基于OTUs、物種組成的聚類分析，應(yīng)用主坐標(biāo)分析(PCoA)，典型對應(yīng)分析(CCA)等統(tǒng)計(jì)比較分析，挖掘樣品之間的物種組成差異，并結(jié)合環(huán)境因素進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Alpha多樣性指數(shù)對物種多樣性進(jìn)行組間差異分析，通過t檢驗(yàn)分析組間物種多樣性平均值差異顯著性。對多維數(shù)據(jù)中提取出的最主要的組間特征值和特征向量排序，使用R軟件的WGCNA，stats和ggplot2軟件包進(jìn)行分析。對兩組菌群豐度比較進(jìn)行q檢驗(yàn)。對組間的差異物種進(jìn)行t檢驗(yàn)。應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析方法對兩變量的秩次大小進(jìn)行線性相關(guān)分析。采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般資料比較 兩組性別、年齡、ALB水平無明顯差異(P>0.05)；A組APACHE Ⅱ評分、CRP、PCT水平明顯高于B組(P<0.05)；B組MV時(shí)間、CAR時(shí)間明顯高于A組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較〔M(P25,P75)〕

2.2門水平菌群豐度比較 在門水平，A組下呼吸道菌群豐度前5位依次為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、軟壁菌門；B組呼吸道菌群豐度前5位依次為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍(lán)藻菌門。A組下呼吸道菌群多樣性(2 148.27±876.25)顯著高于B組下呼吸道(1 247.79±759.77，P<0.05)；兩組擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門存在明顯差異(P<0.05)。見表2。

2.3屬水平菌群豐度比較 在屬水平，A組下呼吸道菌群豐度前5位依次是鏈球菌屬、棒狀桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、支原體屬、乳桿菌屬，分別占下呼吸道總細(xì)菌數(shù)的20.49%、8.11%、5.78%、3.32%、3.19%；B組下呼吸道菌群豐度前5位依次是不動(dòng)桿菌屬、窄食單胞菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬、棒狀桿菌屬，分別占下呼吸道總細(xì)菌數(shù)的39.68%、31.62%、5.93%、4.85%、0.87%。兩組不動(dòng)桿菌屬、窄食單胞菌屬、鏈球菌屬、棒狀桿菌屬等存在明顯差異(P<0.05)。見表3。

2.4種水平菌群豐度比較 兩組痰液標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)行高通量宏基因組測序檢測病原體，對大于104copies/ml的細(xì)菌進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：A組肺炎鏈球菌、類白喉?xiàng)U菌、乳桿菌、松卟啉單胞菌、牙周梭桿菌、產(chǎn)黑素普雷沃菌占比明顯高于B組(P<0.05)；B組中鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌占比明顯高于A組(P<0.05)。見表4。

表2 門分類水平兩組菌群豐度比較

表3 屬分類水平兩組菌群豐度比較

表4 種分類水平兩組菌群豐度比較〔n(%)〕

3 討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAP病原學(xué)較HAP呈現(xiàn)更廣泛的多樣性。張鑫等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)在肺部腫瘤肺部標(biāo)本中以擬桿菌門、弧菌屬為主，正常肺組織中以變形菌門、芽孢桿菌屬為主。Hosgood等〔7〕通過454焦磷酸測序后分析，對健康中國女性痰液樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：厚壁菌門、鏈球菌屬占優(yōu)勢。與本研究CAP菌群一致?？讘浨锏取?〕研究顯示在急性呼吸窘迫綜合征患者呼吸道菌群中以厚壁菌門為主，而經(jīng)過機(jī)械通氣后厚壁菌門逐漸下降，變形菌門迅速上升，同時(shí)呼吸道菌群多樣性下降。本研究顯示隨住院時(shí)間延長，尤其出現(xiàn)HAP后菌群多樣性下降，與國外研究〔9〕類似。原因考慮為：應(yīng)用廣譜抗菌藥物對正常氣道菌群有殺傷作用，而耐藥的定植菌進(jìn)一步繁殖，而導(dǎo)致多樣性的減少。

對物種而言，CAP中主要以肺炎鏈球菌、類白喉?xiàng)U菌、乳桿菌、松卟啉單胞菌、牙周梭桿菌、產(chǎn)黑素普雷沃菌為主，多為口腔定植菌，一般不致病。但當(dāng)人體抵抗力下降時(shí),可引起感染，尤其是肺炎鏈球菌〔10〕。研究顯示肺炎鏈球菌是引起肺炎、菌血癥、腦膜炎、鼻竇炎和中耳炎的常見致病菌。成人重癥社區(qū)獲得性肺炎中肺炎鏈球菌處于首位〔11～14〕。部分地區(qū)感染率可達(dá)30%以上〔15〕。但在臨床上，檢測出肺炎鏈球菌的概率較低，考慮可能肺炎鏈球菌要求有較為嚴(yán)格的培養(yǎng)條件，常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)方法在一定程度上難以發(fā)現(xiàn)致病菌，而且使用抗菌藥物會明顯降低肺炎鏈球菌的檢出率〔16，17〕。本研究顯示在重癥CAP老年患者中鏈球菌比例明顯增高，考慮致病菌為肺炎鏈球菌可能性大。應(yīng)用高通量測序技術(shù)能盡早發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌，為臨床治療提供依據(jù)。但曹桂花等〔18〕認(rèn)為老年患者CAP以銅綠假單胞菌為主，考慮與其入選的患者為大于80歲的高齡老人有關(guān)。

根據(jù)中國醫(yī)院獲得性肺炎指南顯示：HAP病原菌以鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌等為主〔19〕。宋駿等〔20〕研究認(rèn)為由于抗菌藥物的廣泛使用,尤其在免疫力低下的患者中，鮑曼不動(dòng)桿菌成為致病菌的可能性顯著增加。張寧等〔21〕對308 例鮑曼不動(dòng)桿菌肺部感染患者的研究顯示：住院史及抗菌藥物使用史均為鮑曼不動(dòng)桿菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

嗜麥芽窄食單胞菌是廣泛存在于自然界的一種非發(fā)酵革蘭陰性菌。中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)〔22〕顯示我國SMA分離率在非發(fā)酵菌中僅次于銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌。SMA現(xiàn)已成為醫(yī)院感染的主要條件致病菌之一，抵抗力低下及基礎(chǔ)病較重的患者為其易感人群，呼吸道為其易感部位，此外，SMA對碳青霉烯類等廣譜抗菌藥物天然耐藥，容易獲得外源性耐藥基因而致多重耐藥，故臨床治療較為困難，嚴(yán)重影響患者預(yù)后〔23〕。王芳等〔24〕研究顯示嗜麥芽窄食單胞菌感染與住院時(shí)間及使用碳青霉烯類抗菌藥物呈正相關(guān)，與本研究一致。應(yīng)用高通量測序技術(shù)盡早發(fā)現(xiàn)嗜麥芽窄食單胞菌并予以合理抗菌藥物治療，可以有效減少SMA大量增殖。

綜上，在重癥肺部感染老年患者治療過程中，了解下呼吸道菌群變化，盡早明確病原學(xué)，盡早開展針對性治療，予以搶先治療，是治療成功的關(guān)鍵。但下呼吸道菌群受不同因素影響，各地區(qū)的病原譜存在差異，并且隨著時(shí)間的推移而不斷變遷，應(yīng)根據(jù)本地的病原學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)治療。