華蟾素膠囊對中晚期非小細胞肺癌手術(shù)患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶、自噬相關(guān)蛋白水平的影響*

張童，何弢，劉勇志，李曉菲，賀丹

（成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院 胸心乳腺外科，四川 成都 610041）

近年來，有學(xué)者在非小細胞肺癌（non-small lung cancer, NSCLC）細胞中檢測到自噬相關(guān)蛋白發(fā)生了改變，自噬可能與肺癌的發(fā)病、進展有密切聯(lián)系[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP）可對細胞外基質(zhì)中幾乎所有蛋白成分起降解作用，破壞阻礙腫瘤細胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[2]。華蟾素膠囊是一種中藥制劑，在調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤生長等方面可發(fā)揮一定作用，常用于晚期腫瘤患者的輔助治療[3]。有研究指出，華蟾素膠囊聯(lián)合化療治療可提高中晚期NSCLC 患者療效，改善免疫功能，延長生存期[4]。本研究擬探討華蟾素膠囊對中晚期肺癌手術(shù)患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶、自噬相關(guān)蛋白水平的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月—2021年4月就診于成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院的108 例中晚期NSCLC 患者。將患者分為對照組和研究組，各54 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015年版）》[5]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理學(xué)檢查確診；②卡氏功能狀態(tài)評分（Karnofsky performance status, KPS）≥60 分；③TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期；④預(yù)計生存時間＞6 個月；⑤無手術(shù)、化療禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝、腎等其他重要器官功能障礙者；②合并血液系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病者；③術(shù)前3 個月接受其他治療方案者。兩組性別、年齡、KPS 評分、TNM 分期、肺癌類型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），均衡性良好，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較 （n=54）

1.2 方法

患者均接受肺癌根治術(shù)，手術(shù)由同一組醫(yī)師完成。對照組患者術(shù)后4～5 周接受常規(guī)化療，即NP方案和GP 方案，NP 方案：第1、8 天靜脈滴注長春瑞濱（北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20067722）25 mg/（kg·m2），第1～5 天靜脈滴注順鉑（云南植物藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H53021679）20 mg/（kg·m2）。GP 方案：第1、8 天靜脈滴注吉西他濱（山東羅欣藥業(yè)集團恒欣藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20123345）1 000 mg/m2+250 mL 生理鹽水，第1～3 天靜脈滴注順鉑80～100 mg/m2。3 周為1 個化療周期，所有患者根據(jù)身體狀況接受3～6 個周期。研究組患者在對照組基礎(chǔ)上加用華蟾素膠囊（陜西東泰制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20050846），化療第1 天開始口服，與其他藥物服用間隔2 h，2 粒/次，3 次/d，3 周/周期，服用3 個周期。

1.3 評價指標(biāo)

1.3.1 臨床療效根據(jù)實體腫瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)[6]評估患者臨床療效，分為完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response, PR）、疾病穩(wěn) 定（stable disease, SD）、疾 病 進 展（progressive disease, PD），比較兩組患者客觀緩解率（objective response rate, ORR），ORR = CR + PR。目標(biāo)病灶消失，且無新病灶出現(xiàn)，持續(xù)＞4 周計為CR；目標(biāo)病灶直徑總和減少＞30%，且持續(xù)＞4 周計為PR；目標(biāo)病灶直徑總和減少≤30%或增加≤20%計為SD；目標(biāo)病灶直徑總和增加＞20%計為PD。

1.3.2 免疫功能指標(biāo)于治療前、治療3 個周期后采集兩組患者晨起空腹血3 mL，離心后待測，采用BD Influx 流式細胞分析儀（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司）測定T 淋巴細胞亞群水平，包括CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.3.3 腫瘤標(biāo)志物血清采集處理同上，采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測糖類抗原125（carbohydrate antigen-125, CA125）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase,NSE）。

1.3.4 MMP 和自噬相關(guān)蛋白血清采集處理同上，采用酶聯(lián)免疫法對基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、自噬相關(guān)蛋白1（Beclin1）水平進行測定，試劑盒購自上海一研生物科技有限公司，選用美國賽默飛公司的FC/K3 臺式酶標(biāo)儀檢測。

1.3.5 不良反應(yīng)比較兩組患者肝功能損傷、惡心嘔吐、白細胞減少、血小板減少等不良反應(yīng)發(fā)生情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療后臨床療效比較

兩組患者治療后ORR 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.483，P=0.034），研究組高于對照組。見表2。

表2 兩組患者治療后臨床療效比較 [n=54，例（%）]

2.2 兩組患者治療前后免疫功能指標(biāo)比較

兩組患者治療前后CD3+、CD4+、CD8+的差值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），研究組CD3+、CD4+下降程度，CD8+升高程度小于對照組。見表3。

表3 兩組患者治療前后免疫功能指標(biāo)的差值比較（n=54，%，±s）

表3 兩組患者治療前后免疫功能指標(biāo)的差值比較（n=54，%，±s）

組別對照組研究組t 值P 值CD3+-7.29±1.41-5.22±1.28 7.988 0.000 CD4+-4.74±1.24-2.54±0.58 11.810 0.000 CD8+1.83±0.32 0.59±0.20 20.929 0.000

2.3 兩組患者治療前后血清腫瘤標(biāo)志物比較

兩組治療前后CA125、CEA、NSE 的差值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），研究組下降程度大于對照組低。見表4。

表4 兩組患者治療前后血清腫瘤標(biāo)志物的差值比較（n=54，±s）

表4 兩組患者治療前后血清腫瘤標(biāo)志物的差值比較（n=54，±s）

組別對照組研究組t 值P 值CA125/（u/mL）-12.85±1.28-18.39±2.30 15.466 0.000 CEA/（ng/mL）-7.93±1.64-10.86±2.08 8.129 0.000 NSE/（ng/mL）-6.84±1.52-10.31±1.88 10547 0.000

2.4 兩組患者治療前后MMP-2、MMP-9、Beclin1、LC3-Ⅱ比較

兩組患者治療前后MMP-2、MMP-9、Beclin1、LC3-Ⅱ的差值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），研究組MMP-2、MMP-9 下降程度，Beclin1、LC3-Ⅱ升高程度大于對照組。見表5。

表5 兩組患者治療前后MMP-2、MMP-9、Beclin1、LC3-Ⅱ的差值比較 （n=54，±s）

表5 兩組患者治療前后MMP-2、MMP-9、Beclin1、LC3-Ⅱ的差值比較 （n=54，±s）

組別對照組研究組t 值P 值MMP-2/（μg/L）-86.09±10.24-126.88±12.89 18.208 0.000 MMP-9/（ng/L）-38.44±6.48-69.66±9.55 19.879 0.000 Beclin1/（ng/mL）1.68±0.34 3.27±0.51 19.062 0.000 LC3-Ⅱ/（ng/mL）10.72±1.23 16.71±2.06 18.346 0.000

2.5 兩組患者不良反應(yīng)比較

兩組患者血小板減少、肝功能損傷、白細胞減少、惡心嘔吐發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表6。

表6 兩組患者不良反應(yīng)比較 [n=54，例（%）]

3 討論

西醫(yī)治療中晚期NSCLC 的宗旨是有效控制病灶部位腫瘤細胞的生長，避免發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，而中醫(yī)治療該類疾病則以扶正培元為主，通過整體改善患者免疫功能，進而抑制腫瘤細胞[7-8]。目前，中西醫(yī)結(jié)合治療NSCLC 已成為新趨勢，有研究證實，中醫(yī)藥輔助治療NSCLC 可發(fā)揮減毒增效的作用[9]。

肺癌在中醫(yī)上屬“肺積”“胸痛”范疇，與臟腑失調(diào)、外邪侵入等有關(guān)，該病辨證論治應(yīng)以清熱解毒、理氣疏肝為主[10]。華蟾素膠囊是一種由蟾皮加工而成的中藥制劑，蟾蜍入藥最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中有記載，具有解毒消腫、清熱止痛、活血化瘀之功效[11]。本研究結(jié)果提示華蟾素膠囊可有效提高中晚期NSCLC 手術(shù)患者輔助治療的療效，改善免疫功能，降低血清腫瘤標(biāo)志物水平。究其原因在于：①華蟾素膠囊主要成分中含有大量蟾素內(nèi)脂素，具有散結(jié)破瘀、清熱解毒之功效；②華蟾素中含有多種活性成分，如生物堿、氨基酸等，其中吲哚類生物堿和強心甾體類化合物，如華蟾蜍素、脂蟾蜍配基、蟾酥毒基均具有一定抗腫瘤作用，可對多種腫瘤細胞發(fā)揮毒性作用，作用于腫瘤細胞周期S 期，有效抑制癌細胞DNA 和RNA 合成，進而癌細胞的生長，誘導(dǎo)癌細胞凋亡；③華蟾素可作用于骨髓紅細胞，促使其聚落，進而緩解骨髓抑制，有助于免疫功能的改善[12-13]。

自噬在腫瘤的發(fā)病、進展中有重要作用，在腫瘤發(fā)生早期自噬可通過清除受損細胞器和致癌蛋白對腫瘤的生長起到抑制作用，但在腫瘤晚期又可通過降解細胞內(nèi)細胞器、蛋白質(zhì)為腫瘤細胞的生長提供必不可缺的能量和營養(yǎng)物質(zhì)，促進生長[14]。LC3 是一種標(biāo)記蛋白，主要定位于自噬體膜上，在合成后經(jīng)切割形成LC3-Ⅰ，與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ，參與自噬體形成過程，是臨床評估自噬活動的金標(biāo)準(zhǔn)[15]。Beclin1是參與自噬活動的特異性基因，參與自噬泡形成過程。Beclin1 水平下降提示細胞自噬活動受到抑制，增加細胞應(yīng)激，基因組穩(wěn)定性下降，促進腫瘤形成[16]。TANG 等[17]研究表明，Curcumin 可誘導(dǎo)線粒體膜破裂和線粒體嵴減少，提高Beclin1 和LC3 的水平，激活肺癌細胞的自噬活性，誘導(dǎo)細胞凋亡，增強療效。趙景霞[18]的研究中也指出，Beclin1 和LC3 陰性表達提示肺癌術(shù)后接受化療的患者預(yù)后不良。這些研究均提示Beclin1 和LC3表達上調(diào)可使自噬活性提高，腫瘤生長受到抑制。本研究結(jié)果從側(cè)面反映華蟾素膠囊用于中晚期NSCLC 手術(shù)患者輔助治療的臨床療效，通過增強自噬活性進而抑制腫瘤生長。

NSCLC 發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的前提條件是穿過由血管基底膜和細胞外基質(zhì)組成的組織學(xué)屏障，MMP-2、MMP-9 均是MMP 家族中的一員，其中MMP-9 可由腫瘤細胞、巨噬細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞等多種細胞分泌，主要用于降解細胞外基質(zhì)促使腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，并可對堿性成纖維生長因子和血管內(nèi)皮因子起到誘導(dǎo)作用，加速腫瘤生長[19]。MMP-2 是一種蛋白水解酶，可水解細胞間質(zhì)中的膠原蛋白和黏蛋白，促使細胞間的黏合力下降，有助于腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，當(dāng)MMP-2 水平升高時則提示腫瘤細胞處于活動狀態(tài)[20-21]。

綜上所述，華蟾素膠囊可有效提高中晚期肺癌手術(shù)患者輔助治療的療效，改善免疫功能，降低血清腫瘤標(biāo)志物水平，抑制MMP 水平，提高細胞自噬活性，且未增加不良反應(yīng)。