大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的 制備及功能特性

◎ 路 暢，劉佳哲，吳小芝，張東娜，王喜萍

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132001）

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于大豆分離蛋白-多糖美拉德反應(yīng)的研究大多以美拉德反應(yīng)機(jī)理的研究為主，其原材料多糖使用葡萄糖、乳糖、麥芽糖較多，本試驗(yàn)原材料殼聚糖的選擇相對(duì)比較新穎。對(duì)于反應(yīng)產(chǎn)物的研究現(xiàn)有的多是抑制褐變、保鮮以及和氨基酸（酪氨酸）的相互作用等方面，有關(guān)其功能特性的研究少之又少，此次試驗(yàn)將為以后的研究提供依據(jù)。

已知大豆分離蛋白是以大豆粕為原料生產(chǎn)的食品添加劑，營(yíng)養(yǎng)全面，是可替代動(dòng)物蛋白的植物蛋白，含約90%蛋白質(zhì)，氨基酸種類齊全[1-3]。單獨(dú)的大豆分離蛋白無(wú)法擁有多個(gè)特性，難以進(jìn)一步應(yīng)用，因此對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行改性，具有重要意義[2-3]。甲殼素N-脫乙?；蓧A性多糖殼聚糖，與甲殼素、纖維素化學(xué)結(jié)構(gòu)相近，具有細(xì)胞親和性、生物降解性和生物效應(yīng)等性質(zhì)，殼聚糖2C位上是氨基，與甲殼素、纖維素不同，活性更強(qiáng)，因此具有更優(yōu)異的生物學(xué)功能，可用于化學(xué)修飾[4]。本試驗(yàn)以二者為原料進(jìn)行美拉德反應(yīng)（天然化學(xué)改性），進(jìn)一步提升蛋白質(zhì)的功能特性(如乳化活性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和溶解性等)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(山東愛采生物科技有限公司）；殼聚糖(蘇州美億辰生物科技有限公司)。

DPPH粉末、HCl、NaOH、NaCl、甲醇、pH 7.0的磷酸緩沖液及十二烷基硫酸鈉（均為天津市鼎盛鑫化工有限公司）；花生油（市售）；試驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

AL-2045電子天平，上海菁海儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；SY-720超聲波清洗機(jī)，昆山超聲儀器公司；BCD-221WDPT冰柜，青島海爾股份有限公司；DHL-820A恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；H2050R高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SK-1快速混勻器，金壇市城東新瑞儀器廠；V-721PC紫外分光光度計(jì)，上海馳唐儀器設(shè)備有限公司。

1.3 大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化

1.3.1 工藝流程

大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物制備的工藝流程為：大豆分離蛋白+殼聚糖→混合→攪拌→調(diào)pH→反應(yīng)釜反應(yīng)→冷卻→透析→不同分子量美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3.2 0.1 mol·L-1DPPH溶液的配制

用分析天平稱取DPPH粉末0.004 g，用甲醇溶解，100 mL容量瓶定容，制得0.1 mol·L-1的DPPH溶液。

1.3.3 測(cè)定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物DPPH清除率

取3只比色管，分別加入以下物質(zhì)。①加入樣液2 mL、0.1 mol·L-1DPPH溶液6 mL。②加入樣液2 mL、甲醇溶液6 mL。③加入甲醇溶液2 mL、0.1 mol·L-1DPPH溶 液6 mL。然 后 分 別 以3 500 r·min-1離 心 20 min，測(cè)定其在517 nm波長(zhǎng)的吸光度。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物DPPH清除率的計(jì)算公式為：

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物DPPH清除率=

式中：A1為管①的吸光值；A2為②管的吸光值；A3為③管的吸光值。

1.4 單因素試驗(yàn)

在試驗(yàn)中，有許多的因素影響大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的生成。主要有大豆分離蛋白∶殼聚糖（質(zhì)量比）、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及反應(yīng)pH。

1.4.1 大豆分離蛋白∶殼聚糖（質(zhì)量比）對(duì)大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)的影響

將大豆分離蛋白與殼聚糖按1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0和1.0∶2.5（質(zhì)量比）比例配制反應(yīng)物，進(jìn)行大豆分離蛋白與殼聚糖的美拉德反應(yīng)，反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間80 min，反應(yīng)pH值為4，以反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率為考察指標(biāo)，確定大豆分離蛋白∶殼聚糖的較佳值。

1.4.2 反應(yīng)溫度對(duì)大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)的影響

按優(yōu)化的大豆分離蛋白-殼聚糖配制反應(yīng)物(從試驗(yàn)中得到的質(zhì)量比），分別選取反應(yīng)溫度40 ℃、 50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃，進(jìn)行大豆分離蛋白與殼聚糖的美拉德反應(yīng)，反應(yīng)80 min，反應(yīng)pH值為4，以反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率為考察指標(biāo)，確定大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)的較佳反應(yīng)溫度。

1.4.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)的影響

按優(yōu)化的大豆分離蛋白-殼聚糖配制反應(yīng)物（從試驗(yàn)中得到的質(zhì)量比、反應(yīng)溫度），分別選取提取時(shí)間40 min、60 min、80 min、100 min和120 min，反應(yīng)pH值為4，進(jìn)行大豆分離蛋白與殼聚糖的美拉德反應(yīng)，以反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率為考察指標(biāo)，確定大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)的較佳反應(yīng)時(shí)間。

1.4.4 反應(yīng)pH對(duì)大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)的影響

按優(yōu)化的大豆分離蛋白-殼聚糖配置反應(yīng)物（從試驗(yàn)中得到的質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間），分別選取提取pH值為2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，進(jìn)行大豆分離蛋白與殼聚糖的美拉德反應(yīng)，以反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率為考察指標(biāo)，確定大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)的較佳反應(yīng)pH。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以大豆分離蛋白-殼聚糖質(zhì)量比、反應(yīng)的溫度、時(shí)間以及pH為影響因素，DPPH清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，完成正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)反應(yīng)組合。因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.6 大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的純化（樣品純化）

以正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)反應(yīng)條件組合進(jìn)行大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備。采用3 500 Da 和8 000 Da的透析袋進(jìn)行透析，得到分子量＜3 500 Da、 分子量為3 500～8 000 Da、分子量＞8 000 Da的樣液，烘干后得到樣品，用于功能特性的測(cè)定。

1.7 大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物功能特性的測(cè)定

1.7.1 乳化活性的測(cè)定

稱樣品0.1 g溶解于20 mL、pH值為7.0的PBS緩沖液（0.05 mol·L-1），充分?jǐn)嚢瑁?0 min，加入 4.0 mL花生油，均質(zhì)（8 000 r·min-1、1 min）。迅速?gòu)娜橐合露肆咳?00 L乳濁液，離散到10 mL 0.1%的月桂醇硫酸鈉溶液中，于500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定該稀釋液的吸光度A0，吸光度A0與界面面積呈正相關(guān)[6-7]。乳化活性的計(jì)算公式如下：

式中：A為大豆分離蛋白，m2·g-1；n為稀釋倍數(shù)；?為體系中油相所占的比例，本試驗(yàn)為0.2；c為蛋白質(zhì)溶液的濃度，g·mL-1；l為比色池光徑，本試驗(yàn)為1 cm。

1.7.2 乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

上述樣品靜置15 min，從下端量取100 μL乳濁液，離散于10 mL 0.1%的月桂醇硫酸鈉溶液中，測(cè)定 500 nm波長(zhǎng)的吸光度At[6-7]。乳化穩(wěn)定性以es表示，計(jì)算公式如下：

式中：A0為0時(shí)刻吸光值；An為n時(shí)刻時(shí)吸光值；ΔA為Δt內(nèi)吸光值差。

1.7.3 起泡性的測(cè)定

起泡性的測(cè)定采用攪打發(fā)泡測(cè)定法，即用pH值為7.0的PBS緩沖溶液溶解樣品，配成3%的乳濁液。取200 mL 3%乳濁液，打泡（8 000 r·min-1、3 min），測(cè)泡沫體積，記錄為V0[8-9]。按下式計(jì)算起泡度（FAI）：

靜置30 min，測(cè)泡沫體積，記錄為VT[7-8]。按下式計(jì)算泡沫穩(wěn)定性（FS）：

1.7.4 溶解性的測(cè)定

稱取樣品100 mg，15 mL蒸餾水溶解，用低濃度NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH，攪拌30 min，離心 （4 000 r·min-1、30 min）。凱氏定氮法測(cè)定該pH條件下可溶性蛋白質(zhì)含量及總氮含量[8-9]。溶解度計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 大豆分離蛋白-殼聚糖質(zhì)量比對(duì)大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響

由圖1可知，隨著大豆分離蛋白-殼聚糖質(zhì)量比的減小，DPPH清除率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，大豆分離蛋白-殼聚糖質(zhì)量比為1.0∶1.0的DPPH清除率最大，即大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的物料比為1.0∶1.0時(shí)產(chǎn)量最優(yōu)。

圖1 大豆分離蛋白∶殼聚糖（質(zhì)量比）對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的影響圖

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響

由圖2可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，DPPH清除率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，反應(yīng)溫度為50 ℃的DPPH清除率最大，即大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)為最優(yōu)反應(yīng)條件。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響

由圖3可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，DPPH清除率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，反應(yīng)時(shí)間為80 min的DPPH清除率最大，即大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)時(shí)間為80 min時(shí)產(chǎn)量最優(yōu)。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德 反應(yīng)產(chǎn)物的影響圖

2.1.4 反應(yīng)pH對(duì)大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響

由圖4可知，隨著pH值的增大，DPPH清除率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，pH值為4的DPPH清除率最大，即大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)pH值為4時(shí)產(chǎn)量最優(yōu)。

圖4 反應(yīng)pH對(duì)大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德 反應(yīng)產(chǎn)物的影響圖

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

以DPPH清除率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選取大豆分離蛋白∶殼聚糖（質(zhì)量比）、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及反應(yīng)pH 4個(gè)影響因素的3個(gè)較佳水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，最終確定最佳反應(yīng)條件。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

由表2可知，4種因素的主次順序是反應(yīng)pH＞反應(yīng)時(shí)間＞質(zhì)量比＞反應(yīng)溫度，其中反應(yīng)pH影響程度明顯最大。根據(jù)表中的極差分析法可以對(duì)最優(yōu)水平進(jìn)行判斷，最佳設(shè)計(jì)方案為A1B2C2D2（46.9%），而由K值分析可知，最佳組合應(yīng)為A2B2C2D2，因此對(duì)兩種組合分別做3次試驗(yàn)驗(yàn)證，再求其平均值。試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，A1B2C2D2組合條件下的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物DPPH清除率為46.3%，A2B2C2D2組合條件下的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物DPPH清除率為為48.7%，因此A2B2C2D2為最佳條件，即最佳反應(yīng)條件為大豆分離蛋白∶殼聚糖（質(zhì)量比）1∶1，反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)時(shí)間 80 min，反應(yīng)pH 4。

2.3 大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物功能特性的測(cè)定

2.3.1 乳化活性的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)公式（2）計(jì)算樣液的乳化活性，結(jié)果如圖5所示。大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)透析成不同分子量的反應(yīng)產(chǎn)物，分子量為3 500～8 000 Da的DPPH清除率較高，即該階段的反應(yīng)產(chǎn)物乳化活性較好。分子量＜3 500 Da和分子量＞8 000 Da的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率相差不多，其乳化活性相似。

圖5 乳化活性的測(cè)定結(jié)果圖

2.3.2 乳化穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)公式（3）計(jì)算樣液乳化穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6 所示。大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)透析成不同分子量的反應(yīng)產(chǎn)物，3 500～8 000 Da的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率較高，即該階段的反應(yīng)產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性較好。

圖6 乳化穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果圖

2.3.3 起泡性的測(cè)定結(jié)果

按公式（4）計(jì)算樣液起泡度，結(jié)果如圖7所示。大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)透析成不同分子量的反應(yīng)產(chǎn)物，3 500～8 000 Da的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率較高，即該階段的反應(yīng)產(chǎn)物起泡度較好。分子量＜3 500和分子量＞8 000的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率相差不大，其起泡度 相似。

按公式（5）計(jì)算樣液起泡穩(wěn)定性，結(jié)果如圖8所示。大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)透析成不同分子量的反應(yīng)產(chǎn)物，3 500～8 000 Da的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率較高，即該階段的反應(yīng)產(chǎn)物起泡穩(wěn)定性較好。分子量＜3 500 Da和分子 量＞8 000 Da的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率相差不大，其起泡穩(wěn)定性相似。

圖7 起泡度的測(cè)定結(jié)果圖

圖8 起泡穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果圖

2.3.4 溶解性的測(cè)定結(jié)果

利用公式（6）計(jì)算溶解度，結(jié)果如圖9所示。大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)透析成不同分子量的反應(yīng)產(chǎn)物，3 500～8 000 Da的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率較高，即該階段的反應(yīng)產(chǎn)物溶解性較好。分子量＜3 500 Da和分子量＞8 000 Da的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH清除率相差不大，其溶解性相似。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以大豆分離蛋白和殼聚糖為原料在反應(yīng)釜內(nèi)進(jìn)行美拉德反應(yīng)，使大豆分離蛋白得到化學(xué)改性，使其功能特性得到提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的物料比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)pH都會(huì)影響大豆分離蛋白與殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的生成，由單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出最佳反應(yīng)條件為大豆分離蛋白∶殼聚糖（質(zhì)量比）1∶1、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間80 min、pH 4。該研究結(jié)果將為大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應(yīng)的制備起到指導(dǎo)性作用。利用上述試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的制備，并用透析袋進(jìn)行透析得到不同分子量（＜3 500 Da、3 500～8 000 Da、＞ 8 000 Da）的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行功能特性的分析。結(jié)果表明3 500～8 000 Da的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乳化活性、乳化穩(wěn)定性、起泡性以及溶解性最高， 而＜3 500 Da 和＞8 000 Da的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的各個(gè)功能特性相近。美拉德反應(yīng)是蛋白質(zhì)化學(xué)改性的天然方法，能夠使其功能特性得到一定程度的提高。