甲基苯丙胺的神經(jīng)毒性：基于蛋白組學(xué)的靶向神經(jīng)突觸損傷研究

彭 鵬，解翠薇，王 軍，肖 杭

1南京衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校臨床一教研室，江蘇 南京 210038；2南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，江蘇 南京211166

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）的濫用已成為包括我國在內(nèi)的全球公共衛(wèi)生問題。METH濫用不僅造成機體多系統(tǒng)的嚴重損傷，同時亦對家庭及社會穩(wěn)定造成極大危害。腦損傷一直是METH濫用引起神經(jīng)損傷及精神障礙的不良后果。研究顯示，METH可作用于多巴胺單胺能神經(jīng)元，引起多巴胺大量釋放，產(chǎn)生興奮性毒性，導(dǎo)致該區(qū)域神經(jīng)元死亡，引發(fā)帕金森樣改變［1］；我們前期研究顯示，METH 暴露亦可引發(fā)阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）樣病理性蛋白β?amyloid（Aβ）、p?tau 的顯著上調(diào)［2］；此外，METH 暴露引發(fā)精神性疾病，如抑郁、焦慮等［3］。然而，在目前的多數(shù)報道中，METH的神經(jīng)毒性及其機制的研究往往集中于某種病理性改變或某種機制的探討，對METH 暴露引發(fā)的病理性改變?nèi)匀狈ο到y(tǒng)而全面的認識?；诖?，借助于高通量的蛋白組學(xué)，本研究探討了原代神經(jīng)元METH 暴露后蛋白組及其相關(guān)功能信號的改變，旨在從整體方面闡述METH 暴露引起的神經(jīng)損傷，增強對METH 神經(jīng)毒性的系統(tǒng)認識。此外，在系統(tǒng)認識的基礎(chǔ)上，對神經(jīng)突觸的表達、數(shù)量、聯(lián)系的研究，一方面闡述了METH 引起神經(jīng)元損傷的部分機制，另一方面也是對組學(xué)中神經(jīng)損傷結(jié)果的進一步驗證，從而為METH 濫用引起的神經(jīng)毒性提供潛在的干預(yù)靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

18 d SD 清潔級孕大鼠均購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2021?0001。動物飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，每12 h 晝夜明暗交替實驗中原代細胞培養(yǎng)獲南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理委員會的批準(zhǔn)（倫理號：IACUC?1902013）。

Easy nLC 色譜系統(tǒng)、Agilent 1260 infinity ⅡHPLC 系統(tǒng)、Q Exactive 質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scien?tific 公司，美國），激光共聚焦顯微鏡（Zeiss 公司，德國），低溫高速離心機（5430R，Eppendorf 公司，德國），電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（BIO?RAD公司，美國），Multiskcan FC 酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國），真空離心濃縮儀（LNG?T98，蘇州太倉華美），超聲破碎儀（JY96?IIN，寧波新芝公司），MP Fastprep?24 勻漿儀（Fastprep?24 5G，MP 公司，美國），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；Pro?teome Discoverer 2.1（Thermo Fisher Scientific 公 司，美國），MASCOT 2.6（Matrix Science公司，美國），Per?seus 1.3（Max Planck Institute of Biochemistry in Mar?tinsried，德國），R version 3.0.3。

Neurobasal medium、B27、L?谷氨酰胺、甲酸（Thermo Fisher Scientific 公司，美國），DMEM/F12、胎牛血清（Gibco 公司，美國），Alexa Fluor?568（Life公司，美國），BSA、Tris（北京生工公司），木瓜蛋白酶、碘乙酰胺、NH3·H2O、NH4HCO3（Sigma Aldich 公司，美國），乙腈（Merck 公司，美國），BCA 定量試劑盒、SDS?PAGE 蛋白上樣緩沖液（杭州碧云天），甲基苯丙胺（北京中國食品藥品檢定研究院），Multiple Affinity Removal LC Column Human 14/Mouse 3（Ag?ilent公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 原代神經(jīng)元培養(yǎng)

取孕18 d SD 大鼠的胎鼠腦皮質(zhì)，經(jīng)2.0%的木瓜酶消化，經(jīng)100 μm及40 μm的濾網(wǎng)過濾，離心后，加入5 mL 神經(jīng)元培養(yǎng)液，以5×105個/mL 的密度接種，每隔3 d進行半量換液，待神經(jīng)元長至8～10 d成熟后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 神經(jīng)元蛋白組學(xué)的測定

FASP 酶解：原代培養(yǎng)的神經(jīng)元與METH（900 μmol/L）處理24 h 后，提取蛋白并測濃度。各組樣品取150 μg 蛋白質(zhì)溶液，分別加入DTT 至終濃度為100 mmol/L，與樣本孵育后，加入200 μL UA buffer，混合離心，后加入IAA buffer，經(jīng)Trypsin 處理后，用C18 Cartridge 對肽段進行脫鹽，肽段凍干后加入40 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，280 nm波長下進行肽段定量。

Easy nLC 色譜分離：每份樣品采用納升流速Easy nLC 系統(tǒng)進行分離。緩沖液A 液為0.1%甲酸水溶液，B 液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為80%）。樣品由自動進樣器上樣到分析柱分離，流速為300 nL/min。1.5 h 梯度：0～5 min，B 液6%；5～75 min，B 液線性梯度6%～38%；75～85 min，B 液線性梯度38%～100%；85～90 min，B液維持在100%。

質(zhì)譜鑒定：樣品經(jīng)色譜分離后用Q Exactive 質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。利用多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比采集，每次全掃描后采集10 個碎片圖譜（MS2 scan），儀器條件設(shè)置如下：MS2 Activation Type 為HCD，Isolation window 為2 m/z，二級質(zhì)譜分辨率35 000，Microscans 為1，二級Maximum IT 為45 ms，Normalized Collision Energy 為30 eV。

蛋白質(zhì)定性和定量分析：通過Proteome Discov?erer 2.1軟件內(nèi)置工具提交到MASCOT2.6 服務(wù)器進行數(shù)據(jù)庫檢索；通過Proteome Discoverer 2.1 將MAS?COT 服務(wù)器上形成的查庫文件（.dat 文件）傳回軟件，根據(jù)FDR<0.01 的標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)據(jù)進行篩選，獲得高度可信的定性結(jié)果；使用數(shù)據(jù)庫Uniprot_RattusNor?vegicus_36080_20180123，針對質(zhì)譜分析原始文件用軟件Mascot2.6和Proteome Discoverer2.1進行查庫鑒定及定量分析。根據(jù)上述定量定性分析結(jié)果，進行基因本體論（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路的分析。

1.2.3 蛋白免疫印跡分析

神經(jīng)元裂解提取蛋白后，通過BCA法對蛋白進行定量，每個泳道加入蛋白40 μg后電泳及轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉溶液封閉，后與一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h，通過ECL發(fā)光檢測成像。

1.2.4 免疫熒光分析

神經(jīng)元固定（4%的多聚甲醛），清洗，透化后加入10%山羊血清，37 ℃封閉60 min后，加入一抗，避光4 ℃過夜，后加入熒光標(biāo)記二抗及防熒光猝滅DAPI 復(fù)合染料，激光共聚焦顯微鏡下拍照，計數(shù)。每皿細胞隨機拍攝9個視野，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析處理，使用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組定量資料比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA）檢驗，多組數(shù)據(jù)間兩兩比較選用Dunnett?t檢驗，兩組定量數(shù)據(jù)比較用Student’st檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，繪圖使用GraphPad Prism 7.0。

2 結(jié)果

2.1 同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）分析

同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）是一種體外同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)定性定量技術(shù)。為觀察METH 對原代神經(jīng)元蛋白質(zhì)的表達改變，通過METH（900 μmol/L）處理原代神經(jīng)元24 h，然后提取細胞蛋白進行iTRAQ 分析。所鑒定蛋白按差異倍數(shù)和P值分布如圖1 所示，差異倍數(shù)和相應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)量呈正態(tài)分布（圖1A），其中，METH 組與對照組比差異蛋白共51個，其中表達上調(diào)的有40個，下調(diào)的有11個，METH作用表達上調(diào)的蛋白較下調(diào)蛋白多（圖1B）。

圖1 對照組與METH比較后，兩組樣本蛋白質(zhì)表達差異分布和火山圖Figure 1 Analysis of the protein expression distribution and volcanic map of the control and METH groups

2.2 GO功能注釋

用序列比對工具NCBI BLAST+（ncbi?blast?2.3.0+）將iTRAQ 分析得到的51 種差異蛋白與蛋白序列數(shù)據(jù)庫進行比對，批量提取GO 注釋。通過In?terProScan 搜索EBI 數(shù)據(jù)庫將相關(guān)的功能信息注釋給目標(biāo)蛋白質(zhì)序列，運行ANNEX以提高GO注釋準(zhǔn)確性。提取差異蛋白的GO Level2注釋并進行分析（圖2）。結(jié)果顯示，METH 引起與細胞生物學(xué)過程、分子功能及細胞組分相關(guān)蛋白的改變。在細胞生物學(xué)過程方面，細胞組分和生物合成、生物調(diào)節(jié)、免疫功能、神經(jīng)代謝與發(fā)育、對外界作用的應(yīng)答等過程尤為明顯；在分子功能方面，主要涉及轉(zhuǎn)運、催化、分子傳遞等活性及蛋白結(jié)合過程的改變；在細胞組分的改變中，涉及大分子蛋白、細胞膜、細胞器及突觸等相關(guān)蛋白的改變。

圖2 GO注釋結(jié)果的Level 2統(tǒng)計Figure 2 Level 2 Statistics of GO annotation results

2.3 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析是蛋白質(zhì)組學(xué)分析細胞功能改變的重要方法。該研究中，基于實驗中51個差異蛋白，分析出19個蛋白在KEGG數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的多個信號通路。在差異蛋白通路富集結(jié)果中，依據(jù)顯著性水平選取了10 個產(chǎn)生明顯改變的信號通路（圖3），其中與突觸相關(guān)的多個信號通路發(fā)生改變（紅框表示），提示METH 暴露對突觸的調(diào)節(jié)通路的改變。

圖3 KEGG通路富集Figure 3 KEGG pathway enrichment

2.4 METH暴露引起原代神經(jīng)元突觸表達的改變

突觸是評價神經(jīng)元生理功能的重要指標(biāo)，在腦學(xué)習(xí)記憶，情緒及精神作用方面極為重要?；谏鲜龅鞍捉M學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，METH 暴露引起多種突觸功能的改變（GABA 能及谷氨酸能突觸，圖3紅框），以及細胞成分突觸及突觸部分的作用（圖2 紅框），我們驗證了METH 作用后對突觸的影響，觀察了突觸前，突觸后及棘突標(biāo)志性蛋白的表達。與蛋白組學(xué)中METH 影響突觸的結(jié)果一致，METH 作用于神經(jīng)元后引發(fā)棘突標(biāo)志性蛋白Drebrin 及突觸后標(biāo)志性蛋白PSD95表達的下調(diào)（圖4），與對照組比，具有顯著性差異（P<0.05）。此外，METH作用引起突觸前標(biāo)志物Synapsin 1 的上調(diào)，上述結(jié)果提示，METH 暴露引起突觸數(shù)量的改變，而對于突觸后存在明顯的損傷作用。

圖4 METH染毒對原代神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白表達的影響Figure 4 Synapse associated protein levels of METH treated primary neurons

2.5 METH對樹突、棘突表達及定位的影響

為進一步驗證蛋白組學(xué)中METH對突觸的作用及闡述METH 暴露引起的原代神經(jīng)元樹突、棘突的影響，我們借助免疫熒光法，利用抗F?actin 及Dre?brin抗體分別標(biāo)記神經(jīng)元的樹突及棘突。結(jié)果顯示（圖5），對照組中樹突與棘突存在大量的共定位，樹突上棘突數(shù)量豐富，而METH（900 μmol/L）作用神經(jīng)元24 h 后，棘突數(shù)量及熒光強度明顯下降，同時與樹突的共定位亦顯著降低，提示METH 暴露后可改變樹突、棘突結(jié)構(gòu)及數(shù)量的改變，證明METH對神經(jīng)元的毒性作用。

圖5 METH對原代神經(jīng)元F?actin表達水平變化及樹突脊數(shù)量的改變Figure 5 Effects of METH on the expression of F?actin and the number of dendritic spines in primary neurons

2.6 METH 對突觸前及突觸后標(biāo)志性蛋白表達及定位影響

在METH 引起棘突數(shù)量減少了基礎(chǔ)上，該研究進一步觀察了突觸前神經(jīng)元與突觸后神經(jīng)元之間的作用。以突觸后密度蛋白（post synaptic density protein 95，PSD95）特異性標(biāo)記神經(jīng)元突觸后，同時以Synapsin 1 標(biāo)記突觸后，觀察METH 作用前后二者之間的相互作用。在METH 作用前，神經(jīng)元突觸前與突觸后相互作用良好，存在較多的共定位；但METH作用24 h后，PSD95與Synapsin 1的共定位明顯減少，且與Western blot 結(jié)果一致，METH 作用后PSD95 的數(shù)量減少，說明METH 作用后突觸后損傷嚴重（圖6）。

圖6 METH染毒原代神經(jīng)元24 h后突觸數(shù)量的改變Figure 6 Changes of synaptic number in primary neurons exposed to METH for 24 hours

3 討論

METH 作用的主要靶器官之一是腦，其濫用直接導(dǎo)致腦微環(huán)境的改變，引發(fā)腦功能異常，引起神經(jīng)退行性、抑郁焦慮行為學(xué)改變等多種神經(jīng)及精神性疾病的發(fā)生。因此，對METH 神經(jīng)毒性的深刻揭示可為METH 濫用的干預(yù)提供積極指導(dǎo)，并具有重要的理論意義。然而，目前對于METH 神經(jīng)毒性的研究多集中于對黑質(zhì)紋狀體區(qū)域單胺神經(jīng)元的毒性研究，此外，針對神經(jīng)炎性反應(yīng)如對小膠質(zhì)及星形膠質(zhì)細胞的激活等研究亦相對較多，如既往借助基因芯片，發(fā)現(xiàn)METH 作用后神經(jīng)元大量炎性因子釋放及通路激活，闡釋了炎性引起神經(jīng)元損傷中的作用［5］。盡管如此，對于METH 濫用導(dǎo)致的神經(jīng)毒性作用仍缺乏總體上的認識。因此，本研究借助蛋白組學(xué)的方法，系統(tǒng)觀察了METH 作用神經(jīng)元后，總體蛋白的表達及多種關(guān)鍵信號途徑的改變，并基于神經(jīng)元蛋白組學(xué)的數(shù)據(jù)，從突觸損傷角度，剖析了METH 暴露引起神經(jīng)元突觸的損傷作用及部分機制，目前類似報道極少，具有較好的創(chuàng)新性及科學(xué)性。

本研究采用900 μmol/L METH 與神經(jīng)元作用，這一濃度的選擇與人體體液中檢測出的最大濃度接近（600 μmol/L）［6］，同時該濃度在既往研究METH毒性作用的多篇文章中應(yīng)用，具有穩(wěn)定的神經(jīng)毒性作用［5，7］，基于此，借助iTRAQ分析，鑒定出神經(jīng)元多種蛋白發(fā)生明顯改變，這些蛋白的改變涉及神經(jīng)元調(diào)節(jié)、代謝、免疫、增殖、發(fā)育等多種細胞生物功能的改變。這與Lee 等［4］報道的METH 引起T 細胞凋亡及鈍化，繼而影響免疫功能的報道一致。同時，在分子功能方面，本研究亦與METH 暴露影響細胞過程轉(zhuǎn)運、信號傳遞、應(yīng)激應(yīng)答等活動類似［8-9］。值得一提的是，METH暴露可能影響突觸的功能，尤其GABA能及谷氨酸能突觸通路受到METH暴露后的影響。研究顯示，谷氨酸能及GABA 能突觸在學(xué)習(xí)記憶的過程中發(fā)揮重要作用［10］，而谷氨酸能及GA?BA 能突觸功能異?；蚪Y(jié)構(gòu)改變會導(dǎo)致神經(jīng)及精神疾病的發(fā)生，如癲癇、焦慮、抑郁、阿爾茲海默癥［11-12］，對谷氨酸能突觸的靶向干預(yù)能明顯減輕學(xué)習(xí)記憶能力的下降［13］，而GABA能突觸在神經(jīng)發(fā)育障礙的病因中起著重要作用，包括GABA能神經(jīng)元的產(chǎn)生、遷移和存活［14］。作為一種突觸后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合的關(guān)鍵蛋白，PSD95具有參與突觸連接的形成、維持突觸的可塑性、參與疼痛的調(diào)控等多種生物學(xué)功能。研究顯示，PSD95 的3′UTR 多態(tài)性與急性缺血性卒中相關(guān)［15］，而PSD95 的下調(diào)與缺失引發(fā)神經(jīng)元NMDA、AMPA 及GABAA受體表達，阻礙神經(jīng)發(fā)育，導(dǎo)致多種神經(jīng)疾病，包括自閉和精神分裂［16］。而通過BDNF?TrkB?CREB上調(diào)PSD95后可明顯改善Aβ42引起的神經(jīng)元損傷［17］，PSD95 的上調(diào)亦可顯著改善慢性束縛應(yīng)激引發(fā)的小鼠抑郁樣改變，上述PSD95減少引起的病理性現(xiàn)象與本研究中METH暴露引起PSD95顯著下調(diào)的現(xiàn)象一致。METH暴露促進突觸前大量囊泡及囊泡中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，近期有研究充分揭示了Synpasin 1與囊泡數(shù)量的關(guān)系，即Synpa?sin 1 的表達密切調(diào)控囊泡的數(shù)量［18］，提示METH 引起的Synpasin 1 高表達可能與METH 引起囊泡數(shù)量及調(diào)控改變相關(guān)。在棘突方面，METH 引起其表達與數(shù)量的明顯減少，同時引起突觸前與突觸后定位的顯著下降，提示突觸前與突觸后的聯(lián)系降低。

本研究從蛋白組角度系統(tǒng)闡述了METH暴露引起神經(jīng)元多種活動及信號通路的改變，通過聚焦突觸改變，揭示突觸損傷、聯(lián)系減少是METH引起神經(jīng)元功能降低的重要原因，因此針對性保護突觸的損傷，上調(diào)PSD95 等關(guān)鍵突觸蛋白可能為METH 引起的神經(jīng)損傷及相關(guān)神經(jīng)性疾病提供治療策略，具有重要的干預(yù)意義。