大腸桿菌J2_5的全基因組測序及比較基因組分析

支婭茹，張 瑩，于鑫焱，劉曉秋

南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系，江蘇省現(xiàn)代病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211166

細(xì)菌是導(dǎo)致感染性疾病的最常見病因。近年來，由于抗生素濫用帶來的選擇壓力，加速了致病菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性［1］，臨床分離到的多耐藥菌及全耐藥菌的菌株數(shù)量急劇攀升。抗生素耐藥性（AMR）細(xì)菌嚴(yán)重威脅人類的生命健康，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成沉重負(fù)擔(dān)［2］。臨床常見的耐藥菌有大腸桿菌（E.coli）、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌等，其中在革蘭陰性桿菌中，大腸桿菌耐藥問題最為嚴(yán)重。尿路致病性大腸桿菌（UPEC）是泌尿道感染的主要致病菌［3］，可引起敗血癥和新生兒腦膜炎等并發(fā)癥［4］，大腸桿菌是導(dǎo)致新生兒侵襲性全身感染的三大常見致病菌之一［5］。大腸桿菌對多種抗生素呈交叉耐藥，是全世界迄今為止報(bào)告的耐藥率最高的細(xì)菌之一［6］，其導(dǎo)致的臨床感染治療難度大。

針對β?內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的大腸桿菌在臨床上最常見。β?內(nèi)酰胺類抗生素是目前臨床使用率很高的抗生素，占抗生素總使用量的30%～40%［7］。β?內(nèi)酰胺類藥物的作用機(jī)制是通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁黏肽合酶的產(chǎn)生，阻止黏肽的產(chǎn)生，進(jìn)而破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁［8］。產(chǎn)生超廣譜β?內(nèi)酰胺酶（ESBL）的大腸桿菌菌株對多種β?內(nèi)酰胺類藥物具有耐藥性［9］，常見的ESBL 編碼基因包括CTX?M、SHV、TEM［10］。在過去10 年中，TEM 和SHV 型是最常見的β?內(nèi)酰胺酶基因類型，但近年來，CTX?M 型在世界范圍內(nèi)廣泛傳播［11］。與對β?內(nèi)酰胺類敏感的大腸桿菌感染相比，ESBL 大腸桿菌感染的臨床治療效果更差［12］。從2003年到2018年，在全球范圍內(nèi)，社區(qū)中ESBL大腸桿菌的腸道攜帶率增加了8倍［13］。因此，需要新的治療方法和公共衛(wèi)生策略來預(yù)防ESBL大腸桿菌的傳播擴(kuò)散。

耐藥的致病性大腸桿菌還攜帶多種毒力因子（細(xì)菌定植相關(guān)基因、黏附素、毒素、鐵獲取因子、脂多糖、侵襲素等），通常毒力基因可由致病島（PAI）、質(zhì)粒和其他可移動(dòng)遺傳元件編碼［14］。對致病性大腸桿菌的傳播動(dòng)力學(xué)和毒性克隆選擇的機(jī)制仍然知之甚少，因此對其耐藥分子及毒力基因的研究具有重要的流行病學(xué)意義。

目前，全基因組測序在公共衛(wèi)生關(guān)注的病原體監(jiān)測中已經(jīng)廣泛應(yīng)用［15］。通過全基因組測序可以監(jiān)測流行病學(xué)進(jìn)展，同時(shí)可以檢測新基因型大腸桿菌的毒力基因和耐藥基因［16-17］。因此，本研究使用Illumina HiSeq 平臺(tái)對一株新分離的臨床多重耐藥的ESBL 大腸桿菌J2_5 進(jìn)行高通量測序，利用生物信息學(xué)工具進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接、注釋和分析，獲得基因組草圖，并對該菌的耐藥基因、毒力基因、菌株序列型進(jìn)行了全面的分析。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌MG1655 菌株由實(shí)驗(yàn)室保存，J2_5 菌株分離自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院患者的臨床樣本，該菌株為ESBL（+）菌，對多種抗生素產(chǎn)生耐藥。研究已通過南京醫(yī)科大學(xué)倫理審核［批準(zhǔn)文號是：南醫(yī)大倫審（2021）478 號］。所有菌株均在Luria?Bertani（LB）培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)。

酵母抽提物（Oxiod 公司，英國），氯化鈉（北京中國國藥集團(tuán)），胰蛋白胨（Oxiod 公司，英國），瓊脂粉（上海生工），2×Taq PCR Master Mix、瓊脂糖（上海翊圣），恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城），PCR 擴(kuò)增儀（Eppendorf，德國），瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物），凝膠成像儀（伯樂公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 J2_5菌株基因組測序

J2_5 的基因組DNA 用TIANamp Bacteria DNA Kit（Tiangen Biotech）提取，并使用Illumina HiSeq 技術(shù)進(jìn)行測序。使用ABySS v2.0.2拼接軟件對序列進(jìn)行拼接，使用GapCloser v1.12 軟件對組裝結(jié)果進(jìn)行局部填充和堿基校正?；蝾A(yù)測由GeneMarkS v4.6b 軟件進(jìn)行，將預(yù)測基因的蛋白序列分別與Nr Genes、eggNOG 和GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對，從而獲得預(yù)測基因的注釋信息。

1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用MLST Finder 2.0 用于多位點(diǎn)序列分型（MLST）［18］，對來自16 個(gè)大腸桿菌的7 個(gè)管家基因（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA）檢索并導(dǎo)出序列，使用MEGA7.0軟件進(jìn)行多序列比對、整理、對齊，再使用鄰接算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析樹，用Boot?strap重復(fù)抽樣1 000次驗(yàn)證。

、

1.2.3 細(xì)菌耐藥基因與毒力基因預(yù)測

為預(yù)測大腸桿菌J2_5 菌株中的耐藥基因和毒力基因，使用毒力因子數(shù)據(jù)庫（VFDB）（網(wǎng)址：http：//www.mgc.ac.cn/cgi?bin/VFs/v5/main.cgi?func=VFana?lyzer）檢測其毒力基因，使用抗生素耐藥性綜合數(shù)據(jù)庫（CARD）（網(wǎng)址：https：//card.mcmaster.ca/analyze/rgi）確定大腸桿菌J2_5菌株基因組序列中的抗生素抗性基因。

1.2.4 原噬菌體預(yù)測與分析

使用Prophage Hunter 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（網(wǎng)址：https：//pro?hunter.genomics.cn/）對大腸桿菌菌株J2_5 的全基因組進(jìn)行查詢，通過與已存入?yún)⒖紨?shù)據(jù)庫的元素比較檢測原噬菌體元素相似性，預(yù)測前噬菌體相關(guān)的區(qū)域。預(yù)測的前噬菌體活躍的概率由0到1的活動(dòng)分?jǐn)?shù)提供。

1.2.5 擴(kuò)增原噬菌體引物設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)測的原噬菌體基因序列，使用軟件Prim?er5.0設(shè)計(jì)引物序列，每個(gè)原噬菌體分別設(shè)計(jì)3對，設(shè)計(jì)的引物序列見表1。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in this study

PCR 反應(yīng)體系為20 μL，up、down 引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，去離子水7 μL，模板1 μL。擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃5 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察，記錄結(jié)果。引物合成和PCR產(chǎn)物測序均委托南京擎科生物科技公司完成，測序結(jié)果用BLAST進(jìn)行序列分析。

1.2.6 基因組登錄號

J2_5 全基因組序列已提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的SRA 數(shù)據(jù)庫，登錄號為：SRR18067191。

2 結(jié)果

2.1 基因組測序與組裝

使用Illumina?HiSeq 2000對J2_5菌株進(jìn)行全基因組測序，經(jīng)組裝和整合優(yōu)化，得到161個(gè)Scaffolds，J2_5基因組總長度為4 701 041 bp，GC含量為50.78%，N50長度為98 796 bp，N90長度為18 306 bp，最長的片段為294 915 bp，最短的片段為509 bp。使用GeneMarkS 軟件對J2_5 基因組進(jìn)行編碼基因預(yù)測，共得到4 609個(gè)編碼基因，總長度為4 131 945 bp，占基因組全長的87.90%，平均長度為896 bp。這些數(shù)據(jù)證明該次高通量測序的數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

2.2 J2_5菌株基因組功能注釋

通過將J2_5 菌株的基因序列與COG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到注釋結(jié)果后對蛋白功能進(jìn)行分類。如圖1所示，共有3 672個(gè)蛋白獲得COG功能注釋。其中，參與氨基酸運(yùn)輸與代謝（E，amino acid transport and metabolism）和碳水化合物運(yùn)輸和代謝（G，carbo?hydrate transport and metabolism）的蛋白含量最豐富，共占比例18.6%。參與能量產(chǎn)生和傳遞（C，ener?gy production and conversion）、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/包膜合成（M，cell wall/membrane/envelope biogenesis）、無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（P，inorganic ion transport and metabolism）、復(fù)制/重組/修復(fù)（L，replication，recombi?nation and repair）、轉(zhuǎn)錄（K，transcription）/翻譯/核糖體結(jié)構(gòu)和合成（J，translation，ribosomal structure and biogenesis）的蛋白占據(jù)較大比例，分別為8.4%、7.0%、6.9%、6.7%、5.3%、5.0%。

圖1 基于COG數(shù)據(jù)庫的E.coli J2_5基因注釋類別分布Figure 1 E.coli J2_5 gene annotation category distribution based on COG database

2.3 MLST分型

使用MLST Finder 2.0 多位點(diǎn)序列分型網(wǎng)上工具，提取了J2_5 全基因組序列中adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA等7 個(gè)基因的序列，與大腸桿菌MLST 分型數(shù)據(jù)比對，顯示J2_5 菌株ST 型為ST2491，與大腸桿菌MG1655 菌株ST 分型（ST10）不同。7 個(gè)管家基因序列中6 個(gè)基因序列沒有明顯變化，但是發(fā)現(xiàn)mdh基因發(fā)生了突變，基因座位號最接近mdh_7，與大腸桿菌BL21（DE3）最相似（表2）。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

為研究J2_5的詳細(xì)進(jìn)化史，根據(jù)BLAST 分析的結(jié)果，將J2_5基因組中的管家基因與從不同地區(qū)分離的16 株大腸桿菌的7個(gè)管家基因按照adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA的順序串聯(lián)后使用MEGA7程序繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）?；谙到y(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果發(fā)現(xiàn)，J2_5 與大腸桿菌MG1655、大腸桿菌BL21（DE3）親緣關(guān)系較近。以上表明J2_5是一株新的變異大腸桿菌菌株。

圖2 E.coli J2_5基于MLST分型的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 E.coli J2_5 phylogenetic tree based on MLST typing

2.5 耐藥基因預(yù)測

通過抗生素耐藥性綜合數(shù)據(jù)庫（CARD）對E.coliJ2_5 基因組進(jìn)行抗性基因識別。結(jié)果顯示，該菌基因組共有65個(gè)耐藥基因，可分別通過抗生素外排泵、抗生素失活、抗生素靶點(diǎn)改變、降低對抗生素的滲透性等4 類機(jī)制使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性（表3）。其中通過參與抗生素外排使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的基因有45 個(gè)，占比68%。主要為編碼抗性結(jié)節(jié)分化（RND）抗生素外排泵基因aceA等21個(gè)、編碼主要易化子超家族（MFS）抗生素外排泵基因mdtH等14個(gè)、編碼ATP 結(jié)合盒（ABC）抗生素外排泵Yojl等2個(gè)基因和編碼小型多藥耐藥（SMR）抗生素外排泵基因emrE。使抗生素通透性降低的基因有marA和soxS。改變抗生素靶點(diǎn)的基因有PmrF等15 個(gè)基因。使抗生素滅活的基因有ampH等9 個(gè)基因。與大腸桿菌MG1655 相比，J2_5 多編碼17 個(gè)耐藥基因，分別是改變抗生素靶點(diǎn)基因（dfrA17、GlpT、gyrA、parC、sul1、sul2）、抗生素外排基因［aceA、oqxA、oqxB、tet（A）、qacEdelta1］、抗生素滅活基因［AAC（3）?IV、mphA、aadA5、APH（4）?Ia、TEM?1、CTX?M?65］。

表3 E.coli J2_5耐藥基因分析結(jié)果Table 3 Analysis results of E.coli J2_5 drug resistance gene

在J2_5 基因組中發(fā)現(xiàn)的這些耐藥基因大部分使菌株能夠獲得對多種抗生素的耐藥性，它們分別編碼了絕大部分臨床常用抗生素耐藥性基因，包括氨基糖苷類抗性基因［acrD、cpxA、baeR、baeS、mdtB、aadA5、APH（4）?Ia、mdtC、mdtA、kdpE、AAC（3）?IV］、氟喹諾酮類抗性基因（mdtH、emrB、emrA、emrR、gy?rA、parC）、肽類抗性基因（Yojl、PmrF、bacA、eptA、ugd）、磷霉素抗性基因（mdtG、GlpT）、大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因（mphA、emrE）、四環(huán)素類抗性基因［tet（A）］、耐埃爾法霉素類抗性基因（EF?Tu）、甲氧芐啶類抗性基因（dfrA17）、磺胺類抗性基因（sul1、sul2）、核苷類抗性基因（mdtN、mdtP、mdtO）、β?內(nèi)酰胺酶抗性基因（ampH、ampC、ampC1、CTX?M?65、TEM?1）、硝基咪唑類抗性基因（msbA）。

2.6 毒力基因預(yù)測

將J2_5全基因組通過VFDB數(shù)據(jù)庫比對來搜尋毒力基因，最終共檢索到40 個(gè)毒力基因，包括黏附素、侵襲、自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、非LEE 編碼的TTSS 效應(yīng)子、分泌系統(tǒng)、生物膜形成、菌毛黏附?jīng)Q定因子等7類毒力基因。在E.coliJ2_5 所有毒力基因中，屬于黏附與侵襲類的毒力相關(guān)基因數(shù)量最多，包括編碼大腸桿菌共生菌毛（E.colicommon pilus，ECP）、CFA/I菌毛（CFA/I fimbriae）、Ⅰ型菌毛（type I fimbri?ae）、大腸桿菌層黏蛋白結(jié)合菌毛（E.colilaminin?binding fimbriae，ELF）、出血性大腸桿菌菌毛（hem?orrhagicE.colipilus，HCP）、腦內(nèi)皮細(xì)胞侵襲素（in?vasion of brain endothelial cells，Ibes）、P 菌毛（P fim?briae）的7 種25 個(gè)毒力基因。通過VFDB 數(shù)據(jù)庫對大腸桿菌MG1655 與J2_5 的毒力基因進(jìn)行比對，結(jié)果見圖3。在J2_5 中發(fā)現(xiàn)了一些在大腸桿菌MG1655中沒有的毒力因子，包括編碼P菌毛的基因（papA、papC、papD）、編碼CFA/I 菌毛的基因（cfaA、cfaB、cfaC、cafD/E）、編碼自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因（aa?tA、cah、cdiA）、編碼腦內(nèi)皮細(xì)胞侵襲基因（ibeB、ibeC）、編碼TTSS效應(yīng)器分泌系統(tǒng)基因（espL1、espL4、espR1、espX1、espX4、espX5）、編碼ACE T6SS 效應(yīng)器分泌系統(tǒng)基因aec15、編碼類似鼠疫耶爾森菌鞭毛的fliC基因、編碼與生物膜形成有關(guān)的adeG、及編碼菌毛黏附?jīng)Q定因子的pegB、stcC等。其中，adeG、pegB、stcC3 個(gè)編碼基因?yàn)镴2_5 菌株獨(dú)有，在其他大腸桿菌中（如E.coliO157：H7 str.EDL933、E.coliAPEC O1、E.coliCFT073等21株大腸桿菌）均未發(fā)現(xiàn)。

圖3 E.coli str.K?12 substr.MG1655 與E.coli J2_5 毒力因子比較Figure 3 Comparison of virulence factors in E.coli str.k?12 substr.MG1655 and E.coli J2_5

2.7 原噬菌體的預(yù)測及驗(yàn)證

本研究使用Prophage Hunter 噬菌體預(yù)測工具對大腸桿菌J2_5的基因組進(jìn)行BLAST搜索分析（表4），預(yù)測到J2_5基因組中存在3個(gè)前噬菌體（從上到下依次命名為YZ3、YZ24、YZ58），同時(shí)對大腸桿菌MG1655 基因組搜索分析，搜索到7 個(gè)前噬菌體。J2_5基因組與MG1655基因組上不存在相同的噬菌體相關(guān)區(qū)域。對J2_5 基因組上預(yù)測到的噬菌體相關(guān)區(qū)域進(jìn)行毒力基因檢測，在scaffold24區(qū)域只有1個(gè)編碼自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)毒力基因aatA。此外，本研究檢測了前噬菌體區(qū)域是否存在抗生素抗性相關(guān)基因，在3個(gè)前噬菌體區(qū)域中均未發(fā)現(xiàn)抗生素抗性相關(guān)基因。因此認(rèn)為，噬菌體不是大腸桿菌J2_5中抗生素抗性基因的載體，而是毒力相關(guān)基因的載體。

表4 E.coli MG1655與E.coli J2_5基因組原噬菌體比較Table 4 Comparison of E.coli MG1655 and E.coli J2_5 genomic prophages

使用設(shè)計(jì)的引物對預(yù)測的原噬菌體YZ3、YZ24、YZ58 編碼序列進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果如圖4 所示。從圖中可以看到引物3?1up/3?1down、3?2up/3?2down、3?3up/3?3down、24?1up/24?1down、24?2up/24?2down、24?3up/24?3down、58?1up/58?1down、58?2up/58?2down、58?3up/58?3down可以擴(kuò)增出J2_5基因組中原噬菌體DNA 上的目的條帶，且大小一致。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定，鑒定結(jié)果與J2_5基因組中相應(yīng)序列進(jìn)行比較，結(jié)果證實(shí)，擴(kuò)增出的序列的確是預(yù)測到的原噬菌體編碼序列。

圖4 對原噬菌體進(jìn)行PCR鑒定電泳圖譜Figure 4 Identification of prophage by PCR

3 討論

細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性的原因有多種，其中流行最廣的耐藥機(jī)制就是獲得性耐藥。大腸桿菌能夠積累AMR 基因，并將這些基因水平傳遞給其他物種［19］。耐藥基因在不同菌種間的快速水平傳遞會(huì)導(dǎo)致多重耐藥菌株、全耐藥菌株的大量出現(xiàn)，使得很多抗生素的療效不斷下降［20］，耐藥基因的攜帶和耐藥性產(chǎn)生及傳遞的機(jī)制成為臨床治療所重點(diǎn)關(guān)注的問題之一［21］。運(yùn)用高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析相結(jié)合，可以一次性得到整個(gè)細(xì)菌基因組的信息［22］，同時(shí)可檢出病原體型別、毒力基因和耐藥基因，該技術(shù)在微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域有重要應(yīng)用前景［23］，有助于耐藥菌感染的臨床診斷和治療，以及研究設(shè)計(jì)新的藥物和疫苗等。本研究新鑒定了一株臨床多耐藥大腸桿菌J2_5，通過高通量測序技術(shù)獲得了J2_5的全基因組序列。運(yùn)用多種生物信息學(xué)分析方法，對其編碼基因進(jìn)行了分析預(yù)測，得到基因注釋結(jié)果，共編碼4 609個(gè)基因。

MLST 是一種經(jīng)典的細(xì)菌基因分型技術(shù)，用于識別細(xì)菌不同克隆間的關(guān)系［24］，廣泛應(yīng)用于監(jiān)測爆發(fā)感染的病原菌［25］。隨著全基因組測序技術(shù)的發(fā)展，大量參考菌株的全基因組已被測序，例如已得到大腸桿菌MG1655 和導(dǎo)致腸道感染的致病菌株O157：H7的全基因組序列，另外還有至少20種大腸桿菌菌株的完整基因組序列已被測定［24，26］。已獲得的大腸桿菌全基因組序列中包括了7 個(gè)管家基因，基于確定所選管家基因序列和菌株的等位基因類型，使用MLST 網(wǎng)上工具就能直接獲得目標(biāo)菌株的序列類型（ST）［27］。此外，MLST 序列分型還能準(zhǔn)確地探索大腸桿菌物種的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)。本研究對大腸桿菌J2_5 進(jìn)行基因組測序后，得到7 個(gè)管家基因序列，分析序列類型，得到其ST 型為ST2491，并基于MLST 多位點(diǎn)序列分型，與16 株大腸桿菌構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，該菌與大腸桿菌MG1655和大腸桿菌BL21（DE3）親緣關(guān)系較近。

產(chǎn)生ESBL 的大腸桿菌菌株具有多重耐藥性，主要是因?yàn)镋SBL 耐藥基因通常由質(zhì)粒編碼，這些質(zhì)粒還攜帶其他抗生素抗性基因，如氨基糖苷類、氟喹諾酮類、氯霉素、磺胺類和四環(huán)素類耐藥基因［28］。對大腸桿菌J2_5的耐藥基因進(jìn)行預(yù)測，共發(fā)現(xiàn)65個(gè)耐藥基因，數(shù)量最多的為抗生素外排機(jī)制基因（占比68%）。外排機(jī)制的耐藥基因可產(chǎn)生對多種抗生素的耐藥，如marA基因編碼蛋白具有RND 外排泵功能，同時(shí)還能夠降低抗生素通透性；marR、acrR基因編碼蛋白參與RND 外排泵，同時(shí)還能夠改變抗生素靶點(diǎn)；evgA、evgS、H?NS編碼蛋白兼具RND、MFS 2 種外排泵功能；soxR、TolC編碼蛋白兼具ABC、RND、MFS 3 種外排泵功能；soxS編碼蛋白除了具有ABC、RND、MFS 3 種外排泵功能，同時(shí)還能夠降低抗生素通透性、改變抗生素靶點(diǎn)。這些表明大腸桿菌J2_5 一直處于高強(qiáng)度的抗生素選擇壓力之下，加速其產(chǎn)生抗生素耐藥性。已有報(bào)道，多種β?內(nèi)酰胺酶基因可以在同一分離物中共存，而CTX?M+TEM 類型占50%［29］。本研究中J2_5檢出攜帶有CTX?M?65、TEM?1 2種ESBL編碼基因，結(jié)果與報(bào)道一致。J2_5攜帶多種耐藥基因，提示臨床需要重視目前耐藥現(xiàn)狀，合理使用抗生素，盡可能降低ESBL耐藥菌的產(chǎn)生和傳播。

菌毛是腸外感染中的定植因素，與生物膜形成相關(guān)，如P 菌毛及其相關(guān)蛋白是腸外感染中的定植因子，能刺激T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子［30］。J2_5共攜帶40 個(gè)毒力基因，其中攜帶的P 菌毛相關(guān)基因（papA、papC、papD）可能是其產(chǎn)生致病性的主要因素之一。

原噬菌體是可移動(dòng)的遺傳元件，可以將抗生素抗性基因（ARG）［31］、毒力因子［32］等部分遺傳物質(zhì)傳遞給細(xì)菌宿主，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生遺傳多樣性和獲得新的毒力因子（如黏附素或毒素），進(jìn)而導(dǎo)致新病原體的出現(xiàn)［33］。本研究在J2_5 基因組中鑒定到了與大腸桿菌MG1655攜帶不同的前噬菌體。在噬菌體相關(guān)區(qū)域存在1 個(gè)毒力基因aatA，并且該噬菌體還攜帶有長度為278 bp的整合酶基因，提示該毒力基因可能通過可移動(dòng)遺傳元件在菌株間傳播。

綜上所述，本研究使用全基因組測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析技術(shù)，不僅深入分析了J2_5菌株的整體基因組成及蛋白功能，還發(fā)現(xiàn)了J2_5攜帶了大量耐藥基因及毒力基因，同時(shí)預(yù)測到J2_5攜帶前噬菌體這一可移動(dòng)遺傳元件。研究結(jié)果有利于全面認(rèn)識J2_5 基因組特征，為后續(xù)比較基因組學(xué)分析、原噬菌體誘導(dǎo)等相關(guān)研究提供了數(shù)據(jù)支持，同時(shí)對后續(xù)ESBL菌的臨床治療及防控具有重要意義。