紫草素通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥在腦外傷后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

朱海燕，趙曉晶，2，宋晶晶，張志遠(yuǎn)*，王曉亮

1南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，江蘇 南京 211166；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院病理科，江蘇 南京 211166；3南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京 210006

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是全球?qū)е職埣埠退劳龅闹饕蛑弧Ｈ蛎磕暧谐^(guò)5 000萬(wàn)人患有TBI，由于中國(guó)以及其他發(fā)展中國(guó)家近年來(lái)工業(yè)化進(jìn)程的高速發(fā)展，TBI 的發(fā)病率仍在每年上升［1］。TBI 的病理過(guò)程主要分為兩個(gè)階段：原發(fā)性腦損傷以及隨后的繼發(fā)性腦損傷。原發(fā)性腦損傷主要由機(jī)械外力引起腦組織直接損傷。最初的機(jī)械損傷可導(dǎo)致神經(jīng)元軸突損傷、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化以及血腦屏障（blood brain barrier，BBB）破壞。繼發(fā)性腦損傷的主要機(jī)制則涉及氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）和線粒體功能障礙等。機(jī)械損傷造成的細(xì)胞死亡無(wú)法真正避免，而由多種機(jī)制驅(qū)動(dòng)的繼發(fā)性腦損傷則可以通過(guò)后期治療進(jìn)行干預(yù)。因此現(xiàn)階段改善TBI預(yù)后的嘗試主要集中在減輕導(dǎo)致繼發(fā)性損傷惡化的分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)［2］。雖然TBI的病理生理學(xué)已經(jīng)得到了大量的研究［3-4］，但目前仍然缺乏有效的針對(duì)TBI的治療藥物。

TBI 后活性氧（reactive oxygen species，ROS）過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致的氧化應(yīng)激參與神經(jīng)元的凋亡。TBI后花生四烯酸的環(huán)氧酶途徑可產(chǎn)生大量的ROS，而由ROS引起的興奮性毒性作用導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，從而引起谷氨酸受體激活導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡［5］。因此，抗氧化應(yīng)激和控制神經(jīng)炎癥在治療TBI 也具有相當(dāng)?shù)臐摿Γ?］。不僅如此，小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)最重要的固有免疫細(xì)胞和主要的效應(yīng)細(xì)胞，在TBI后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。腦外傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，早期有助于清除壞死的細(xì)胞和促進(jìn)組織的修復(fù)，但是在TBI 后小膠質(zhì)持續(xù)的過(guò)度激活，釋放大量的炎性細(xì)胞因子并不利于TBI 的修復(fù)［7］。

中醫(yī)藥臨床療效確切、用藥相對(duì)安全、治療方式靈活，近年來(lái)得到了越來(lái)越廣泛的認(rèn)可［8］。紫草是一種臨床常用的中藥材，其廣泛的藥理與臨床作用備受關(guān)注。例如，紫草對(duì)肺結(jié)核合并血小板減少性紫癜效果明顯，紫草注射液可以治療急慢性肝炎［9］。除此之外，其在抗免疫缺陷以及清除活性氧等方面也有重要作用［10］。而紫草素是一種從紫草植物根中提取的萘醌化合物，其藥理作用如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗凋亡、促進(jìn)傷口愈合等，其臨床作用得到了深入的研究。先前的研究表明，紫草素通過(guò)抑制核因子（NF）?κB信號(hào)通路對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的乳腺炎發(fā)揮抗炎作用［11］。在心肌缺血再灌注損傷小鼠中，紫草素可提高超氧化物歧化酶（superoxide Dis?mutase，SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione per?oxidase，GPx）水平，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，減輕氧化應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用［12］。在腦缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型中，紫草素可通過(guò)抑制NF?κB的活性及降低p38MAPK的磷酸化負(fù)向調(diào)控腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）及基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）的表達(dá)，發(fā)揮抑制神經(jīng)炎癥和保護(hù)血腦屏障的作用［13］。綜上所述，紫草素可能針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)，氧化應(yīng)激損傷等有很好的保護(hù)作用。然而，紫草素在以上述神經(jīng)病理改變?yōu)樘卣鞯腡BI中的作用并無(wú)相關(guān)的研究。因此，本研究旨在闡明紫草素在TBI中的保護(hù)機(jī)制，為臨床治療TBI提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

從南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買8 周齡的C57/B6的雌性小鼠，保證小鼠適宜溫度和濕度的生存環(huán)境，光照明暗各12 h。小鼠可以自由獲得食物和水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批文編號(hào)：IACUC?2011010）。紫草素（Shikonin，上海陶素生化有限公司）；戊巴比妥鈉（Sigma?Aldrich公司，美國(guó)）；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；NLRP3 抗體，NeuN 抗體（Novus Biologicals 公司，美國(guó)）；Caspase1抗體，IL?1β抗體，ASC 抗體（Cell signaling technology公司，美國(guó)）；GAPDH 抗體，兔二抗，鼠二抗（南京Bioworld 公司）；Bax 抗體，Bcl2 抗體，Caspase3 抗體（北京Protein tech 公司）；伊文思藍(lán)染液（Sigma?Al?drich 公司，美國(guó)）；小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化物（lipid perox?ides，LPO）ELISA試劑盒，小鼠SOD活性ELISA試劑盒，GSH?Px/GPx 活性檢測(cè)試劑盒，小鼠ROS ELISA試劑盒（南京翼飛雪生物科技公司）；脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)試劑盒，細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建以及實(shí)驗(yàn)分組

將小鼠隨機(jī)分組為假手術(shù)組（Sham組），TBI模型組（TBI組），TBI+1 mg/kg紫草素組（TBI+SK 1 mg/kg組），TBI+5 mg/kg 紫草素組（TBI+SK 5 mg/kg 組）。對(duì)于腦外傷模型，基于先前的研究［14］，采取控制性皮質(zhì)撞擊程序。將小鼠置于立體定位儀上，剪開頭皮后，選用便攜式鉆機(jī)和3.5 mm的環(huán)鉆在右側(cè)頂顳皮層進(jìn)行開顱，并保證硬腦膜的完整性。緊接著，用直徑為3 mm 的凸起尖端以4.5 m/s 的速度產(chǎn)生1.2 mm 的凹陷，停留時(shí)間為20 ms，造成中度損傷。迅速縫合頭皮后將小鼠放回籠子。假手術(shù)進(jìn)行除不進(jìn)行撞擊外，接受了同樣的手術(shù)。所有小鼠均在接受手術(shù)后1 h 內(nèi)恢復(fù)意識(shí)。模型成功后，紫草素腹腔注射，連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè)

采用Beamwalk 平衡木實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能，滑足次數(shù)越多，表示運(yùn)動(dòng)功能損害越嚴(yán)重。

采用神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）來(lái)評(píng)估小鼠的神經(jīng)行為缺陷的嚴(yán)重程度。在小鼠腦外傷后24 h 檢測(cè)，總分18分。從運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡和反射能力四個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估。mNSS得分越高，說(shuō)明神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

1.2.3 伊文思藍(lán)染色

通過(guò)伊文思藍(lán)外滲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠血腦屏障的完整性和腦水腫程度。在小鼠造模后第7天進(jìn)行，尾靜脈注射100 μL的2%的伊文思藍(lán)溶液（4 mL/kg），2 h后觀察到小鼠的四肢及眼球結(jié)膜變藍(lán)，即注射成功。再用1%戊巴比妥鈉將小鼠麻醉，經(jīng)心臟灌注約20 mL的磷酸鹽緩沖液。取腦稱重，拍照，避光置于甲酰胺溶液中勻漿，然后置于60 ℃恒溫水浴孵育24 h，16 000g離心30 min，取上清。使用分光光度計(jì)檢測(cè)上清在620 nm處的光密度值。

1.2.4 免疫熒光和TUNEL染色

用上述同樣方式灌注取腦，置于福爾馬林溶液（90%水，10%甲醛）中24 h。在4 ℃30%的蔗糖溶液連續(xù)脫水3 d，每24 h 更換新的蔗糖溶液，保證腦組織充分脫水。包埋后將標(biāo)本切成10 μm厚度的冰凍切片。使用含有5%BSA（胎牛血清）的PBST 封閉1 h，加入一抗4 ℃過(guò)夜孵育，二抗室溫避光孵育2 h 后，滴加DAPI 封片劑封片，立即拍片或者置于4 ℃避光保存。TUNEL 染色先選用Tunel Bright?Green 凋亡檢測(cè)試劑盒（A112?01，南京諾維贊公司）檢測(cè)小鼠神經(jīng)元的凋亡水平，按照試劑盒說(shuō)明書先進(jìn)行TUNEL染色后再進(jìn)行同上操作的神經(jīng)元染色。切片使用共聚焦顯微鏡（Zeiss，LSM800）拍攝。

1.2.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

取小鼠大腦損傷皮質(zhì)區(qū)周圍水腫帶組織，約15 mg，置于1.5 mL 離心管后置于液氮中低溫速凍。用RIPA 裂解液裂解勻漿，再用BCA 蛋白定量后，用10%和15%的聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉溶液的封閉液封閉，孵育一抗、二抗后，用化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。GAPDH作為內(nèi)參，用Image J進(jìn)行分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT?PCR）檢測(cè)

取小鼠大腦損傷皮質(zhì)區(qū)周圍水腫帶組織，置于1.5 mL 離心管后置于液氮中低溫速凍。用TRIzol試劑（TaKaRa 公司，日本）對(duì)樣本進(jìn)行總RNA提取，再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾維贊公司）在42 ℃60 min，85 ℃5 s 條件下進(jìn)行cDNA 合成，用Light Cycler 96實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x器（Roche公司，瑞士）進(jìn)行cDNA擴(kuò)增?？偡磻?yīng)采用20 μL 體系：2 μL 引物、3 μL 超純水、5 μLcDNA、10 μL qPCR Master Mix（Without ROX）（南京諾維贊公司）在95 ℃10 s，60 ℃10 s，72 ℃20 s 條件下進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。同樣，GAPDH 作為內(nèi)參基因，mRNA的水平用相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCT進(jìn)行比較。引物如下：突觸素（SYP），上游5′?TTCAAG?GAGCTAACTAACGA?3′，下游3′? CGTCACGAAGT?CCAGCAAGA?5′；Bax，上游5′?TGAAGACAGGG?GCCTTTTTG?3′，下游3′?AATTCGCCGGAGACAC?TCG?5′；Bcl2，上游5′?GTCGCTACCGTCGTGACTTC?3′，下游3′?CAGACATGCACCTACCCAGC?5′；Cas?pase3 上游5′?ATGGAGAACAACAAAACCTCAGT?3′，下游3′?TTGCTCCCATGTATGGTCTTTAC?5′；GAPDH 上游5′?AGGTCGGTGTGAACGGATTTG?3′，下游3′?TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA?5′。

1.2.7 小鼠ROS、LPO和SOD活性檢測(cè)

取小鼠大腦損傷皮質(zhì)區(qū)周圍水腫帶組織，并置于100 μL的PBS溶液種。將組織充分勻漿后，參照小鼠ROS ELISA試劑盒、小鼠LPO ELISA試劑盒、小鼠SOD 活性ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以及實(shí)驗(yàn)操作。在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），樣品中ROS、LPO 和SOD 活性的濃度由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。

1.2.8 脂質(zhì)氧化檢測(cè)

采用脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)試劑盒測(cè)定小鼠腦中MDA 含量。取小鼠組織上清液100 μL，與MDA 檢測(cè)工作液200 μL混勻，并于100 ℃加熱15 min，冷卻至室溫后，取200 μL上清加入到96孔板中，在酶標(biāo)儀532 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD 值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MDA含量。

1.2.9 Neuro?2a細(xì)胞系和BV2細(xì)胞系培養(yǎng)以及干預(yù)

Neuro?2a 細(xì)胞系是小鼠來(lái)源神經(jīng)瘤母細(xì)胞，BV2細(xì)胞系是小鼠源性永生化的小膠質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞選用含10 %的胎牛血清和100 U/mL 的青霉素，0.1 mg/mL 的鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基在T75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。按照12 孔板每孔1×105，6 孔板1×106的密度進(jìn)行鋪板。鋪板后，隨機(jī)分為Control組，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）1 μg/mL 組，LPS+SK（0.3、1.0、3.0、10.0 μmol/L）組。LPS組：LPS刺激12 h；LPS+SK 組：在LPS 刺激12 h 后再給予不同濃度的紫草素（0.3、1.0、3.0、10.0 μmol/L）孵育30 min。處理結(jié)束后收細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.10 凋亡檢測(cè)

采用細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞Neuro?2a 細(xì)胞的凋亡情況。首先，將狀態(tài)良好的神經(jīng)元細(xì)胞Neuro?2a細(xì)胞系鋪板至12孔板，分為Control 組，LPS 1 μg/mL 組，LPS+SK 3 μmol/L 組，LPS+SK 10 μmol/L組，處理完成后，收集細(xì)胞至流式管中，1 000 r/min，5 min離心，棄上清，再用PBS清洗2 遍，避光加入1 mL Annexin Ⅴ?FITC 檢測(cè)工作液，室溫孵育10 min后，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每組實(shí)驗(yàn)均為3次以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素可改善小鼠腦外傷后神經(jīng)功能缺陷

如圖1A所示，采用控制性皮質(zhì)撞擊程序構(gòu)建小鼠腦損傷模型。采用激光多普勒監(jiān)測(cè)腦微循環(huán)系統(tǒng)的血液灌注量。打擊后，小鼠損傷區(qū)域立即出現(xiàn)血液灌注量減少（圖1B），提示造模成功。后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程如圖1C 所示。我們發(fā)現(xiàn)，TBI 后1、3、7、14 d，小鼠滑足次數(shù)都明顯增多。而紫草素處理7 d 以及14 d 后，低劑量（1 mg/kg）的改善效果不顯著，高劑量（5 mg/kg）下可以顯著減少滑足的次數(shù)，提示紫草素可以改善小鼠TBI 后的運(yùn)動(dòng)功能（P<0.05，圖1D～E）。此外，對(duì)小鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分，相對(duì)于1 mg/kg 低劑量的輕微改善效果，5 mg/kg 高劑量的紫草素顯著地改善了小鼠的神經(jīng)行為缺陷（P<0.05，圖1F）。既往研究表明，TBI 后神經(jīng)元大量丟失是造成腦外傷后認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能障礙的主要原因，所以我們進(jìn)一步檢測(cè)了神經(jīng)元丟失的情況。與對(duì)照組相比，TBI組損傷皮質(zhì)周圍水腫帶的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。同樣，高劑量紫草素（5 mg/kg）處理可以顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象（P<0.05，圖1G～H）?；诖耍韵聦?duì)組織的進(jìn)一步檢測(cè)和分析，均采用5 mg/kg高劑量組的動(dòng)物。SYP 作為腦內(nèi)突觸的特異性標(biāo)記，在TBI 后其mRNA 水平顯著降低，而紫草素處理后升高，提示了紫草素可以促進(jìn)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)完整性（P<0.05，圖1I）。為進(jìn)一步探究紫草素針對(duì)血腦屏障損傷的保護(hù)作用，采用伊文思藍(lán)滲透實(shí)驗(yàn)評(píng)估血腦屏障的完整性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫草素處理可以顯著改善TBI 后導(dǎo)致的血腦屏障的破壞（P<0.05，圖1J～K）。

圖1 紫草素對(duì)小鼠腦外傷后神經(jīng)功能的影響Figure 1 The effect of shikonin on neurological function after traumatic brain injury in mice

2.2 紫草素抑制小鼠腦外傷后的神經(jīng)元凋亡

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TBI 后小鼠皮質(zhì)損傷周圍水腫帶凋亡的神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，而紫草素治療后可以改善這一現(xiàn)象（圖2A、B）。為了進(jìn)一步探究紫草素對(duì)于腦外傷神經(jīng)元凋亡的改善作用，我們檢測(cè)了2 種重要的凋亡相關(guān)蛋白，即Bax 和Bcl2 的表達(dá)情況。TBI后Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl2的表達(dá)顯著下調(diào)，而紫草素可以促進(jìn)Bcl2的表達(dá)，并抑制Bax的表達(dá)（P<0.05，圖2C～E）。同時(shí)，TBI 后促進(jìn)了凋亡關(guān)鍵調(diào)控蛋白Caspase3以及剪切體p?Caspase3的表達(dá)，而紫草素處理后顯著抑制TBI 誘導(dǎo)的Caspase3的增加（P<0.05，圖2C、F）。平行的mRNA 水平的檢測(cè)也驗(yàn)證了上述的結(jié)果（P<0.05，圖2G～I(xiàn)）。依據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)研究，TBI 后持續(xù)的炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷的重要因素，我們采用LPS 刺激廣泛使用的神經(jīng)元細(xì)胞系N2a模擬TBI后的腦內(nèi)炎癥環(huán)境。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS 處理可以誘導(dǎo)N2a 細(xì)胞的凋亡增加，但是紫草素處理可以顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的存活（P<0.05，圖2J～K），提示紫草素在體外實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用。綜上，紫草素在腦外傷后對(duì)于神經(jīng)凋亡具有保護(hù)作用。

圖2 紫草素對(duì)小鼠腦外傷后神經(jīng)元凋亡的影響Figure 2 The effect of shikonin on neuronal apoptosis after traumatic brain injury in mice

2.3 紫草素改善腦外傷后的氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激指標(biāo)中，MDA是氧自由基水平的可靠指標(biāo)，而SOD 及GPx 是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的能力及清除活性氧的重要指標(biāo)。我們發(fā)現(xiàn)，TBI 后腦中的ROS 含量增多，紫草素處理可以逆轉(zhuǎn)這一改變（P<0.05，圖3A）。進(jìn)一步檢測(cè)氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA、LPO 和抗氧化酶活性SOD、GPx 的水平，如圖3B～C所示，TBI 后MDA、LPO 的水平顯著升高，抗氧化物酶水平降低，經(jīng)過(guò)紫草素處理后，這些過(guò)氧化物的升高得到顯著抑制（P<0.05）。相反，在經(jīng)過(guò)紫草素治療后，抗氧化酶的活性得到顯著的升高（P<0.05，圖3D～E）。SOD、硫氧還原蛋白2（Thioredoxin 2，TRX2）蛋白水平的表達(dá)也驗(yàn)證了上述結(jié)果（P<0.05，圖3F～H）。以上結(jié)果表明，紫草素可以促進(jìn)抗氧化劑的表達(dá)，中和升高的ROS，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，從而對(duì)神經(jīng)元凋亡具有保護(hù)作用。

圖3 紫草素對(duì)小鼠腦外傷后氧化應(yīng)激水平的影響Figure 3 The effect of shikonin on the level of oxidative stress after traumatic brain injury in mice

2.4 紫草素抑制腦外傷后NF?κB/NLRP3 炎癥通路的激活

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBI后炎癥水平顯著升高，損傷水腫帶小膠質(zhì)細(xì)胞激活并大量增殖，經(jīng)紫草素處理后，TBI 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化被顯著抑制（P<0.05，圖4A～B）。此外，紫草素可以顯著抑制TBI 后NF?κB 的升高，不僅如此，NLRP3/ASC/Caspase1/IL?1β炎癥信號(hào)通路也得到顯著的抑制（P<0.05，圖4C～D）。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞作為TBI后參與免疫炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，并且BV2細(xì)胞系作為研究中常用的小膠質(zhì)細(xì)胞系，在體外試驗(yàn)中我們選用LPS 作為第一信號(hào)，ATP 作為第二信號(hào)，刺激BV2 細(xì)胞系NLRP3 通路的激活，模擬TBI 體內(nèi)炎癥環(huán)境。結(jié)果顯示，紫草素可以顯著抑制BV2 細(xì)胞系的NLRP3 以及Caspase1 的表達(dá)，并有效地抑制炎癥反應(yīng)。以上證明紫草素可以通過(guò)抑制NF?κB/NLRP3 通路的激活，緩解TBI 后的神經(jīng)炎癥。

圖4 紫草素對(duì)小鼠腦外傷后NF?κB/NLRP3通路的影響Figure 4 The effect of shikonin on NF?κB/NLRP3 pathway after brain trauma in mice

3 討論

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)紫草素可抑制氧化應(yīng)激，神經(jīng)炎癥和減少神經(jīng)元凋亡，從而顯著改善創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)功能損傷。機(jī)制上，我們的研究結(jié)果提示，紫草素可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及NF?κB/NL?RP3 的激活，進(jìn)而改善創(chuàng)傷性腦損傷后的神經(jīng)炎癥及凋亡。

紫草素是紫草根中提取的主要生物活性成分，此前研究表明其具有抗癌、抗炎、促進(jìn)傷口愈合等多重藥理作用。在多種急性炎癥動(dòng)物模型中，紫草素被證實(shí)可通過(guò)減少炎癥因子的合成及分泌發(fā)揮抗炎作用。最新研究表明，紫草素可通過(guò)抗氧化應(yīng)激和抑制線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減輕H2O2誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞氧化損傷［15］。但目前尚無(wú)研究指出紫草素在創(chuàng)傷性顱腦損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

氧化應(yīng)激作為TBI 后主要的繼發(fā)性損傷機(jī)制，可以引起多種級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如炎癥和細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加速腦損傷［16］。腦外傷后ROS 過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致的氧化應(yīng)激參與神經(jīng)元的凋亡［16］。氧化應(yīng)激是由ROS（如單線態(tài)氧、過(guò)氧化氫、羥基自由基和超氧化物）產(chǎn)生和降解引起的，進(jìn)而導(dǎo)致氧化?抗氧化的失衡。在腦外傷發(fā)生后，抗氧化能力受限，無(wú)法及時(shí)清除產(chǎn)生的ROS，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化，抑制線粒體電子傳遞鏈，并切割DNA，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡［17］。因此，腦組織可能因過(guò)度氧化應(yīng)激而受損。MDA和LPO被認(rèn)為是脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)［18］。其水平在腦外傷后增加，紫草素處理后可以抑制MDA、LPO 水平的上調(diào)。此外，重要的抗氧化酶，包括SOD 和GPx，可以防止大腦氧化損傷［19］，其在腦損傷后表達(dá)降低，紫草素處理后升高。我們的研究結(jié)果提示，紫草素治療可提高TBI 后的SOD 和GPx 水平，降低MDA、LPO 水平，減輕腦外傷后的氧化應(yīng)激，對(duì)TBI具有保護(hù)作用。

NF?κB信號(hào)通路通過(guò)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄，在炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要作用［20］。在腦外傷后24 h內(nèi)，血腦屏障功能失調(diào)，循環(huán)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)受損的腦實(shí)質(zhì)，快速產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［21］。有證據(jù)表明，早期炎癥會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷并加重腦外傷［22］，這表明炎癥是繼發(fā)性腦外傷的重要介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，紫草素可以抑制TBI 誘導(dǎo)的NF?κB 的活化和促炎細(xì)胞因子的分泌，減輕TBI后的炎癥反應(yīng)。

TBI后持續(xù)的炎癥反應(yīng)會(huì)在腦中形成炎性微環(huán)境，并伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞活化和增殖，加重TBI的病理進(jìn)程［23］。有研究報(bào)道紫草素具有抑制NF?κB 的作用［24］，而NF?κB/NLRP3 通路是炎癥反應(yīng)的主要途徑。因此，本文猜測(cè)紫草素是否可以抑制TBI后NF?κB/NLRP3 通路激活。NLRP3 炎性小體作為NF?κB的下游介質(zhì)，以Caspase1 依賴性方式激活促炎細(xì)胞因子，包括IL?1β，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞死亡［25］，并在TBI后發(fā)揮重要作用。NLRP3 炎性小體是由多個(gè)蛋白組合而成的復(fù)合物，參與先天免疫反應(yīng)的識(shí)別受體家族的組成［26］，是炎癥反應(yīng)中的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，紫草素處理后可以抑制TBI 后的NLRP3 通路的激活。提示紫草素可以抑制NF?κB/NLRP3 通路激活，緩解炎癥，對(duì)TBI發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

眾所周知，細(xì)胞凋亡作為腦損傷后遲發(fā)性細(xì)胞死亡的主要方式［27］，繼發(fā)性腦損傷表現(xiàn)出特征性的神經(jīng)元凋亡［28］。而細(xì)胞凋亡依賴于Caspase3，通過(guò)外源性死亡受體或內(nèi)源性線粒體途徑的激活。Bax和Bcl2 等促凋亡和抗凋亡因子也參與細(xì)胞凋亡。研究證實(shí)，NLRP3炎性小體的激活，可促進(jìn)IL?1β和IL?18 的分泌［29］。這些細(xì)胞因子通過(guò)激活Bax 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，NF?κB的激活及其對(duì)NLRP3炎性小體的激活，炎性細(xì)胞因子的大量釋放，可以通過(guò)激活Bax，導(dǎo)致TBI小鼠的神經(jīng)元的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，在TBI 模型中Bax 表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl2 表達(dá)下調(diào)，紫草素處理可以抑制Bax的上調(diào)，促進(jìn)Bcl2的表達(dá)。并且，紫草素也可以抑制TBI 后Caspase3 剪切體水平的升高。提示紫草素可以抑制TBI后的神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，紫草素可以通過(guò)抗氧化應(yīng)激和抑制NF?κB/NLRP3 信號(hào)通路激活，以及減少神經(jīng)元的凋亡，在TBI 后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。為臨床上創(chuàng)傷性腦損傷的治療提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。但本研究仍然存在一些不足，如紫草素改善創(chuàng)傷性顱腦損傷的確切分子機(jī)制和特異性靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。