溴新斯的明舌下膜的制備及體內(nèi)外評(píng)價(jià)

王蓉玲，胡華勝，金牮*（.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 連云港 005；.江蘇諦奇醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 徐州 006）

藥物的臨床給藥途徑主要分為胃腸道給藥（如口服）和非胃腸道給藥（如注射、經(jīng)皮和吸入給藥等）。口服給藥由于攜帶及使用方便，不會(huì)給患者帶來生理性不適而具有較高的患者順應(yīng)性，但口服給藥后藥物在胃腸道存在溶解入血，再達(dá)到靶點(diǎn)起效的過程，起效較慢，因此對(duì)于一些難溶性藥物或急性疾病來說，口服給藥并不是最佳的給藥途徑。其次，由于胃腸道環(huán)境較為復(fù)雜，一些不耐酸堿的藥物進(jìn)入胃腸道后會(huì)出現(xiàn)顯著的降解現(xiàn)象或明顯的首過效應(yīng)，因此生物利用度較低[1]。注射給藥起效快，劑量準(zhǔn)確，但由于有創(chuàng)給藥方式會(huì)給患者帶來顯著的生理疼痛而具有較差的患者順應(yīng)性[2]。因此，對(duì)于一些口服生物利用度較差的藥物，開發(fā)一種無創(chuàng)的非胃腸道給藥方式具有非常顯著的臨床價(jià)值，口腔黏膜給藥則是這些無創(chuàng)的非胃腸道給藥途徑的一種，隨著新型聚合物及藥物傳遞技術(shù)的快速發(fā)展，如何安全有效地通過口腔黏膜途徑給藥而避免復(fù)雜的胃腸道環(huán)境受到了越來越多醫(yī)藥工作者的關(guān)注[3]。

溴新斯的明（neostigmine bromide，NB）是一種可逆性的抗膽堿酯酶藥，可抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）活性而發(fā)揮完全擬膽堿作用，對(duì)骨骼肌及胃腸道平滑肌興奮作用較強(qiáng)[4]，NB 還可用于對(duì)抗競(jìng)爭(zhēng)性神經(jīng)肌肉阻滯藥過量時(shí)的毒性反應(yīng)[5]，臨床主要用于治療重癥肌無力、急性腸梗阻及尿潴留等[6-9]，但本品口服難吸收且不規(guī)則，目前臨床應(yīng)用的主要為其注射劑型[9-10]，因注射給藥使用不方便，且會(huì)給患者帶來生理不適，因此，開發(fā)其無創(chuàng)非胃腸道給藥途徑具有極大的市場(chǎng)潛力。本研究旨在開發(fā)一種無創(chuàng)非胃腸道給藥的新斯的明新劑型，為新斯的明臨床用藥增加一種新的給藥劑型選擇的可能。

1 材料

溴新斯的明（damas-beta 公司）；羥丙甲纖維素（HPMC，湖州展望藥業(yè)有限公司）；聚乙二醇（PEG，山東優(yōu)索化工科技有限公司）；阿斯帕坦（貴州威門藥業(yè)股份有限公司）；依地酸二鈉（鄭州卓創(chuàng)化工產(chǎn)品有限公司）；聚山梨酯（遼寧奧克醫(yī)藥輔料股份有限公司）；二氧化鈦（GENERALREAGENT）；肝素（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份公司）；水為超純水；甲醇、乙腈、冰醋酸均為色譜純；其他試劑均為分析純。

XP-105 電子天平（瑞士梅特勒公司）；YP1002N 型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；FE20 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；FA-2020 型全數(shù)控小型涂膜機(jī)（弗安企業(yè)發(fā)展有限公司）；TK-20 垂直透皮儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；LC-20AD島津液相色譜儀（日本島津公司）；SOTAX AT7自動(dòng)溶出儀（瑞士力揚(yáng)公司）；Mixmate Vortex-Genie-2 G-560渦旋儀（VWR）；AL-104分析天平、XSC105DU 分析天平（梅特勒）；5417R/5810R 離心機(jī)（Eppendorf Scientific Industries）；Drict-Q5超純水機(jī)（Millipore）；YGC-16A 全自動(dòng)氮吹儀、YGC-6A 固相萃取儀（鄭州寶晶電子科技有限公司）；SDF-A 小型高速分散機(jī)（中達(dá)化工機(jī)械）。

2 方法

2.1 溴新斯的明的制備

將處方量的HPMC 分散至90 ℃的純化水中，攪拌溶解，得到無色透明狀溶液，冷卻至室溫后加入處方量的溴新斯的明、PEG、阿斯帕坦、依地酸二鈉、聚山梨酯、二氧化鈦，攪拌5 min；然后用高速分散機(jī)分散7 min（轉(zhuǎn)速為2000 r·min－1），得類白色乳狀溶液，超聲消泡后加入到連續(xù)式涂布機(jī)中連續(xù)涂膜，干燥后裁剪，得到15 mg/片的溴新斯的明舌下膜劑。

2.2 處方研究設(shè)計(jì)

在溴新斯的明舌下膜處方中，高分子成膜材料HPMC、增塑劑PEG 與成品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性密切相關(guān)，為了獲得理想的目標(biāo)處方，固定阿斯帕坦、依地酸二鈉、聚山梨酯、二氧化鈦的用量，以終產(chǎn)品拉伸強(qiáng)度、崩解時(shí)限、體外溶出速率、體外滲透速率為關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察HPMC、PEG 的用量對(duì)上述關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響。處方設(shè)計(jì)見表1。

表1 處方設(shè)計(jì)(單劑量/mg)Tab 1 Formulation design (single dose/mg)

2.3 崩解時(shí)限測(cè)定方法

取潔凈濾紙用純化水潤(rùn)濕后平鋪于潔凈的培養(yǎng)皿中，取1 片成品膜劑放置于上述潤(rùn)濕的濾紙表面，觀察并記錄成品膜劑全部崩解融化所需要的時(shí)間。

2.4 機(jī)械性能測(cè)定方法

取1片成品膜劑，用夾具夾住膜劑一端并固定，另一端用拉力器在垂直狀態(tài)下勻速拉伸直至膜劑斷裂。拉伸過程中拉力所達(dá)到的峰值即為拉伸強(qiáng)度（N），膜劑斷裂時(shí)兩夾具距離即為拉伸長(zhǎng)度（cm）。照下式計(jì)算膜劑的延伸率（%）：延伸率（%）＝（拉伸長(zhǎng)度－原始長(zhǎng)度）/原始長(zhǎng)度×100%。

2.5 體外溶出測(cè)定方法

2.5.1 溶出方法 采用2015年版《中國(guó)藥典》0931 第二法（漿法）考察各處方體外溶出行為。介質(zhì)為人工唾液（分別稱取氯化鈣0.2 g、氯化鈉0.5 g、氯化鉀0.8 g、磷酸氫二鉀0.5 g、磷酸二氫鉀0.5 g、HPMC 0.2 g，置1000 mL 量瓶，用純化水溶解搖勻，即得），介質(zhì)體積為500 mL，攪拌槳轉(zhuǎn)速為50 r·min－1，介質(zhì)溫度（37±0.5）℃，取樣時(shí)間點(diǎn)為1、3、5、8、10、15 min。

2.5.2 樣品制備 取各處方片劑12 片照擬訂溶出方法制備溶出液，溶出液過PVDF 針頭式濾膜（0.8 μm），取濾液作為供試品溶液；另精密稱取溴新斯的明適量，用人工唾液溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為0.03 mg·mL－1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.5.3 色譜條件及分析 色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 采用乙腈-20 mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液（磷酸調(diào)pH值至3.0）（10∶90）等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；柱溫為35 ℃；流速為1 mL·min－1；進(jìn)樣體積為10 μL。分別精密量取供試品和對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)藥物溶出量并繪制溶出曲線。

2.6 體外滲透率測(cè)定方法

采用Franz 模型評(píng)價(jià)自制溴新斯的明的體外穩(wěn)態(tài)滲透速率。豬口頰黏膜在組成、形態(tài)、通透屏障功能等特性與人體最為接近，因此選擇豬口頰黏膜作為溴新斯的明舌下膜的體外滲透研究模型。

2.6.1 豬口頰黏膜處理 將電休克的豬口頰小心取下，用pH 7.0 的PBS（取磷酸二氫鉀0.68 g，加0.l mol·L－1氫氧化鈉溶液29.l mL，用水稀釋至100 mL，即得）沖洗干凈，仔細(xì)去除黏膜下組織，分離出厚度約600 ～800 μm 的黏膜層，置于pH 7.0 的PBS 中備用。

2.6.2 評(píng)價(jià)模型 Franz 擴(kuò)散池（12 通道），藥物池為2 mL 人工唾液，接收池為pH 7.0 的PBS（10 mL）。整個(gè)裝置置于有磁力攪拌功能的37℃恒溫水浴鍋中，為避免封閉的接收池形成濃度梯度，在接收池中放置磁力攪拌子，轉(zhuǎn)速為300 r·min－1。

2.6.3 樣品制備 取各處方片劑12 片（規(guī)格：0.2 mg）分別置于藥物池，系統(tǒng)穩(wěn)定后開啟實(shí)驗(yàn)，分別于1、2、3、4、5、6、7 h 末取樣1 mL（同時(shí)補(bǔ)充等體積等溫的接收介質(zhì)），過PVDF 針頭式濾膜（0.25 μm），取濾液作為供試品溶液；另精密稱取溴新斯的明適量，用pH 7.0 的PBS 溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL－1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.6.4 測(cè)定分析 分別精密量取供試品和對(duì)照品溶液按“2.5.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)藥物單位面積的累積滲透量。

2.6.5 數(shù)據(jù)分析 以單位面積累積滲透量為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，獲得藥物累積滲透曲線，按以下公式計(jì)算藥物的穩(wěn)態(tài)滲透速率：P＝ΔQ/AΔt，式中：P為穩(wěn)態(tài)滲透速率，ΔQ為Δt時(shí)間內(nèi)累積透過黏膜的藥物量，A為藥物透過黏膜的有效面積。

2.7 大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

以自制溴新斯的明注射液（R1，規(guī)格：15 mg·mL－1）和市售溴新斯的明片（R2，規(guī)格：15 mg）為參照藥物，比較自制溴新斯的明舌下膜（T，規(guī)格：15 mg，處方F3）與參照藥物在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差異。

2.7.1 動(dòng)物 大鼠24 只，6 ～7 周，體質(zhì)量190 ～220 g（江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK（蘇）2020-0009]。

2.7.2 給藥方案 將大鼠隨機(jī)分為T 組、R1組、R2組3 組，每組8 只。給藥前，所有大鼠腹腔注射氯胺酮麻醉（30 mg·kg－1），麻醉后R1組大鼠靜脈注射自制溴新斯的明注射液1 mL，R2組大鼠灌胃給予溴新斯的明片，T 組大鼠舌下給予自制溴新斯的明舌下膜。各實(shí)驗(yàn)組給藥后分別于5、15、30、45 min 及1、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h 從大鼠眼底取血0.3 mL，將收集的血液樣品置于含肝素的離心管內(nèi)，離心10 min（5000 g）后收集血漿，收集的血漿保存于－70℃冰箱中備用。

2.7.3 色譜條件[11]PHENOMENON SCX C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為35℃；流動(dòng)相為0.5 mol·L－1磷酸二氫鈉（用磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.5）-乙腈（45∶55，V/V），等度洗脫；流速為1 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm。

2.7.4 線性關(guān)系考察 取溴新斯的明適量，用甲醇溶解并稀釋成1 mg·mL－1的儲(chǔ)備溶液。精密量取儲(chǔ)備溶液適量，用水稀釋成50 μg·mL－1的溴新斯的明溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液；另精密量取儲(chǔ)備溶液適量，用空白血漿稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.3、1、3、5、10、30、50 μg·mL－1的系列溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積作線性回歸，得回歸方程為A＝0.0306C＋0.079（R2＝0.9984），溴新斯的明在0.3 ～50 μg·mL－1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。血漿樣品中溴新斯的明的回收率為（79.84±3.52）%，定量限和檢測(cè)限分別為0.10、0.05 μg·mL－1。

2.7.5 樣品處理 移取血漿200 μL，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混合均勻后注入預(yù)先依次用0.5 mL 的5%甲醇冰醋酸溶液、0.5 mL 的甲醇溶液、0.5 mL的0.2 mol·L－1磷酸氫二鈉溶液（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至9）活化好的PHENOMENON 固相萃取柱（Strata-X-CW 33 u，10 mg·mL－1），先用1 mL 的0.2 mol·L－1磷酸氫二鈉溶液（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至9）-甲醇（90∶10，V/V）洗脫，棄去洗脫液，然后用1 mL 的5%甲醇冰醋酸溶液洗脫，收集洗脫液，洗脫液用氮?dú)饬鳎?0℃）吹干后，殘留物用100 μL流動(dòng)相溶解，渦漩混合后取20 μL 進(jìn)樣分析。

2.7.6 樣品測(cè)定及結(jié)果分析 記錄溴新斯的明的峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中溴新斯的明的濃度，用WinNonLin（6.3 版，Pharsight）按照房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 處方變量對(duì)樣品機(jī)械性能及崩解時(shí)限的影響

處方變量對(duì)樣品機(jī)械性能及崩解時(shí)限影響的測(cè)定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，HPMC 的用量對(duì)產(chǎn)品的拉伸強(qiáng)度有顯著影響，隨著HPMC 用量的增加，樣品的拉伸強(qiáng)度也增加；PEG 的用量對(duì)樣品的延伸率影響顯著，隨著PEG 用量的增加，樣品的延伸率也增加；在篩選量范圍內(nèi)，HPMC 及PEG 用量對(duì)樣品的崩解時(shí)限幾乎無影響。

表2 處方變量對(duì)樣品機(jī)械性能及崩解時(shí)限的影響(n ＝12)Tab 2 Effect of formulation variables on the mechanical property and disintegration time limit (n ＝12)

3.2 處方變量對(duì)樣品體外溶出的影響

處方變量對(duì)樣品體外溶出行為影響的測(cè)定結(jié)果見表3。在篩選量范圍內(nèi)，HPMC 及PEG 用量對(duì)樣品的體外溶出行為的影響可以忽略不計(jì)。

表3 處方變量對(duì)樣品體外溶出行為影響的考察結(jié)果(n ＝12)Tab 3 Effect of formulation variables on dissolution behavior of samples in vitro (n ＝12)

3.3 處方變量對(duì)樣品體外滲透速率的影響

處方變量對(duì)樣品體外滲透速率影響的測(cè)定結(jié)果見表4。結(jié)果表明，在篩選量范圍內(nèi)，HPMC比例越大，樣品的體外滲透速率越高；而PEG 對(duì)樣品整體的滲透速率幾乎無影響。

表4 處方變量對(duì)樣品體外滲透率影響的考察結(jié)果(n ＝12)Tab 4 Effect of formulation variables on the in vitro permeation rate of samples (n ＝12)

3.4 大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果

用WinNonLin（6.3 版，Pharsight）按照房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表5 及圖1。自制溴新斯的明舌下膜（處方F3）、溴新斯的明片的絕對(duì)生物利用度分別為91.76%、32.69%，表明與口服途徑相比，舌下給藥的生物利用度具有顯著優(yōu)勢(shì)。

圖1 溴新斯的明在大鼠體內(nèi)的平均濃度-時(shí)間曲線（n ＝24）Fig 1 Mean concentration-time curve of neostigmine bromide in the rats plasma after different routes of administration（n ＝24）

表5 溴新斯的明在大鼠體內(nèi)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s，n ＝24)Tab 5 Pharmacokinetics parameters in rats of neostigmine bromide(±s，n ＝24)

表5 溴新斯的明在大鼠體內(nèi)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s，n ＝24)Tab 5 Pharmacokinetics parameters in rats of neostigmine bromide(±s，n ＝24)

組別AUC（0 ～t）/（mg·h·L－1）AUC（0 ～∞）/（mg·h·L－1）Cmax/（mg·L－1）tmax/hF/%T 組16.22±0.51 16.58±0.62 2.41±0.05 2.00±0.12 91.76 R1 組17.83±0.52 18.07±0.67 5.35±0.07 0.75±0.24/R2 組 5.63±0.38 5.91±0.35 0.56±0.02 4.00±0.19 32.69

4 討論

口腔黏膜由于未角質(zhì)化，且血管密集，血流豐富，藥物在溶解后能快速透過黏膜進(jìn)入血液循環(huán)而發(fā)揮療效，使用過程中不需要額外輔助且不會(huì)給患者帶來生理性不適，因此口腔黏膜給藥越來越受到患者歡迎[12]。

溴新斯的明臨床用途廣泛，屬于臨床一線急救用藥，目前臨床劑型為注射劑和口服片劑，患者選擇性較少，開發(fā)其新劑型具有顯著的臨床價(jià)值。本研究開發(fā)了一種溴新斯的明的舌下膜劑型，采用HPMC 作為成膜材料，PEG 作為增塑劑，另外處方中還加入矯味劑、遮光劑、穩(wěn)定劑等功能性輔料，在制備過程中，使用高速分散機(jī)使藥物和輔料分散均勻，保證了成品含量的均一性，檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)處方中HPMC 和 PEG 的比例為50∶9 時(shí)（F3），所制備的膜劑的機(jī)械性能、體外溶出行為以及體外穩(wěn)態(tài)滲透速率最佳。采用處方F3 制備溴新斯的明舌下膜劑，并與溴新斯的明注射劑和片劑開展大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究，結(jié)果自制溴新斯的明舌下膜（處方F3）、溴新斯的明片的絕對(duì)生物利用度分別為91.76%、32.69%，表明舌下給藥較口服給藥具有顯著的生物利用度優(yōu)勢(shì)，能極大減少非胃腸道給藥劑量，降低不良反應(yīng)，同時(shí)舌下途徑這種無創(chuàng)給藥方式亦能極大提高患者的用藥依從性。