木奶果種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構(gòu)建

周彩霞，羅培四，孔方南，蔣娟娟，卓福昌，李文硯，周 婧，韋 優(yōu)

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西崇左 532415）

0 引言

【研究意義】木奶果（Lour.）為大戟科、木奶果屬常綠喬木，產(chǎn)于廣東、海南、廣西和云南，生于海拔100~1300 m的山地林中，在印度、緬甸、泰國(guó)、越南、老撾、柬埔寨和馬來(lái)西亞等地區(qū)也有分布（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1994），是一種集食用、藥用和觀(guān)賞為一體的熱帶特色優(yōu)稀果樹(shù)（劉明生，2003；徐靜等，2007a，2007b；羅培四等，2014）。我國(guó)木奶果種質(zhì)資源豐富，但尚無(wú)商業(yè)化優(yōu)良品種，多以野生半野生狀態(tài)分布（林書(shū)生和羅志文，2013；羅浩城等，2017）。因此，明確木奶果種質(zhì)資源遺傳多樣性，探討其親緣關(guān)系，初步構(gòu)建DNA指紋圖譜，對(duì)木奶果種質(zhì)資源的保存、鑒定及優(yōu)異品種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，關(guān)于木奶果的研究報(bào)道大多為藥用價(jià)值分析（Hos‐sain，2017；Nesa et al.，2018；Kumar et al.，2018；鄭曉燕等，2018）、成分測(cè)定和提取工藝（李文硯等，2015；鄧浩等，2016；郭馨欣等，2019）、生理抗性（Bai et al.，2012；Wen et al.，2016）、種質(zhì)繁育（羅培四，2017；廖美蘭等，2020）以及優(yōu)良單株篩選（羅培四等，2014；陳國(guó)德等，2019）等。國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用分子標(biāo)記對(duì)木奶果進(jìn)行遺傳學(xué)相關(guān)研究的報(bào)道均較少，羅培四（2017）運(yùn)用SCoT分子標(biāo)記對(duì)37份來(lái)自廣西、廣東、海南和云南的木奶果種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析分析，結(jié)果顯示37份種質(zhì)在9條SCoT引物中擴(kuò)增獲得109個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)率為86.24%，表明SCoT分子標(biāo)記可應(yīng)用于木奶果的遺傳多樣性分析，且在木奶果鑒定中具有一定的潛力；Chik‐mawati（2019）通過(guò)ISSR標(biāo)記對(duì)木奶果同屬的另一個(gè)種（）進(jìn)行了遺傳多樣性及種群結(jié)構(gòu)分析。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（Start codon tar‐geted polymorphism，SCoT）分子標(biāo)記是一種基于單引物擴(kuò)增目的基因的共顯性中性分子標(biāo)記方法，與傳統(tǒng)的分子標(biāo)記相比，其能有效產(chǎn)生與性狀連鎖的標(biāo)記，是一種能跟蹤性狀的新型分子標(biāo)記，最早由Collard和Mackill（2009）提出并在水稻上應(yīng)用，因其重復(fù)性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、成本較低、引物通用、多態(tài)性高、遺傳信息豐富等優(yōu)點(diǎn)（龍治堅(jiān)，2015）被廣泛用于植物資源的研究，如割手密（羅霆等，2013）、芥菜（林清等，2013）、番木瓜（楊祥燕等，2013）、鴨茅（蔣林峰等，2014）、枸杞（查美琴等，2016）、皂莢（張安世等，2017a）、獼猴桃（張安世等，2017b）、柑橘（韓國(guó)輝等，2019）、楊桃（歐景莉等，2019）、地黃（楊珂等，2019）等種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系研究及指紋圖譜構(gòu)建等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然羅培四（2017）已采用過(guò)SCoT分子標(biāo)記對(duì)部分木奶果種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，但涉及到的種質(zhì)資源份數(shù)較少，且未構(gòu)建DNA指紋圖譜的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用SCoT分子標(biāo)記對(duì)63份木奶果種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選出多態(tài)性較高的引物并構(gòu)建木奶果DNA指紋圖譜，以期為木奶果種質(zhì)資源的分類(lèi)鑒定、保存和利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的63份木奶果種質(zhì)資源是由本研究課題組從廣西、云南、海南和廣東收集而來(lái)的野生或半野生種質(zhì)（表1），地理位置為100°47′E~110°02′E，18°04′N(xiāo)~23°06′N(xiāo)，海拔18~1119 m，現(xiàn)嫁接保存于廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所的木奶果種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)。主要試劑：MiniBEST Plant Genomic DNA Extrac‐tion Kit試劑盒、TaKaRaDNA聚合酶以及dNTP Mixture均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；其他生化試劑及引物均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設(shè)備：梯度PCR儀（Easy Cycler，德國(guó)AnalytikJena）、全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)（5200Multi，上海天能科技有限公司）、臺(tái)式冷凍離心機(jī)（5430R，德國(guó)Eppendorf）和電泳儀（DYCZ-20G，北京六一生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及檢測(cè) 采用MiniBEST植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，并取1.0 μL DNA樣品用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（電壓為120V，30 min），將DNA濃度稀釋至10 ng/μL，于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 引物篩選及SCoT-PCR擴(kuò)增 從供試材料中選取地理位置相差較遠(yuǎn)的3個(gè)供試材料（種質(zhì)編號(hào)為33、45和61號(hào)），分別以三者DNA樣品為模板對(duì)75條SCoT引物（Collard and Mackill，2009；羅聰，2012）進(jìn)行篩選，選出條帶清晰、重復(fù)性好和多態(tài)性豐富的6條SCoT引物（表2）用于本研究。SCoT-PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer（Mgplus）2.50 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 0.50 μL，25 mmol/L MgCl2.0 μL，5 U/μLDNA聚合酶0.13 μL，10 μmol/L SCoT引物1.00 μL，10 ng/μL DNA模板5.00 μL，ddHO補(bǔ)足至25.00 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃50 s，50 ℃1 min，72 ℃2 min，共進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，隨后銀染顯影。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 利用WPS進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)，多肽性信息量（Polymorphic information content，PIC）計(jì)算公式為：

其中，為基因座位上第等位基因的頻率（段艷鳳等，2009）。利用Popgene 1.32計(jì)算等位基因數(shù)（Observed number of alleles，）、有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，）、Shannon’s信息指數(shù)（Shannon’s information index，）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（Nei’s gene diversity，）。利用NTsys 2.10e的非加權(quán)配對(duì)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類(lèi)分析。參考聶新輝等（2014）的方法略作修改，將引物在樣品中擴(kuò)增得到的（0，1）數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為十六進(jìn)制數(shù)據(jù)，該十六進(jìn)制數(shù)據(jù)代表每個(gè)引物的擴(kuò)增結(jié)果，利用篩選出的引物組合十六進(jìn)制數(shù)字串作為供試種質(zhì)資源的數(shù)字指紋。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

利用篩選出的6條SCoT引物從63份木奶果種質(zhì)資源中共擴(kuò)增出192條條帶（表3），其中多態(tài)性條帶188條，多態(tài)性比率為97.86%；每條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為26~36條，平均為32條，多態(tài)性條帶數(shù)為26~36條，平均每條引物可擴(kuò)增出31.33條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為90.00%~100.00%；PIC為0.9052~0.9527，平均為0.9319，為0.2459~0.3878，平均為0.3238；'為0.1476~0.2412，平均為0.1984；為1.9000~2.0000，平均為1.9786；為1.2324~1.3700，平均為1.3052，說(shuō)明所篩選的6條SCoT引物的多態(tài)性檢測(cè)效率較高，適用于木奶果種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建，從而實(shí)現(xiàn)種質(zhì)鑒定。

2.2 遺傳相似性及聚類(lèi)分析結(jié)果

利用NTsys 2.10e計(jì)算63份木奶果種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)，結(jié)果表明供試材料間的遺傳相似系數(shù)為0.5781~0.9115，平均為0.7496，變幅為0.3334。其中，親緣關(guān)系最近的是來(lái)自廣西的2號(hào)與3號(hào)種質(zhì)，以及來(lái)自海南的59號(hào)與61號(hào)種質(zhì)，遺傳相似系數(shù)最大，為0.9115；親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是來(lái)自廣西的32號(hào)種質(zhì)和來(lái)自海南的59號(hào)種質(zhì)，遺傳相似系數(shù)最小，為0.5781。綜上所述，親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近或與種質(zhì)的來(lái)源具有一定的相關(guān)性，即來(lái)自同一地區(qū)的種質(zhì)遺傳相似度更高，親緣關(guān)系更近，而來(lái)自不同地區(qū)的種質(zhì)親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。

UPGMA法聚類(lèi)分析結(jié)果（圖2）顯示，63份木奶果種質(zhì)資源在遺傳相似系數(shù)0.7100時(shí)可分成5組（A~E），其中A組包含1份來(lái)自廣西龍州縣的種質(zhì)（編號(hào)39）和1份來(lái)自廣西大新縣的種質(zhì)（編號(hào)32）；B組為1份來(lái)自廣西大新縣的種質(zhì)（編號(hào)12）；C組為2份來(lái)自云南景洪市的資源（編號(hào)42和45）和2份來(lái)自云南江城縣的種質(zhì)（編號(hào)46和49）；D組為6份來(lái)自海南和廣東的全部種質(zhì)（編號(hào)58~63）；E組為剩余的50份種質(zhì)。

2.3 DNA指紋圖譜初步構(gòu)建結(jié)果

6條SCoT引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶存在明顯差異，說(shuō)明其區(qū)分種質(zhì)資源的種類(lèi)和數(shù)量也各不相同。單條引物可區(qū)分的種質(zhì)份數(shù)為49~63份，平均為58份。其中，引物SCoT32可擴(kuò)增出30條多態(tài)性條帶，且能單獨(dú)將供試的63份種質(zhì)資源全部區(qū)分開(kāi)；其他引物均需兩兩組合才能將供試的種質(zhì)資源全部區(qū)分開(kāi)，如引物SCoT49與引物SCoT66組合、引物SCoT49與引物SCoT74組合、引物SCoT66與引物SCoT68組合、引物SCoT66與引物SCoT74組合、引物SCoT68與引物SCoT74組合、引物SCoT73與引物SCoT74組合。

6條SCoT引物對(duì)63份木奶果種質(zhì)資源的擴(kuò)增結(jié)果顯示，有13份種質(zhì)資源具有特征引物，即僅用一條引物就能區(qū)分該種質(zhì)與其他種質(zhì)。其中，11、13、17、20、25、28、39、40、52和53號(hào)種質(zhì)均各有1條特征引物，23、49和50號(hào)種質(zhì)分別有2條特征引物。在供試的6條SCoT引物中，除了引物SCoT49無(wú)特征譜帶，其余5條引物均有特征譜帶，且一共產(chǎn)生了16條特征譜帶（表4加粗部分為含有特征譜帶的十六進(jìn)制數(shù)），說(shuō)明這5條引物可有效用于木奶果指紋圖譜的構(gòu)建。

綜合考慮引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)、重復(fù)性以及鑒別種質(zhì)資源的能力等因素，從篩選出的6條SCoT引物中進(jìn)一步篩選出5條SCoT引物用于木奶果種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜構(gòu)建，以十六進(jìn)制數(shù)代表相應(yīng)引物下擴(kuò)增的（0，1）數(shù)據(jù)（表4）。

3 討論

多態(tài)性是評(píng)價(jià)分子標(biāo)記的重要依據(jù)，而評(píng)價(jià)分子標(biāo)記多態(tài)性的主要參數(shù)包括DNA擴(kuò)增的總位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性比率、、、PIC等（楊祥燕等，2013；張安世等，2017a，2017b；李瓊等，2021）。本研究篩選出的6條SCoT引物對(duì)63份木奶果種質(zhì)資源共擴(kuò)增出192個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)188個(gè)，多態(tài)性比率達(dá)97.86%，為0.1476~0.2412，平均為0.1984，為0.2459~0.3878，平均為0.3238，平均每條引物的PIC達(dá)0.9319，遠(yuǎn)大于0.5000，說(shuō)明篩選出的6條SCoT引物在木奶果種質(zhì)資源中具有較高的多態(tài)性，可將其用于木奶果種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、DNA圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定及基因定位等工作。

種質(zhì)資源是遺傳育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，遺傳多樣性水平代表了該物種在特定環(huán)境中基因的豐富程度（查美琴等，2016），了解種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，對(duì)親本選配具有重要意義。從分子水平上來(lái)說(shuō)，遺傳相似系數(shù)越小，變幅越大，則表明該物種的遺傳分化越大，遺傳多樣性越高，遺傳背景也就越復(fù)雜（苗晗等，2014）。在本研究中，供試的63份木奶果種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)為0.5781~0.9115，變幅為0.3334，大部分種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)為0.7100~0.7900，占比達(dá)63.08%，說(shuō)明這63份種質(zhì)的遺傳背景較寬且遺傳多樣性十分豐富；聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，供試的種質(zhì)在遺傳系數(shù)為0.7100時(shí)可分為5組，呈現(xiàn)出一定的地域差異，少數(shù)相同地理來(lái)源的種質(zhì)親緣關(guān)系較近，但還有大部分不同地區(qū)的種質(zhì)相互混雜，可能是受人類(lèi)的生產(chǎn)活動(dòng)以及環(huán)境氣候因素影響所致（Chikmawati，2019）。同時(shí)，本研究供試種質(zhì)材料地域來(lái)源不夠豐富，廣西的種質(zhì)39份、云南的種質(zhì)18份、海南的種質(zhì)5份、廣東的種質(zhì)僅有1份，且均為海拔1119 m以下的地區(qū)，未能完全覆蓋木奶果分布的地區(qū)，在今后的種質(zhì)資源收集過(guò)程中可適當(dāng)?shù)赝貙捠占秶?，以擴(kuò)充木奶果的種質(zhì)庫(kù)；從聚類(lèi)分析結(jié)果可看出，來(lái)自廣西的2號(hào)種質(zhì)（PDong2）和3號(hào)種質(zhì)（PDong6）、來(lái)自海南的59號(hào)種質(zhì)（MG2）和61號(hào)種質(zhì)（NW2）的親緣關(guān)系十分相近，遺傳相似系數(shù)均為0.9115，說(shuō)明供試材料中可能存在一部分冗余的種質(zhì)資源，可能會(huì)影響到整個(gè)種質(zhì)資源群體的遺傳多樣性，但由于現(xiàn)保存的種質(zhì)僅為1~2年生的嫁接苗，尚未開(kāi)花結(jié)果，未能對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)地形態(tài)學(xué)觀(guān)察。在今后的研究中，可結(jié)合形態(tài)標(biāo)記對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行適當(dāng)?shù)靥蕹?，篩選出具有代表性的種質(zhì)，構(gòu)建核心種質(zhì)群體，為木奶果種質(zhì)資源的科學(xué)保存和開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

DNA指紋圖譜出現(xiàn)在20世紀(jì)80年代，是指DNA樣品經(jīng)特定的分子標(biāo)記技術(shù)處理所顯示出具有特定DNA片段的總稱(chēng)（Vos et al.，1995），是鑒定個(gè)體身份的精確方法，在法醫(yī)學(xué)、親子鑒定及移民身份確定等方面得到廣泛應(yīng)用（郭曉強(qiáng)和馮志霞，2008）。國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV）已將DNA標(biāo)記的鑒定納入農(nóng)作物品種DUS測(cè)試內(nèi)容，我國(guó)也將DNA指紋圖譜鑒定作為品種質(zhì)量監(jiān)控的重要措施之一（苗晗等，2014）。與傳統(tǒng)的種質(zhì)鑒定分類(lèi)方法相比，DNA指紋圖譜能準(zhǔn)確、快速地揭示植物種質(zhì)間的遺傳差異，在品種鑒定、品種注冊(cè)、分辨真假雜種及知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等方面具有重要的作用（楊祥燕等，2013）。DNA指紋分析的方法主要有特征譜帶法、引物組合法和核心引物組合法（王鳳格等，2003；王輝麗等，2022）。本研究中，引物SCoT32、SCoT66、SCoT68、SCoT73和SCoT74均可擴(kuò)增特征譜帶，能單獨(dú)將某份種質(zhì)從供試的63份種質(zhì)資源中區(qū)分出來(lái)，其中，引物SCoT32雖然只有一條特征譜帶，但僅通過(guò)引物SCoT32就能將所有供試材料區(qū)分開(kāi)來(lái)，說(shuō)明引物SCoT32可作為鑒別木奶果種質(zhì)資源的核心引物。隨著收集種質(zhì)數(shù)量的不斷增多，種質(zhì)間的親緣關(guān)系可能會(huì)更近，差異更小，引物SCoT32的鑒別能力可能會(huì)漸漸減弱，這時(shí)就需要增加新的引物對(duì)種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物SCoT66、SCoT68、SCoT73和SCoT74通過(guò)兩兩組合的方式也能將供試的63份種質(zhì)資源全部區(qū)分開(kāi)，表明利用篩選出的5條引物組合初步構(gòu)建木奶果種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜具有一定的合理性，在今后的木奶果種質(zhì)資源鑒定和DNA指紋圖譜構(gòu)建工作中可優(yōu)先考慮以上5條引物。本研究?jī)H僅運(yùn)用SCoT分子標(biāo)記對(duì)63份木奶果種質(zhì)資源進(jìn)行初步分析，今后仍需結(jié)合多種分子標(biāo)記以及形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、同工酶等方法進(jìn)行深入探討，為木奶果種質(zhì)資源的分類(lèi)鑒定、保存利用以及篩選核心種質(zhì)等工作提供更科學(xué)可靠的依據(jù)；同時(shí)，也需要制定更完善的木奶果種質(zhì)資源評(píng)價(jià)體系，將種質(zhì)資源收集范圍擴(kuò)大到國(guó)內(nèi)更多地區(qū)以及印度、緬甸等國(guó)外地區(qū)，做到應(yīng)保盡保，建立木奶果核心種質(zhì)資源圃。

4 結(jié)論

供試的63份木奶果種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，種質(zhì)間的親緣關(guān)系與地域有一定的相關(guān)性。所篩選的6條SCoT引物具有較強(qiáng)的多態(tài)性，適用于木奶果種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)鑒定、遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建等研究。