香蕉果實MAPs測定方法的建立及其含量變化規(guī)律研究

董 濤，孫陳康，馬兆成，竇同心，高慧君，易干軍*

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣東廣州 510640；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，湖北武漢 430070）

0 引言

【研究意義】香蕉是一種常見的水果，同時也是重要的糧食作物，其氣味芬芳、甘甜爽口、肉軟滑膩，深受人們喜愛（Pino and Febles，2013）。前人研究表明，香蕉果實中富含血清素、色氨酸、左旋多巴、兒茶酚胺等多種單胺類及其前體物質(zhì)（Monoamines and their precursors，MAPs），具有抗氧化、抗抑郁等多種藥用和保健功能，有極高的研究與應(yīng)用價值（Volkow et al.，2012；洪佳敏等，2016；Singh et al.，2016；Szeitz and Bandiera，2018；Zhao et al.，2019）。因此，建立一種特異、準確、快速檢測香蕉果實MAPs的方法，明確香蕉果實發(fā)育過程中MAPs各組分的含量變化規(guī)律，對深入研究其在果實不同發(fā)育階段的積累特點與形成代謝機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】MAPs包括單胺類物質(zhì)血清素（Serotonin，SERO）、多巴胺（Dopamine，DA）、去甲腎上腺素（Norepineph‐rine，NE）、腎上腺素（Adrenaline），以及其前體物質(zhì)色氨酸（Tryptophan，Trp）、色胺（Tryptamine，TRM）、5-羥色氨酸（5-hydroxy-tryptophan，5-HTP）、酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、酪胺（Tyramine，TYRA）、左旋多巴（Levodopa，L-dopa）等（Hornykiewicz，2010；Mauro et al.，2013；Zhang et al.，2019；Hu et al.，2020）。以往文獻中關(guān)于香蕉果實中MAPs含量檢測的研究不多。1958年，香蕉果肉和果皮中被檢測到DA、SERO、NE和5-HTP，這是首次在香蕉中檢測到MAPs的存在（Anderson et al.，1958；Waalkes et al.，1958）。Kanazawa和Sakakibara（2000）對催熟期間Cavendish香蕉果實的DA、L-dopa、NE和抗壞血酸等多種具有抗氧化活性的化合物進行分離，同時對抗氧化物質(zhì)進行定量，發(fā)現(xiàn)了一種抗氧化活性很強的水溶性物質(zhì)DA，果肉中DA含量達2.5~10 mg/100 g。González-Montelongo等（2010）研究表明，用各種溶劑純?nèi)芤夯蚱渌芤航嵯憬镀?，提取物中能鑒定出DA和Ldopa，且不同的溶劑浸提能獲得不同的DA和L-dopa提取率。SERO及其前體物質(zhì)Trp和TRM存在于多種果蔬中，日本研究人員對38種常見果蔬中SERO、Trp和TRM含量進行定量分析，結(jié)果顯示，香蕉、獼猴桃、鳳梨、鱷梨、番茄和土豆中SERO和Trp含量較其他果蔬高（Islam et al.，2016）。核桃也含有較豐富的Trp和SERO（Schr?der et al.，1999）。Borges等（2019）挑選了20個香牙蕉和大蕉品種進行催熟處理，選擇3個催熟時期（綠熟期、黃熟期和完熟期）進行DA、L-dopa、TYRA和SERO等8種生物胺含量的檢測，結(jié)果表明DA、L-dopa、TYRA和SERO含量在果實催熟過程中呈下降趨勢，同時研究不同處理工序?qū)麑嵵猩锘钚园泛康挠绊?，發(fā)現(xiàn)帶皮水煮后煮食蕉Pelipita果肉中DA、NE、精胺和亞精胺含量均有所提升?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內(nèi)外有關(guān)香蕉果實發(fā)育過程中MAPs含量變化規(guī)律的研究未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以目前國內(nèi)主栽的巴西香蕉（AAAcv.Baxi）、粉雜1號粉蕉（ABB group，F(xiàn)enza 1）和東莞大蕉（ABB group，Dongguan Dajiao）為研究對象，建立一種特異、準確、快速測定香蕉果實MAPs的方法，利用該方法系統(tǒng)地探討香蕉果實發(fā)育過程中MAPs的積累和變化規(guī)律，以期為進一步研究其合成與代謝機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為巴西香蕉、粉雜1號粉蕉和東莞大蕉3個栽培品種發(fā)育過程中的香蕉果實，種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所增城實驗基地，果園生長環(huán)境條件和水肥管理均一致。選取生長健壯且長勢一致、無病蟲害的3個香蕉品種植株各30株。使用的所有試劑和藥品均為色譜級，NE、DA、L-dopa、TYRA、Tyr、SERO、TRM和Trp標準品購自廣州康龍生物科技有限公司，超純水、三氟乙酸和甲醇用于配制流動相。主要儀器設(shè)備包括高效液相色譜儀（Agilent 1290，美國安捷倫科技有限公司）和光電二極管列陣檢測器（DAD-3000，上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣方法 試驗材料于2020年4月15日—7月3日采集。香蕉蕉果斷蕾后，每隔15 d進行一次取樣，共采集5個時期的樣品，分別為斷蕾后15、30、45、60和75 d。其中，斷蕾后75 d取樣時間根據(jù)不同品種香蕉果實發(fā)育情況進行調(diào)整，以果實成熟度達八成熟為標準。巴西香蕉和粉雜1號粉蕉斷蕾后75 d采收時間分別為蕉果斷蕾后的75和78 d，果指飽滿度約為八成（巴西香蕉果實直徑為3.37 cm或圍長100 mm、粉雜1號粉蕉直徑為3.93 cm或圍長為130 mm）（黎源，2014）。由于東莞大蕉采收標準未見報道，因此參照巴西香蕉和粉雜1號粉蕉采收時間與方法自行確立，經(jīng)5次采樣統(tǒng)計分析得出（自上而下取第二把蕉果中間位置，左右排開連續(xù)取7根果指進行測量統(tǒng)計），果實飽滿度為八成熟時，直徑為3.96 cm或圍長為138 mm。選擇樹體健壯、生長正常的果樹取果，選取每條蕉的第二把作為試驗樣品，同時采摘3株植株上面的果實，作為3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 樣品制備 用自來水沖洗果實，以清除碎屑或其他雜質(zhì)。去除果尖和果柄，切取果指中間部分，沸水中靜置10 s，使多酚氧化酶失活（Jiménez and García-Carmona，1999）。剝皮，皮肉分離，切片后立即液氮速凍，存放于-80 ℃冰箱中備用。將待測果皮和果肉放入冷凍干燥機去除水分，得到的干燥樣品用研磨機研磨成粉；分別取1 g香蕉果肉或果皮凍干粉，加入20%甲醇5 mL和0.1%三氟乙酸水溶液5 mL，用渦旋儀振蕩15 s，重復(fù)3次，放入4 ℃冰箱冷藏過夜；3000 r/min離心30 min，取3 mL上清液氮吹濃縮至1 mL，12000 r/min離心5 min，0.22 μm濾膜過濾，置于上樣瓶，同一品種重復(fù)提取3次，放入4 ℃冰箱待上樣檢測。

1.2.3 標準品溶液制備 精密稱取NE、DA、L-do‐pa、TYRA、Tyr、SERO、TRM和Trp標準品各5 mg，加入20%甲醇水溶液5 mL，振蕩搖勻至完全溶解，制成1 mg/mL的標準溶液。0.22 μm濾膜過濾，置于棕色瓶，放入4 ℃冰箱待上樣檢測。

1.2.4 反向高效液相色譜—紫外檢測（RP-HPLCUV）條件 所用色譜柱為C色譜柱（Eclipse Plus 95? Ccolumn，4.6×250 mm，5 μm，Agilent）。甲醇為流動相A，0.1%三氟乙酸水溶液為流動相B，pH 3.1。使用梯度剖面對待分離化合物進行洗脫分離：0~14 min，線性梯度5%~30% A，95%~70% B，柱溫28 ℃、流速1.0 mL/min。每個樣品的總運行時間為30 min，進樣量5 μL，洗脫條件如表1所示。所有樣品檢測均進行3個重復(fù)。

1.2.5 MAPs定量分析統(tǒng)計 香蕉樣品色譜圖中目標物質(zhì)峰峰面積，根據(jù)每個目標化合物的線性回歸方程計算樣品溶液濃度。

1.2.6 方法的適應(yīng)性驗證 驗證參數(shù)包括特異性、準確性、精確性、檢測限和定量限等。特異性：配制濃度為50.0 μg/mL的各標準化合物溶液，分別加入待測樣品中，和相同份數(shù)但未加標的樣品一起進行檢測分析，以確認每種峰的同一性，以此確定本檢測方法在香蕉樣品檢測中的特異性。準確性：用加標回收率驗證檢測方法的準確性，通過分析5個重復(fù)的加標樣品確定方法的準確度。精確性：日內(nèi)重復(fù)性和日間重復(fù)性檢驗方法的精確性，在1 d 3個時間段和在3 d內(nèi)對5個重復(fù)樣品進行檢測，分別計算相對標準偏差（RSD）。檢測限（LOD）：信噪比為3時的標準化合物樣品濃度，即峰高是基線噪聲3倍高度時的標準化合物樣品濃度為LOD。定量限（LOQ）=LOD×10/3。

1.3 統(tǒng)計分析

利用SISVAR（V1.2）對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和Tukey Test（<0.05）均值比較檢驗（Ferreira，2011），以Excel 2007制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉果實中MAPs檢測方法的建立

利用本研究建立的RP-HPLC-UV法，可以準確、快速地測定香蕉果肉和果皮中NE、DA、L-dopa、TYRA、Tyr、SERO、TRM 和Trp 等8 種MAPs 含 量。MAPs紫外吸收波長光譜（圖1）顯示，在210~350 nm波長范圍內(nèi)實現(xiàn)物質(zhì)峰校準，通過比較保留時間和最大吸收波長鑒定每個化合物物質(zhì)峰。TYRA和Tyr最大吸收波長為276 nm，SERO最大吸收波長為278 nm，TRM和Trp最大吸收波長為280 nm，NE、DA和L-dopa最大吸收波長為282 nm。從樣品色譜圖（圖2）可看出，8種MAPs均成功分離，基線平穩(wěn)無漂移，峰型對稱且良好，無重疊峰、駝峰、前沿和拖尾現(xiàn)象，保留時間穩(wěn)定。

香蕉果實8種MAPs定量檢測方法的適用性驗證參數(shù)如表2所示。校準曲線的線性判定系數(shù)均高于0.999000，表明濃度與信號面積之間存在高度相關(guān)性。因此，校準曲線的線性方程適用于香蕉中單胺類及其前體物質(zhì)的定量分析，線性范圍為1.0~16.0 μg/mL。方法的準確度通過加標樣品中分析物的回收率進行評估，范圍為95.3%~106.1%，說明該方法具有較高的準確性。日內(nèi)精密度范圍為0.37%~0.82%，日間精密度范圍為0.35%~0.83%，表明該方法同時具有較高的精準性。檢測限為0.0012~0.0016 mg/100 g，定量限為0.0040~0.0053 mg/100 g，顯示該方法具有很好的靈敏度。8種定量檢測的MAPs在色譜柱中被完全分離開，且峰型良好，無重疊峰，色譜圖基線平穩(wěn)無起伏，待檢測物質(zhì)在14 min內(nèi)全部完成分離。

2.2 NE和DA含量的變化

香蕉果實發(fā)育過程中，巴西香蕉中NE含量先升后降，果肉和果皮中含量均在斷蕾后30 d達峰值，而東莞大蕉和粉雜1號果實中NE含量隨果實發(fā)育變化不明顯（圖3-A和圖3-C）。3個品種果皮中，巴西香蕉的NE含量最高（35.52~62.18 mg/100 g），東莞大蕉次之（5.82~9.29 mg/100 g），粉雜1號最少（1.33~2.05 mg/100 g）；3個品種果肉中也呈現(xiàn)類似規(guī)律，巴西香蕉的NE含量為3.17~22.14 mg/100 g，東莞大蕉為1.27~2.07 mg/100 g，粉雜1號為0.91~1.33 mg/100 g。3個品種果皮中NE含量均高于果肉。

DA與NE的含量變化趨勢基本一致。巴西香蕉中DA含量呈先升后降的變化趨勢，果肉和果皮中均在斷蕾后30 d達峰值，含量分別為239.81和1906.54 mg/100 g，斷蕾后75 d達最低值（7.08和793.44 mg/100 g），東莞大蕉果肉中DA含量隨果實發(fā)育逐漸降低（4.80~23.67 mg/100 g），而粉雜1號果肉中DA含量隨果實發(fā)育變化不明顯（4.47~6.07 mg/100 g）（圖3-B和圖3-D）。3個品種果皮中DA含量均高于果肉，且與NE變化規(guī)律類似，巴西香蕉果皮中DA含量最高（793.44~1906.54 mg/100 g），東莞大蕉次之（378.92~631.63 mg/100 g），粉雜1號最低（103.52~167.81 mg/100 g）。

2.3 L-dopa和SERO含量的變化

在果實發(fā)育過程中，巴西香蕉果肉中L-dopa含量先升后降，在斷蕾后30 d達峰值（4.02 mg/100 g），而果皮中L-dopa含量整體呈上升趨勢（圖4-A和圖4-C）。東莞大蕉果肉和果皮中L-dopa含量變化規(guī)律基本一致，呈先降后升的變化趨勢。粉雜1號果肉中L-dopa含量呈下降趨勢，果皮中含量呈逐漸上升趨勢。3個品種果皮中L-dopa含量均高于果肉。粉雜1號果皮中L-dopa含量（2.08~3.29 mg/100 g）則低于巴西香蕉（2.91~7.35 mg/100 g）和東莞大蕉（4.95~7.81 mg/100 g）。

在果實發(fā)育過程中，巴西香蕉果肉中SERO含量先升后降，在斷蕾后30 d達峰值（26.95 mg/100 g），果皮中含量則呈緩慢上升趨勢。東莞大蕉果肉中SERO含量隨著果實的發(fā)育不斷降低，果皮中含量呈先升后降的變化趨勢，在斷蕾后60 d達峰值（73.31 mg/100 g）。粉雜1號果肉中SERO含量呈下降趨勢，果皮中的含量與巴西香蕉果皮中變化趨勢基本一致。東莞大蕉和粉雜1號果皮中SERO含量明顯高于果肉（圖4-B和圖4-D）。

2.4 Tyr和TYRA含量的變化

由圖5可知，Tyr和TYRA含量在3個品種的果肉和果皮中均呈現(xiàn)出類似的變化規(guī)律。果肉中，巴西香蕉的Tyr和TYRA含量隨著果實發(fā)育急劇升高，在斷蕾后30 d達峰值（43.74和118.29 mg/100 g），之后迅速降低，Tyr含量在斷蕾后45 d達最低值（1.14 mg/100 g），TYRA含量在斷蕾后75 d達最低值（12.58 mg/100 g）；東莞大蕉和粉雜1號中的含量則變化不明顯（圖5-A和圖5-B）。果皮中，3個品種Tyr和TYRA含量整體呈下降趨勢，東莞大蕉果皮中Tyr含量高于巴西香蕉和粉雜1號；TYRA含量則在巴西香蕉中最高（128.41~374.94 mg/100 g），東莞大蕉次之（19.28~110.33 mg/100 g），粉雜1號最低（4.82~9.59 mg/100 g）（圖5-C和圖5-D）。

2.5 Trp和TRM含量的變化

由圖6-A和圖6-B可知，Trp和TRM含量在3個香蕉品種的果肉中表現(xiàn)出類似的變化趨勢，巴西香蕉果肉中Trp和TRM含量均在斷蕾后30 d達最高值（46.41和5.33 mg/100 g），而后急劇降低，Trp含量在斷蕾后45 d達最低值（0.90 mg/100 g），TRM含量在斷蕾后75 d達最低值（1.04 mg/100 g）；東莞大蕉和粉雜1號果肉中的Trp和TRM含量隨果實發(fā)育變化不明顯。巴西香蕉和東莞大蕉果皮中Trp含量在果實發(fā)育過程中無明顯變化，粉雜1號果皮中則有先升后降的變化過程；3個品種中，東莞大蕉果皮Trp含量最高，其次是粉雜1號，巴西香蕉最少（圖6-C）。3個品種果皮中，TRM含量隨果實發(fā)育整體變化不明顯，粉雜1號的含量明顯低于巴西香蕉和東莞大蕉（圖6-D）。

3 討論

MAPs的檢測方法主要包括薄層色譜法（TLC）、放射免疫分析法（RIA）、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzymelinked immunosorbent assay）和高效液相色譜法（HPLC）。其中，HPLC檢測準確度高、靈敏度高、分析成本相對較低、操作簡便，配合不同類型檢測器，能進行多種類MAPs的檢測，包括DA、NE和L-dopa等化合物和其他多胺類物質(zhì)（Islam et al.，2016）。近年來，有研究利用微芯片電泳紫外熒光技術(shù)檢測香蕉中的DA、SERO、Trp和Tyr等天然化合物含量（Ohla et al.，2011），但其檢測成本高，不利于大量檢測。液相或氣相色譜連接不同檢測器進行定性定量分析仍是目前測定植物中MAPs的最常用方法。HPLC-UV相較高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（HPLCMS）一次檢測物質(zhì)種類較少，但價格便宜，產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價值更大。本研究利用RP-HPLC-UV建立了香蕉中NE、DA、L-dopa、TYRA、Tyr、SERO、TRM和Trp等代謝物的檢測體系，可以準確、快速地測定不同香蕉組織中8種MAPs含量，且操作方便，成本較低。

González-Montelongo等（2010）研究香蕉果皮抗氧化成分的最佳提取條件時發(fā)現(xiàn)，甲醇水溶液更有利于提取香蕉果實中的DA，而100%異丙醇更有利于提取L-dopa。本研究采用20%甲醇和0.1%三氟乙酸水溶液對香蕉果實MAPs物質(zhì)進行提取，結(jié)果表明，8種化合物可以被提取出來。其中，果皮樣品中檢測到DA含量最高達1906.54 mg/100 g，遠高于Kanazawa和Sakakibara（2000）檢測到的最高值1290 mg/100 g，表明本研究的提取條件非常適用于香蕉果實中DA的定量檢測。但本研究中檢測到的TYRA、TRM和L-dopa等含量較低，說明上述物質(zhì)可能更適合利用HPLC-MS等精密度更高的檢測技術(shù)進行測定分析。因此，本研究所用提取條件更有利于香蕉果實中DA的提取，而其他種類MAPs的最佳提取條件需進一步摸索。

目前，國內(nèi)外對香蕉等水果中MAPs含量的檢測分析有一些研究，但尚未見香蕉果實發(fā)育過程中MAPs含量檢測的相關(guān)報道。Kanazawa和Ashida（1998a，1998b）研究發(fā)現(xiàn)，香蕉皮中含有強抗氧化活性化合物DA，其抗氧化活性與維生素C相當，認為DA能幫助增強人體消化道清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的能力。本研究結(jié)果表明，3個香蕉品種果肉中均含有DA，但其含量明顯低于果皮，與前人研究結(jié)果（Borges et al.，2019）基本一致。Borges等（2019）推薦消費者食用帶皮水煮后的香蕉果肉，因水煮后的香蕉皮中DA會轉(zhuǎn)移到果肉中，使果肉中DA和SERO含量均有所上升。除了DA外，本研究的3個香蕉品種果皮中NE、L-dopa、SERO和TYRA含量也明顯高于果肉；DA、NE、L-dopa和TYRA均位于香蕉果實多巴胺代謝通路上，L-dopa和TYRA是合成DA和NE的前體物質(zhì)，上述結(jié)果表明在香蕉果皮中可能存在著更為活躍的多巴胺合成代謝過程。Kanazawa和Sakakibara（2000）研究發(fā)現(xiàn)卡文迪許香蕉果皮中DA含量為865~1290 mg/100 g，本研究結(jié)果與其基本一致，但果肉中DA含量為0.72~10 mg/100 g，遠低于本研究結(jié)果（7.08~239.81 mg/100 g）。Borges等（2019）檢測了20個不同香蕉品種果實中DA含量的變化情況，其中鮮食蕉DA含量最高的品種為Yangambi Km5，其果肉中DA含量為26.5~38.1 mg/100 g，果皮中DA含量最高的鮮食蕉為Ouroda Mata，含量為76.4~305.5 mg/100 g，均低于本研究結(jié)果。造成研究結(jié)果差異的原因，一方面是因為品種、檢測方法和種植區(qū)域不同，另外一個主要原因可能是研究對象所處的發(fā)育時期不同。本研究結(jié)果表明，巴西香蕉的DA含量隨著果實發(fā)育有快速升高的過程，峰值出現(xiàn)在斷蕾后30 d前后（果肉239.81 mg/100 g 、果皮1906.54 mg/100 g），之后果實中DA含量持續(xù)下降，果實成熟時達到最低值（果肉7.08 mg/100 g、果皮793.44 mg/100 g）。Borges等（2019）、Kanazawa和Sakakibara（2000）的研究材料均在香蕉果實成熟時采集，可能是造成其研究結(jié)果明顯低于本研究結(jié)果的主要原因。

不同香蕉品種MAPs的含量有明顯差異。斷蕾后15~30 d，巴西香蕉果肉中NE、DA、TYRA、Tyr、TRM和Trp含量均快速上升，L-dopa和SERO含量也有緩慢上升的趨勢，之后，上述物質(zhì)含量呈下降趨勢。在巴西香蕉果實整個發(fā)育過程中，MAPs含量變化極大，含量相差2倍（TRM）~50倍（Trp）不等。東莞大蕉果肉中僅有SERO含量明顯降低，DA含量緩慢下降，NE、L-dopa、Tyr、TYRA和TRM含量的變化不明顯。粉雜1號MAPs含量相對較少，且在整個果實發(fā)育過程中大部分MAPs含量變化不明顯。查詢KEGG數(shù)據(jù)庫（https://www.kegg.jp/）表明，上述8種MAPs均為Tyr和Trp代謝通路上的化合物，其含量變化與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成及代謝通路（Mus00400）緊密有關(guān)。因此，推測在巴西香蕉果實發(fā)育成熟過程中，可能在斷蕾后30 d之前的某個時間段，某些或某個調(diào)控果實MAPs合成代謝的基因表達水平發(fā)生顯著改變，從而導(dǎo)致Mus00400代謝通路上包括MAPs在內(nèi)的化合物含量發(fā)生變化，而東莞大蕉和粉雜1號中不存在上述基因表達水平顯著改變的過程；品種間產(chǎn)生上述差異的原因可能與品種的基因型有直接關(guān)系，巴西香蕉基因型為AAA，而粉雜1號粉蕉和東莞大蕉基因型均為ABB。因此，后續(xù)可根據(jù)上述特點，研究香蕉果實斷蕾30 d前后與MAPs合成和代謝相關(guān)基因的表達情況，為下一步解析香蕉果實MAPs代謝調(diào)控機制打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用RP-HPLC-UV建立了一種測定香蕉果實中MAPs含量的方法，可以準確、靈敏、快速地測定香蕉果肉和果皮中NE、DA、L-dopa、TYRA、Tyr、SERO、TRM和Trp等8種MAPs物質(zhì)的含量。通過對3個香蕉品種不同發(fā)育階段的果實MAPs含量進行測定，發(fā)現(xiàn)巴西香蕉果實發(fā)育過程中MAPs含量變化明顯區(qū)別于東莞大蕉和粉雜1號粉蕉。本研究結(jié)果可為下一步利用基因組數(shù)據(jù)篩選不同基因型的差異表達基因，并進一步闡明MAPs的合成代謝機理提供參考。