引起云南省珠芽魔芋葉斑病的鏈格孢菌種類鑒定

王啟宇, 楊 敏, 魏環(huán)宇, 吳治興, 趙婭紅, 呂怡穎, 盧 超,劉佳妮, 柯艷果, 余 磊*, 黃飛燕*

(1. 昆明學院農(nóng)學院, 云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術研究中心, 昆明 650214;2. 云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 昆明 650201)

魔芋是天南星科Araceae 魔芋屬Amorphophallus多年生草本植物[1],是目前已知植物中唯一能大量提取葡甘聚糖(KGM)的植物[2-4]。KGM作為一種優(yōu)質(zhì)可溶性膳食纖維,具有極佳的成膜性,黏彈性及高效吸附性等特性[5-6]。因此,魔芋在醫(yī)藥、保健及石油化工等領域具有極大的開發(fā)應用前景[7-9]。珠芽魔芋Amorphophallusbulbifer是近幾年西南地區(qū)主推的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。相比于傳統(tǒng)魔芋,珠芽魔芋不僅可以用地下部塊莖和實生種子繁殖,也可以通過葉柄分叉處著生的氣生珠芽繁殖,這一特性使其在繁殖系數(shù)、產(chǎn)量質(zhì)量、經(jīng)濟效益等方面更具推廣價值[10-12]。目前,云南珠芽魔芋種植面積已超過574 hm2,每年每公頃產(chǎn) 0.2～0.4 t。隨著珠芽魔芋推廣種植面積的不斷擴大,自然環(huán)境的變化及致病菌持續(xù)積累,病害對珠芽魔芋推廣及產(chǎn)業(yè)發(fā)展所造成的影響日漸嚴重。

現(xiàn)階段關于珠芽魔芋病害的研究較少。Yu等報道珠芽魔芋貯藏期病害主要由茄病鐮孢Fusariumsolani、尖鐮孢F.oxysporum及灰霉菌Botrytiscinerea侵染而發(fā)生,人工接種發(fā)病率分別為100%、83%及95%,并針對不同病原菌開展了相應的藥劑防治研究[13]。Yang等研究發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides侵染會引起珠芽魔芋葉斑病[14]。魏環(huán)宇等報道軟腐果膠桿菌Pectobacteriumaroidearum是引起珠芽魔芋軟腐病的致病菌[10]。吳旭等對不同品種珠芽魔芋細菌性軟腐病抗性做了系統(tǒng)的比較和鑒定[15]。

珠芽魔芋葉斑病田間主要危害葉片,病斑多數(shù)沿著葉尖、葉緣或葉脈發(fā)生,發(fā)病初期在葉片上形成淺褐色小斑點,斑點中間多透明或灰色;至發(fā)病中期常形成穿孔,病斑周圍亦有黃色暈圈;發(fā)病后期病斑擴大形成不規(guī)則大斑塊,葉片邊緣黑褐色并壞死,在病斑黑褐色部位常明顯著生有黑色小顆粒,發(fā)病嚴重時整個葉片布滿斑痕,枯死并脫落,新發(fā)及成熟葉片均可發(fā)病,傳染性強。本文對引起該病害的致病菌進行了形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定,以期為田間防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害癥狀觀察和病原菌分離

于云南省西雙版納傣族自治州、德宏傣族景頗族自治州珠芽魔芋種植區(qū)采集典型病樣,采用常規(guī)組織分離法分離,將分離得到的菌株轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基進行純化和形態(tài)觀察。

1.2 致病性測定

選用健康無病,無傷痕的魔芋葉片,用75%乙醇多次擦拭表面后再用無菌水反復沖洗,選取代表性菌株BNYB03配制濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液；針刺法于葉片創(chuàng)傷處滴0.5 mL孢子懸浮液;懸滴法將1 mL 孢子懸浮液直接滴于健康葉片,對照滴等量無菌水。每株接種2片健康葉片,每處理3次重復,每次重復3株,每24 h觀察1次,發(fā)病后從發(fā)病組織再次分離,并觀察是否和接種菌相同,接種后15 d計算發(fā)病率。

1.3 病原菌形態(tài)學觀察

肉眼觀察在PDA培養(yǎng)基上純培養(yǎng)的菌落形態(tài)。挑取菌落上的分生孢子,在光學顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)并測量分生孢子的大小,參照文獻[16-20] 確定病原菌的種類。

1.4 病原菌的分子生物學鑒定

取純培養(yǎng)的病原菌,刮取培養(yǎng)基表層菌絲,于液氮中快速研磨,利用真菌通用引物[21]和特異引物[22]對該病原菌的 rDNA-ITS、EF-1α和β-tubulin基因進行了 PCR 擴增 (引物見表1),PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測后,送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序,利用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行多重比較，測序結(jié)果登錄NCBI (https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast),利用 BLAST 進行同源性比對;使用 MEGA 7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 病原菌的 rDNA-ITS、EF-1α和β-tubulin基因的PCR擴增引物Table 1 PCR primers for amplifying rDNA-ITS, EF-1α and β-tubulin genes of the pathogen

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀

該病主要危害葉片,且成熟葉和新葉均可見發(fā)病。病斑多數(shù)沿葉緣或葉脈發(fā)生,發(fā)病初期,出現(xiàn)圓形黃色斑點,約2～3 mm,周圍多有黃色暈圈;隨著病情發(fā)展,逐漸形成大塊棕色病斑或融合形成不規(guī)則大斑塊,并持續(xù)向兩側(cè)葉緣及葉片中央侵染,最終危害整株葉片 (圖1)。若陽光灼傷葉片后,連續(xù)陰雨天氣易加劇該病害蔓延。

圖1 珠芽魔芋葉斑病田間典型癥狀Fig.1 Typical symptoms of Amorphophallus bulbifer leaf spot disease in the field

2.2 病原菌的分離及致病性測定

針刺法接種在接種后 3 d 開始發(fā)病,接種后15 d發(fā)病率為100%,葉面病斑初為圓形或橢圓形黃色小斑點,后期病斑逐漸擴大,且中央顏色逐漸變?yōu)辄S褐色,病斑周圍帶有明顯黃色暈圈 (圖2a)。懸滴法接種在接種后 5 d可見圓形或橢圓形黃色斑點,后期癥狀與針刺法相同 (圖2b),接種葉片均發(fā)病。對照葉片未見發(fā)病 (圖2c)。取發(fā)病葉片再次分離可得到接種菌株。對照葉片未分離出接種菌。根據(jù)柯赫氏法則,證明接種菌株BNYB03為該葉斑病的致病菌。

圖2 人工接種珠芽魔芋葉斑病病原引起的癥狀(接種后15 d)Fig.2 Symptoms caused by the pathogen of the leaf spot of Amorphophallus bulbifer at day 15 after inoculation

2.3 珠芽魔芋葉斑病菌的形態(tài)特征

經(jīng)柯赫氏法則確定的病原菌,菌落在 PDA 培養(yǎng)基上呈灰青色,毛氈狀 (圖3a)。于主菌絲上生成淡褐色或暗褐色的分生孢子梗,大小為(19.3～37.9)μm×(1.7～3.2)μm, 有隔膜(圖3b)。分生孢子黃褐色,大小為(19.7～31.9)μm×(7.4～12.5)μm,多數(shù)為倒棒形,少數(shù)為卵形或近橢圓形,具2～6個橫隔膜,1～5個縱 (斜) 隔膜,隔膜處縊縮(圖3c)。在 PCA 培養(yǎng)基上,7 d 內(nèi)可以形成超過10個孢子連成的無分支孢子鏈 (圖3d)。依據(jù)菌株的形態(tài)特征,參照文獻[16-20]關于鏈格孢種的形態(tài)描述,初步鑒定該病原菌為細極鏈格孢Alternariatenuissima(Fr.) Wiltshire。

圖3 珠芽魔芋葉斑病菌的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of pathogen causing the leaf spot of Amorphophallus bulbifer

2.4 病原菌的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

針對該病原菌的rDNA-ITS、EF-1α和β-tubulin基因序列進行了PCR擴增,分別獲得長度為550 bp、280 bp和542 bp的片段。將測序結(jié)果登錄NCBI(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行BLAST比對,結(jié)果表明,該病原菌與A.tenuissima的相似性為99%～100%。

基于rDNA-ITS,EF-1α和β-tubulin基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4～圖6)。結(jié)果顯示,BNYB03的rDNA-ITS基因與已登錄的A.tenuissima(登錄號:MG975633) 相似性較高;BNYB03的EF-1α基因和β-tubulin基因分別與已登錄的A.tenuissima(登錄號:LC136865)和A.tenuissima(登錄號:JQ811941)的相似性達到100%。結(jié)合形態(tài)特征,最終鑒定細極鏈格孢A.tenuissima(Fr.) Wiltshire是引起珠芽魔芋葉斑病的病原菌。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的代表菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS sequences of representative isolates

圖5 基于EF-1α 序列構(gòu)建的代表菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on EF-1α sequences of representative isolates

圖6 基于β-tubulin序列構(gòu)建的代表菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on β-tubulin sequences of representative isolates

3 結(jié)論與討論

本文從西雙版納、德宏州等珠芽魔芋種植區(qū)采集葉斑病典型病樣,將病原菌分離并接種于健康珠芽魔芋,發(fā)病癥狀與田間癥狀一致,接種病株亦可同樣分離得到此病原菌,完成柯赫氏法則驗證。對病原菌的形態(tài)學鑒定發(fā)現(xiàn)本研究菌株孢子的橫隔數(shù)為2～6個,可形成超過10個孢子連成的無分支孢子鏈態(tài),結(jié)合文獻[16-20]對鏈格孢屬菌的描述對比分析,發(fā)現(xiàn)本研究菌株形態(tài)特征同細極鏈格孢A.tenuissima極為相似,結(jié)合病原菌rDNA-ITS,EF-1α和β-tubulin基因序列分析結(jié)果,最終明確引起珠芽魔芋葉斑病的病原菌為細極鏈格孢A.tenuissima(Kunze) Wiltshire。

目前,國內(nèi)外有較多關于鏈格孢屬真菌侵染而引起植物葉斑病的研究報道。王彩霞等研究發(fā)現(xiàn)葡萄葉斑病病原菌為鏈格孢Alternariaalternata,葡萄鏈格孢A.viniferae和喬木鏈格孢A.arborescens,且3種病原菌單獨侵染或復合侵染均能引起葡萄葉斑病[23],而劉梅等研究發(fā)現(xiàn)平頭炭疽菌Colletotrichumtruncatum也是引起葡萄葉斑病的致病菌[24]。此外,細極鏈格孢A.tenuissima侵染還會引起蠶豆[25]、甜葉菊[26]等多種植物葉斑病。Yang等研究發(fā)現(xiàn),膠孢炭疽菌C.gloeosporioides是引起珠芽魔芋葉斑病的病原菌[14],而細極鏈格孢侵染所引起的珠芽魔芋葉斑病在國內(nèi)尚屬首次報道。

本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn),珠芽魔芋葉斑病田間發(fā)病率一般為7%～15%,每年9月 - 11月是珠芽魔芋葉斑病發(fā)病高峰期,重癥區(qū)域損失可達25%以上,表明鏈格孢屬真菌生長和繁殖受溫度、濕度的密切影響,夏季與早秋適宜的環(huán)境溫度加劇了鏈格孢屬病原菌的侵染和病害發(fā)生。因此,應在病害高發(fā)時期加強農(nóng)業(yè)防治,調(diào)整和改善作物生長環(huán)境,創(chuàng)造不利于病原物生長發(fā)育的生態(tài)位,控制傳播途徑,削弱侵染活力,預防病害大規(guī)模暴發(fā)。后續(xù)還需要對珠芽魔芋葉斑病病原菌種類和優(yōu)勢種群做系統(tǒng)調(diào)查,明確該病害發(fā)生與流行規(guī)律,為珠芽魔芋葉斑病防治技術研究奠定基礎。