《中國藥典》2020年版蛋黃卵磷脂細菌內(nèi)毒素檢測

裴宇盛，趙小燕，陳 晨，高 華，蔡 彤

(中國食品藥品檢定研究院化學藥品檢定所藥理室，北京 102629)

蛋黃卵磷脂是從蛋黃中提取精制而得的天然磷脂混合物，是一端親水另一端疏水的兩親分子，為天然的表面活性劑[1]。因此，在脂肪乳、脂質(zhì)體等特殊注射劑得到廣泛的使用[2]。細菌內(nèi)毒素是細菌死后或者自溶后留下的位置，仍然具有致熱性，其主要成分是類脂A核心多糖和特異性多糖[3]。蛋黃卵磷脂作為注射用輔料，設立了細菌內(nèi)毒素檢查項目，并且蛋黃卵磷脂(供注射用)是《中國藥典》2020年版四部收載品種。目前藥典中的方法為“取本品，以無水乙醇充分溶解，進一步使用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至實驗所需濃度(該溶液中乙醇濃度應大于20%)，依法檢查(通則1143)，每1 g中含內(nèi)毒素的量應小于2.0 EU”[4]。

藥用輔料性質(zhì)較特殊，該品種的內(nèi)毒素檢查在實際應用過程中產(chǎn)生了一些問題。根據(jù)國家藥典委員會征求意見的反饋，經(jīng)歸納主要存在以下問題：①部分企業(yè)按藥典規(guī)定的原方法回收率不能在50%～200%之間，不能排除蛋黃卵磷脂對內(nèi)毒素檢測的干擾；②由于蛋黃卵磷脂天然表面活性劑的性質(zhì)加上內(nèi)毒素本身容易被吸附的問題，對于該輔料是選擇凝膠法還是定量法作為常用的檢測方法存在不同意見(目前許多藥物或輔料的細菌內(nèi)毒素檢查項目中選擇凝膠法作為常用的方法[5])；③該輔料是用檢查用水溶解還是無水乙醇溶解存在不同意見。

為了準確檢測蛋黃卵磷脂的質(zhì)量，保障相關制劑的臨床使用安全，本研究旨在建立新的蛋黃卵磷脂的內(nèi)毒素檢測方法，為藥典修行提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑Elx808型酶標儀(美國BioTek公司)；S-0520型細菌內(nèi)毒素檢查法檢測反應板(湛江安度斯生物有限公司)；AE240型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)；MultiReax全能型振蕩器(德國Heidolph公司)；15 mL無熱原離心管(美國CORNING公司)。

無水乙醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；吐溫80(化學純，國藥集團化學試劑有限公司)；細菌內(nèi)毒素國家標準品(批號：150800-201601，中國食品藥品檢定研究院)；檢查用水(批號：2103110，湛江安度斯生物有限公司)；動態(tài)濁度法鱟試劑(批號：2009042，湛江安度斯生物有限公司)，動態(tài)濁度法鱟試劑(批號：J1382L，美國CHARLES RIVER公司)；蛋黃卵磷脂(批號：19110807、19110407、19110607，南京綠葉制藥有限公司)，蛋黃卵磷脂(批號：11NF9332、11NH1661，費森尤斯卡比華瑞制藥有限公司)，蛋黃卵磷脂(批號：A40210203、A40210204，A40210205，廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1標準曲線的可靠性驗證 取細菌內(nèi)毒素國家標準品1支，按要求用1 mL細菌內(nèi)毒素檢查用水復溶，在振蕩器上振蕩15 min混勻，用檢查用水稀釋到標準曲線所需要的濃度，即：104、103、100、10 EU·L-1的標準細菌內(nèi)毒素稀釋液，每步稀釋都應在振蕩器上混勻30 s。每一濃度平行2孔，同時BET水作為陰性對照平行2孔。研究使用兩個廠家的鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司及美國CHARLES RIVER 公司)。按要求復溶所需的鱟試劑，取標準曲線所需標準細菌內(nèi)毒素稀釋液，陰性對照每孔0.1 mL加入檢測板，隨后每孔加入0.1 mL鱟試劑，上機檢測。當陰性對照的反應時間大于標準曲線最低點時，所有試驗結果進行雙對數(shù)轉換，轉換后進行線性擬合。擬合方程為LgT=a·lgC+b，線性擬合的相關系數(shù)|r|≥0.980時，標準曲線的可靠性符合規(guī)定。

1.2.2干擾試驗 最大稀釋倍數(shù)(MVD)計算 根據(jù)MVD=c L·λ-1，按標準曲線可靠性驗證項下制備標準曲線，λ為10 EU·L-1；L為供試品的內(nèi)毒素限值，根據(jù)藥典規(guī)定，蛋黃卵磷脂的內(nèi)毒素限值為2.0 EU·g-1；c為供試品溶液的濃度，本研究蛋黃卵磷脂濃度為0.1 kg·L-1。即：MVD=(2.0 EU·g-1×0.1 kg·L-1)÷10 EU·L-1=20倍。

供試品原液的制備 蛋黃卵磷脂不溶于水，因此使用助溶劑作為溶劑制備其溶液。制備助溶劑的方法為2.5 g吐溫80：2.7 mL無水乙醇。制備的蛋黃卵磷脂溶液，需用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋后再進行內(nèi)毒素檢測。但在用水稀釋的過程中，如果蛋黃卵磷脂濃度較高，蛋黃卵磷脂會從溶液中析出，出現(xiàn)渾濁或沉淀，干擾試驗結果。經(jīng)實驗摸索，需配制適量蛋黃卵磷脂供試品溶液濃度為0.1 kg·L-1，進行后續(xù)實驗。

供試品溶液與供試品陽性對照(positive product control, PPC)的制備 取0.1 kg·L-1的供試品原液1 mL加入試管中，加入檢查用水10 μL(供試品陽性對照加入5×105EU·L-1的內(nèi)毒素標準溶液10 μL)，在振蕩器充分混合(4 min)，混合后取0.1 mL加入到已含0.9 mL檢查用水的試管中，在振蕩器充分混合(4 min)，混合后取0.5 mL加入到已含0.5 mLBET水的試管中，在振蕩器充分混合(2 min)，此時即為稀釋20倍的供試品溶液，PPC中添加標準內(nèi)毒素的濃度為250 EU·L-1。

按照藥典規(guī)定方法進行檢測，見Tab 2、3。

2 結果

2.1 標準曲線的可靠性驗證結果使用兩個廠家的鱟試劑(TAL)，|r|> 0.980，見Tab 1。

Tab 1 Results of assurance of criteria for standard curve

2.2 干擾試驗及檢查法結果3個蛋黃卵磷脂廠家的8批樣品的回收率均符合藥典中規(guī)定的50%～200%，見Tab 2、3。

Tab 2 Results of interference test and KCA assay(Zhanjiang A&C)

Tab 3 Results of interference test and KCA assay (CHARLES RIVER)

3 討論

3.1 研究結論使用上述方法，采用兩個來源的鱟試劑，3個蛋黃卵磷脂廠家的8批樣品，回收率均符合藥典中規(guī)定的50%～200%，符合干擾試驗要求，解決了目前的內(nèi)毒素檢查法在實際應用中的問題。建立了具有較好耐用度的蛋黃卵磷脂細菌內(nèi)毒素檢查方法，為藥典修訂提供了依據(jù)。

3.2 方法的耐用度對該研究方法進行了方法的耐用度檢驗。除了“2”項下所呈現(xiàn)的結果，對蛋黃卵磷脂濃度調(diào)整為0.02 kg·L-1、PPC中添加標準內(nèi)毒素的濃度調(diào)整為100 EU·L-1、對應標準曲線采用103～1 EU·L-1檢測范圍的試驗條件下，采用上文所描述的兩個鱟試劑廠家的鱟試劑檢測，均能夠得到回收率通過的結果，且樣品符合規(guī)定。

3.3 蛋黃卵磷脂的干擾原因經(jīng)過大量前期研究，蛋黃卵磷脂干擾內(nèi)毒素檢測的主要原因有3個，一是蛋黃卵磷脂本身因表面活性作用，作為極易形成包裹內(nèi)毒素的結構對內(nèi)毒素檢測造成干擾；二是卵磷脂本身溶解度較低，無論是直接用水溶解產(chǎn)生渾濁，還是在乙醇溶解之后使用檢查用水稀釋過程中出現(xiàn)析出，都會而影響檢測；三是乙醇本身對檢測具有干擾作用，當濃度低于5%時干擾作用可被消除[6]。

3.4 采用乙醇溶解的依據(jù)研究表明由于蛋黃卵磷脂在水中溶解度極低，使用檢查用水分散蛋黃卵磷脂，出現(xiàn)明顯的渾濁現(xiàn)象，不能得到均一的溶液。細菌內(nèi)毒素體積極小，一般認為在1～5 nm3[7]。肉眼可見的顆粒會將內(nèi)毒素包裹起來，在檢測過程中不能檢測到顆粒內(nèi)部包裹的內(nèi)毒素。所以為了準確檢測蛋黃卵磷脂中的所有內(nèi)毒素，選擇使用無水乙醇溶解蛋黃卵磷脂。

3.5 采用動態(tài)濁度法進行檢測的依據(jù)渾濁對動態(tài)濁度法和動態(tài)顯色法均具有干擾作用[8-9]，凝膠法屬于終點檢測，過程中的渾濁對其無影響，從這方面來說，凝膠法相比其他方法具有明顯的優(yōu)勢。然而凝膠法的檢測限只能達到30 EU·L-1，相比動態(tài)濁度法10 EU·L-1來說，無法將蛋黃卵磷脂進一步稀釋，無法排除卵磷脂本身的干擾。經(jīng)過研究，將蛋黃卵磷脂檢測濃度降低更有利于干擾的排除，因此選擇了動態(tài)濁度法進行檢測。同時也進行試驗將蛋黃卵磷脂的限值提高至6.0 EU·g-1時，參考藥典規(guī)定及上述方法制備供試品溶液及供試品陽性對照溶液，得到的結果符合藥典規(guī)定凝膠法中樣品不干擾內(nèi)毒素檢測。但是，對于提高限值還需要進一步研究討論。

3.6 原方法的存在的其他問題《中國藥典(四部)》2020年版要求蛋黃卵磷脂以無水乙醇充分溶解，進一步使用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至實驗所需濃度(該溶液中乙醇濃度應<20%)。對于乙醇濃度的要求，是由于乙醇本身也會對檢測造成干擾，研究進行過程中也考察了30%的乙醇溶解蛋黃卵磷脂，觀察到不同廠家蛋黃卵磷脂的溶解度出現(xiàn)極大差異，這表明同為蛋黃卵磷脂物理性質(zhì)方面仍具有較大差異，在藥典執(zhí)行過程中，不同廠家干擾情況存在差距應由產(chǎn)品本身差異造成。提示應進行更多耐用度試驗。這與藥品的內(nèi)毒素檢測有較大差異。藥品的內(nèi)毒素檢測一般情況下不會出現(xiàn)不同廠家樣品干擾情況不同的情況。針對藥用輔料的內(nèi)毒素檢測方法的建立，應盡可能采用更多的樣品研究。

3.7 采用超濾離心法嘗試排除干擾利用蛋黃卵磷脂與細菌內(nèi)毒素的分子量差異大，濾過蛋黃卵磷脂，對截留內(nèi)毒素進行檢測。研究過程中摸索了超濾膜對于無水乙醇的化學相容性，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度<70%時不會影響在實驗過程中超濾膜的穩(wěn)定性。摸索乙醇濃度<70%時蛋黃卵磷脂的溶解性，蛋黃卵磷脂在70%乙醇中溶解度8 g·L-1。在3、10、20 ku截留不同分子量的超濾離心管中，篩選出截留分子量為10 ku的超濾離心管。PPC中添加標準內(nèi)毒素的濃度也進行了摸索，最終選擇1.0 EU·L-1。離心時轉速為5 000g，離心3次，每次離心15 min。經(jīng)過上述條件摸索，經(jīng)回收率驗證，可對蛋黃卵磷脂進行檢測，但該方法的重復性較差。

3.8 嘗試采用鱟試劑稀釋排除干擾使用上述及原方法等各種實驗方法得出的結果都顯示回收率低于50%的結果，推斷蛋黃卵磷脂由于其表面活性劑作用，形成了包裹內(nèi)毒素的結構，使內(nèi)毒素無法準確被檢測出來，為了排除該干擾，采用供試品稀釋過程中使用鱟試劑作為溶劑稀釋供試品，增加內(nèi)毒素與鱟試劑的接觸，在稀釋過程中和卵磷脂形成的包裹內(nèi)毒素的結構相互競爭。該方法經(jīng)過試驗驗證可得到回收率在50%～200%的檢測結果。并且具有較好的重復性。該方法主要存在的問題是，樣品和標準曲線采用了不同的反應體系，嘗試采用了稀釋過的鱟試劑以及降低回收率試驗中內(nèi)毒素添加濃度等方法，證明所采用的鱟試劑稀釋液對反應體系沒有影響。由于該方法不同于常規(guī)排除干擾的方法，驗證方法復雜，需要進一步研究確定。

3.9 嘗試采用ELISA法排除干擾嘗試利用ELISA法排除干擾的原理基于結合步驟不僅使用了結合緩沖液，同時也增加了在37 ℃恒溫下長時間(18 h)結合的優(yōu)勢，使內(nèi)毒素充分被檢測孔里的特異性蛋白結合，考慮應用此方法可使內(nèi)毒素被充分的檢測。根據(jù)ELISA使用說明，必須測試有機溶劑的化學相容性，經(jīng)過試驗驗證，在乙醇濃度低于30%時不會對檢測結果造成干擾。但由于蛋黃卵磷脂溶解度問題，無法獲得適宜濃度的蛋黃卵磷脂的30%乙醇溶液。需將限度值放寬約10倍才能進行試驗。因此該方法對蛋黃卵磷脂檢測還需摸索其他化學相容性好且對蛋黃卵磷脂肉溶解度高的有機溶劑。

3.10 嘗試采用萃取法排除干擾為了排除蛋黃卵磷脂對檢測的干擾，利用蛋黃卵磷脂易溶解于氯仿的特性，參照文獻[10]設計，采用將蛋黃卵磷脂溶解于氯仿后再用內(nèi)毒素檢查用水萃取其中內(nèi)毒素?？瞻自囼灢捎脙?nèi)毒素標準品通過二甲基溶解后，加入氯仿中，可以被內(nèi)毒素檢查用水成功萃取。然而，當?shù)包S卵磷脂加入后，形成了乳化現(xiàn)象，經(jīng)回收率驗證，該方法無法將內(nèi)毒素準確提取。如進一步研究需更換萃取的有機溶劑，或采取混合有機溶劑進行萃取研究。